방법 논문

CXC Chemokine 수용 체 4에 붙일 레이블 CXC Chemokine Ligand 12의 바인딩 중단 하는 화합물을 식별 하는 흐름 Cytometry 기반 시험

DOI:

10.3791/57271

⸱

2018년 3월 10일

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Virology and Chemotherapy, Department of Microbiology and Immunology, Rega Institute for Medical Research, KU Leuven

이 논문에서

요약

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한 흐름 cytometry 기반 셀룰러 바인딩 분석 결과 설명 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4)에 붙일 레이블된 CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)의 바인딩을 억제 하는 화합물을 식별 하는 검사 도구로 주로 사용 되는.

초록

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G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs)의 약리 타겟팅으로 많은 질병의 진행에 기여 장애 GPCR 중재 신호 인간의 건강에 매우 중요입니다. 수용 체의 ligand 쌍 CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) / CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4) 암 및 염증 성 질환의 치료에 대 한 잠재적인 대상으로 예를 들어 중요 한 임상 관심을 제기 하고있다. 특히 CXCR4 대상 및 수용 체의 기능을 억제 하는 치료 항 체로 서 작은 분자 약리학 유용한 도구 간주 됩니다 따라서. 여기, 흐름 cytometry 기반 셀룰러 분석 결과 CXCL12 바인딩을 CXCR4, 파기 화합물 (예를 들어, 작은 분자) 수 있도록 설명 되어 있습니다. 기본적으로, 분석 결과 붙일 레이블된 CXCL12, CXCR4, 자연 chemokine 주 작동 근의 고정 된 금액 및 레이블이 없는 화합물 사이의 바인딩 수용 체에 대 한 경쟁에 의존 합니다. 따라서, 방사성 레이블이 프로브를 사용 하 여 바람직하지이 분석 결과에 피 한다. 또한, 살아있는 세포 수용 체 (CXCR4) 세포 막 준비 대신의 원본으로 사용 됩니다. 처리량을 증가 플레이트 형식으로 분석 결과의 쉬운 적응 수 있습니다. 이 분석 결과 CXCR4 대상 화합물을 식별 하 귀중 한 제네릭 약물 발견 분석 결과 되도록 표시 되었습니다. 프로토콜 가능성이 적용할 수 있습니다 다른 GPCRs에 적어도 붙일 레이블된 ligands 사용할 수 있습니다 또는 생성 될 수 있습니다. 이러한 GPCRs의 활성화 유도 된 세포내 신호 통로 관한 사전 지식이 필요 하지 않습니다.

서론

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G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs)는 세포 표면 단백질 (예를 들면, 펩 티 드, 단백질 호르몬, 아민) extracellular ligands에 의해 활성화 될 수 있는, 많은 생리 적 그리고 발달을 조절 함으로써 처리1. 한 길 항 제는 GPCR 바인딩 주머니 차지 하 고, 수용 체 단백질에 유도 구조적 변화 Gα의 구성 된 세포내 수용 체 관련 된 heterotrimeric G 단백질의 바인딩을 촉진-GDP와 Gβγ 소 단위. Gα 소 단위 결과 G 단백질 소 단위 (Gα-GTP와 Gβγ)를 차례로 추가 시작 하류의 분리에 GDP에 대 한 GTP의 후속 교환 신호 경로2,3. Gα-GTP 분해 된다 때 다시 협회 Gα의 GDP와 Gβγ 소 단위 변환 G 단백질 다시는 휴식 상태3,4. G 단백질의 다른 종류 (Gs, Gi/o

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프로토콜

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1입니다. 세포 배양의 유지 보수

참고: 1과 2에 설명 된 모든 단계는 층 류 캐비닛에 무 균 조건 하에서 수행 됩니다.

  1. 37 ° C, 5% CO2 습도 인큐베이터 T75 문화 플라스 크에 세포 성장.
    참고:이 분석 결과에서 Jurkat 세포 (즉, 인간의 leukemic T 림프 구 세포 endogenously CXCR417익스프레스)는 사용 됩니다. 세포 표면에 CXCR4 표현의 cytometry에 의하여 세포 배양을 통해 평가 되어야 한다. 그러나 교류 cytometry 절차 및 셀 표면에 수용 체 식 수준 아니다,,이 프로토콜의 범위 내에서 하지만 되었습니다 확인 시 약의 설명 설명 이전17.
  2. 하자 Jurkat 세포 성장에 80-85%에 도달할 때까지 confluency. 소설 플라스 크에 세포를 뿌리고, 하기 전에 실내 온도 (RT)를 도달 하는 모든 시 약을 하실 수 있습니다.
  3. 소설 T75 문화 플라스 크를 신선한 완전 한 성장 매체 (RPMI-1640 매체, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 2mm 글루타민) 20 mL를 추가 합니다.
    4. ....

