방법 논문

합성 살 균 소의 건설 맞춤형 다양성 팹 라이브러리 표시

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DOI:

10.3791/57357

⸱

2018년 5월 1일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Antibody Engineering, Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University, 2Banting and Best Department of Medical Research, Terrence Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 3Department of Molecular Genetics, Terrence Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜에서는 맞춤형 다양성 합성 항 체 살 균 소 전시 도서관의 건설에 대 한 자세한 절차를 설명합니다. 합성 항 체는 질병 진단 및 치료제를 기초 연구에서 광범위 한 응용 프로그램 있다.

초록

단일 클론 항 체 (mAbs) 기초 연구와 의학에 대 한 수요는 매년 증가 하 고 있다. Hybridoma 기술 mAb 개발 이후 1975 년에 그것의 첫 번째 보고서에 대 한 지배적인 방법 되었습니다. 대체 기술, mAb 개발에 대 한 파지 디스플레이 방법으로 점점 더 매력적인 Humira, 첫 번째 페이지에서 파생 된 항 체와 베스트 셀러 mAbs 중은 2002 년에 류 마티스 관절염의 임상 치료에 대 한 승인 이후입니다. 비 동물 mAb 개발 기술을 기반으로, 살 균 소 전시 항 원 immunogenicity, 인간 화, 그리고 전통적인 hybridoma 기술 기반 항 체 개발에서 필요한 동물 유지 보수를 무시 합니다. 이 프로토콜에서 우리는 합성 살 균 소 표시 팹 라이브러리의 109-1010 단일 electroporation에 얻을 수의 다양성을 건설 하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 구성: 1) 고효율 전기 유능한 세포 준비; 2) 추출 uracil 포함 하는 단일 가닥 DNA (뒤-ssDNA); 3) Kunkel 메서드 기반 oligonucleotide 감독 mutagenesis; 4) electroporation 그리고 계산 라이브러리 크기; 5) 단백질 A/L 기반 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 폴딩에 대 한 기능적 다양성 평가; 그리고 6) 다양성의 DNA 순서 분석.

서론

mAbs 기초 연구에서 질병 진단 및 치료에 이르기까지 광범위 한 응용 프로그램 있다. 2016, 현재 60 mAbs 자가 면역 질환, 암, 그리고 전염병1,2의 임상 치료에 대 한 미국 식품의 약 청 (USFDA)에 의해 승인 되었습니다.

1975 년 Kohler와 Milstein 보고 'hybridomas' 그리고이 기법은 라고도 셀룰러 소스에서 단일 클론 특이성의 항 체의 지속적인 세대를 위한 기술 의학 및 산업3 초석 이후 되고있다. ,4. 이 메서드에서 mAbs의 세대 항 원 생산, 마우스 면역, B 림프 톨의 추출, 치료 응용 프로그램에 대 한 불멸의 hybridoma 세포, 클론 선택, 형성 하기 위하여 myeloma 세포와 B 세포의 융해를 포함 하 여 다양 한 단계 필요 인간 화 인간 안티 마우스 항 체 (하 마)4,5을 피하기 위해 필요 합니다. 그러나,이이 기술에 대 한 항 독 소, 균, 그리고 높은 보존된 단백질을 포함 하 여 상대적으로 mAb 생산5에 대 한 vivo에서 면역 반응을 트리거링에 유효 하지 않습니다.

1978 년, 허 치 슨 외. 단일 가닥 살 균 소 바이러스6잔류물의 직접 mutagenesis는 oligonucleotide 사용 하 여 보고. 1985 년에, 스미스 보고 외국 유전자 파편 유전자 살 균 소의 외 투 단백질 III 인코딩 프레임에 융합 될 수 있다 하 고 따라서 그것의 infectivity7을 타협 하지 않고 살 균 소 표면에 표시 될 수 있습니다. 이 선구적인 작품에 면역, 순진한, 살 균 소 전시 항 체 라이브러리의 후속 건설에 대 한 토대를 마련 하 고 합성을 위한 단일 체인 변수 조각 (scFv)의 항 원 묶는 조각 (팹) 형식으로 형성 치료 mAb 개발8,9. 기술적인 관점에서 파지 디스플레이 기반 항 체 개발 hybridoma 기반 mAb 개발 일부 항 포즈 수 있는 한계를 우회 하는 데 도움이 수 있는 상호 보완적인 접근 방식을 제공 하 고는 인간 화 하는 과정 hybridoma 파생 된 항 체는 종종5가필요합니다. 2016, 현재 6 살 균 소 전시 파생 mAbs Humira, 류 마티스 관절염의 치료에 사용 되는 가장 성공적인 mAbs 중 하나를 포함 하 여 시장 승인 및 많은 파지 디스플레이 파생 된 항 체는 현재 임상의 다양 한 단계에서 조사10.