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결과

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바인딩 분석 결과의 일반적인 워크플로 그림 1A에 제공 됩니다. 다른 샘플 형식 (즉, 부정적인 컨트롤, 긍정적인 제어 및 실험 샘플) 표준 실험에 대 한 얻은 흐름 cytometry 데이터 유형의 그림은 묘사 그림 1B을 가능한 접시 레이아웃을 수행 하 96 잘 접시 형태로 분석 결과 그림 1C에서 주어진 다. Endogenously 익스프레스 chemokine 수용 체 CXCR4 Jurkat 세포의 외피 (즉, 이 분석 결과에 대 한 관심의 GPCR), 붙일 레이블된 CXCL12 양의 증가 함께 (즉, CXCL12AF647)으로 발생 증가 형광 (그림 2), ligand 바인딩 CXCR4의.......

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토론

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바인딩 분석 (즉, 채도 바인딩 및 바인딩 운동 실험)의 다른 유형에 비해, 경쟁 의무적인 분석 실험은 심사 목적에 가장 적합. 실제로, 그들은 레이블이 지정 된 수용 체 ligand의 고정 된 금액의 바인딩을 방해 하는 그들의 기능을 채 점 하 여 레이블이 없는 화합물, 예를 들어 작은 분자의 큰 배치의 평가 허용. 레이블이 리간드 보다 다른 수용 체 사이트에 바인딩되는 화합물 분석 결과에 들 키 지 유지 수 있습니다. 비록 경쟁 바인딩 실험 설명 여기에 초점을 맞추고 CXCR4 chemokine 수용 체에 특히, 그것은 아마 뿐만 아니라 다른 GPCRs에 대 한 경쟁 의무적인 분석 실험의 디자인에 대 한 청사진으로 사용할 수 있습니다. 예를 들어, CXC chemokine 수용 체 7 (CXCR7)은 CXCL12, 높은 선호도29,와 바인딩 CXCL1230의 능력에 대 한 대체 수용 체로 묘사 되었다. 따.......

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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저자 에릭 Fonteyn 우수한 기술 지원에 대해 감사 하 고 싶습니다. 이 일 구 루벤에 의해 지원 되었습니다 (no를 부여 합니다. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, no를 부여. G.485.08)와 Fondation Dormeur 파두츠.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BD FACSCanto IIBecton Dickinson해당 사항 없음유세포 분석 장치
BD FACSDIVA 소프트웨어
BD FACSArrayBecton Dickinson해당 없음유세포 분석 장치
BD FACSArray 시스템 소프트웨어
Graphpad PrismGraphpad그림 2 및 그림 3에서 비선형 회귀 분석에 사용되는 소프트웨어 패키지
FlowJoFlowJo는 현재 BD가 전액 출자한 자회사입니다.
Vi-CELLBeckman Coulter해당없음 세포 생존도 분석기
Sigma 3-18 KSSigma해당 없음원심분리기
AMD3100SigmaA5602-5mg특정 CXCR4 길항제
MaravirocPfizer항레트로바이러스 약물, CCR5 길항제, Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002)에서 연구 가능
h-SDF1a (AF647)ALMACCAF-11-B-01형광 표지 CXCL12, CXCL12AF647
소 태아 혈청(FBS)Gibco(Life Technologies)10270-106
소 혈청 알부민(BSA)SigmaA1933-25G
HBSS(10x), 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드 없음Gibco(Life Technologies)14065-049
HEPES(1M)Gibco(생명 Technologies)15630-056
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)Gibco (Life Technologies)14190-094
Jurkat cellsATCC
시약 저장소 PPSigmaBR703411
Rapid flow filter: 0.2 µ m aPESThermo Scientific566-0020
Sterilin 마이크로타이터 플레이트, 96-well, U bottom, 투명Thermo Scientific611U96
Falcon tubes, 50mlGreiner Bio-One227 261
조직 배양 플라스크 (T75)Corning353024

참고문헌

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  1. Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
  2. Milligan, G., Kostenis, E.

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재인쇄 및 허가

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태그

CXCR4CXCL12GPCRJurkatAMD3100Maraviroc

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