면역과 순 살 균 소 항 체 라이브러리, complementarity 결정의 다양성에 대 한 지역 (Cdr) 빛과 무거운 체인에 자연 면역 레 퍼 토리 (즉, B 세포에서)에서 파생 됩니다. 반면, 합성 살 균 소 항 체 라이브러리에서 Cdr의 다양성 완전히 인공입니다. 합성 접근 도서관 건축을 정밀 하 게 제어 순서 다양성의 디자인을 제공 항 체 구조의 기계 론 적인 연구에 대 한 기회를 제공 하 고 기능11,12. 또한, 합성 라이브러리 프레임 워크 라이브러리 건설 촉진 하류, 대규모 산업 개발11,12전에 최적화할 수 있습니다.

1985 년, Kunkel M13 살 균 소에 사이트 이동 돌연변이 효율적으로 소개 하는 단일 가닥 DNA (ssDNA) 템플릿 기반 mutagenesis 접근 보고13. 이 방법은 이후 살 균 소 전시 도서관의 건축을 위해 널리 사용 되었다. 화학적 합성된 DNA oligonucleotides 팹 Cdr에 다양성을 소개 하는 항 체 백본 템플릿을 phagemid에 통합 됩니다. 이 프로세스는 phagemid uracil 포함 된 ssDNA (뒤-ssDNA)로 표현 된다 고는 oligonucleotides는 Cdr에 단련는 이중 가닥 DNA (dsDNA) T7 DNA 중 합 효소 및 T4 DNA 리가 존재 합성 확장. 마지막으로, 생성 된 ds DNA electroporation에 의해 대장균 에 도입 될 수 있습니다.

높은 다양성, 살 균 소 전시 도서관 건설, 2 분 대 혼합 전기 유능한 세포와 covalently의 높은 전압 electroporation 닫힌된 원형 dsDNA (CCC-dsDNA) 신중 하 게 준비 한다. Sidhu 외. 전통적인 방법에서 크게 향상 된 라이브러리 다양성14전기-유능한 세포와 DNA의 준비를 수정.

이 프로토콜에서 우리는 합성 살 균 소 표시 팹 라이브러리의 109-1010 단일 electroporation에 얻을 수의 다양성을 건설 하는 방법을 설명합니다. 그림 1 에서는 도서관 건설 등의 개요: 1) 고효율 전기 유능한 세포 준비; 2) 뒤 ssDNA;의 추출 3) Kunkel 메서드 기반 oligonucleotide 감독 mutagenesis; 4) electroporation 그리고 계산 라이브러리 크기; 5) A/L 기반 ELISA 위한 단백질 폴딩 및 기능적 다양성 평가; 그리고 6) 다양성의 DNA 순서 분석. 모든 시 약, 긴장 및 장비 물자의 테이블에 나열 됩니다. 표 1 시 약 설치를 보여 줍니다.

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프로토콜

참고: 필터 멸 균 팁 사용 해야 전체 페이지를 다룰 때 피 펫 총 및 주변 지역에 오염을 피하기 위하여. 박테리아와 살 균 소 처리 실험 때 무 균 영역이 나 후드를 사용 해야 합니다. 살 균 소 실험 영역 2% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 뒤에 70% 에탄올을 사용 하 여 살 균 소 오염 방지 청소 되어야 한다. 이 프로토콜에서 직렬 희석을 만들기 위한 각 희석에 대 한 새로운 팁을 사용 해야 합니다.

1. 대장균 SS320 전기 유능한 세포 준비

  1. 1 h. 위해 37 ° C 배양 기에서 미리 따뜻한 파운드/tet 천 배지 (준비 및 저장에서 4 ° C 미만 1 주 된)에서는 살 균 접종 루프 또는 멸 균 팁 미리 따뜻하게 LB/tet 천 배지에 대장균 SS320 셀의 글리세롤 주식 밖으로 행진을 지그재그 direc 접시의 표면 따라 부드럽게 기입니다. 밤새 약 12-15 h에 대 한 37 ° C 배양 기에서 접시를 품 어.
  2. 다음 날, 지그재그 선 따라 잘 분리 된 단일 콜로 니를 선택 하 고 매체에 루프를 찍기 하 고 짧게 감동 하 여 50 mL 둥근 바닥 튜브에 2YT/tet 매체의 10 mL에 접종을 멸 균 접종 루프 또는 멸 균 팁을 사용 합니다.
  3. OD600 0.4-0.8 (로그 단계 성장) 주변에 도달할 때까지 약 3-4 h 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 품 어. 모니터 세600 에서 2 h입니다. 이 기간 동안 사전에 적어도 1 시간에 대 한 37 ° C 배양 기에서 5 파운드/tet 한 천 배지 (준비 및 저장에서 4 ° C 미만 1 주 된) 따뜻한.
  4. 실험실 재고 titer 1 x 10에서 20 μ M13KO7 도우미 페이지 추가13 콜로 니 형성 단위 (cfu) /mL 살 균 1의 180 μ 10 준비 압력가 1.5 mL 튜브에 X PBS ten-fold 직렬 희석.
  5. Aliquot 4 mL 압력가 마로 소독 하 고 액체 2YT 최고 천 5 X 14 mL로 하단 튜브 라운드, 각각, ten-fold 희석의 9에 5에서 한 희석 각 튜브 라벨 및 액체 상태에서 2YT 최고 agar를 유지 하기 위해 65 ° C 배양 기에서 품 어.
  6. 로그 단계 E. 콜라이 SS320의 혼합 500 μ M13KO7 희석 튜브에 세포 (선택 5 9 ten-fold 희석 ten-fold 희석)와 5-10 분 동안 37 ° C 배양 기에서 품 어.
  7. 1.6 단계의 인큐베이션 기간 동안 2YT 최고 천에서에서 전송 단계 1.5 실내 온도를 약 42 ° c.를 약 5 분 (RT) 2YT 최고 천;의 온도 테스트를 안 팔목을 사용 하 여 그것은 유지 한다 액체로. 1.5 단계에서 각 해당 2YT 최고 천 관 각 희석 혼합물을 전송. 각 튜브의 뚜껑을 강화 하 고 믹스 하 여 거꾸로 여러 번 부드럽게 짧게 거품 생성을 피하기 위해.
  8. 조심 스럽게 (1.3 단계)에서 미리 따뜻한 파운드/tet agar 플레이트의 가장자리를 따라 각 혼합물을 부 어 하 고 완전 하 고 균일 하 게 혼합 거품의 소개를 피하고 있는 동안 접시 채우기 위해 약간 접시를 가로질러. 각 배지 내의 최고 agar를 공고히 하 고 15-18 h 약 37 ° C 하룻밤에 2YT 최고 한 천 배지를 품 어 약 5-10 분에 대 한 RT에서 번호판을 유지.
  9. 주위와 단계 1.8에서에서 하룻밤 성장 후 희석 접시를 선택 플 라크 접종에 대 한 100-200 평균 크기의 단일, 잘 분리 된 플 라크. 한 손으로 광원, 그리고 피 펫 총 수직 상단 agar에 찌를 오래 살 균 피 펫 팁와 함께 로드를 반면에 대 한 천 배지를 사용 하 여 고과 잘 분리 된 플 라크를 수집 합니다.
    1. 피 펫 팁 패 최고 천 구분을 약간 경사 2YT/칸/tet 매체의 1 mL와 함께 로드 14 mL 둥근 바닥 문화 관으로 천 플 라크를 꺼내 려 여러 번 왔다 갔다 피 펫 ( 표 1참조).
    2. 총에서 3-5 패를 선택 하려면이 절차를 반복 합니다. 여러 패를 따기의 목적은 성공적인 접종 되도록 패 희미 한 박테리아 식민지와 비교할 때 상대적으로 작은 수로. 성장 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 8 h에 대 한 플 라크.
  10. 문화를 성장 하 고 당황 하 게 250 mL 플라스 크에 2YT/칸/tet 매체의 50 mL에의 한 튜브를 전송 합니다. 37 ° C에 하룻밤 약 12 h에 대 한 200 rpm에서 떨고 함께 성장 한다.
  11. 3 2-L 당황 하 고 플라스 크 하룻밤 문화의 5 mL와 함께 superbroth/tet/칸 매체의 900 mL를 포함 하 접종 OD600 0.6-0.8 주위에 6-7 h 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 품 어.
  12. 3 부드러운 상수 소용돌이 손으로와 5 분 동안 얼음 목욕에서 세균성 문화 flasks을 진정. 다음 단계는 prechilled 솔루션 및 장비와 얼음, 차가운 룸에서 이루어져야 한다.
  13. 흡 광도 조직 수건을 사용 하 여 각 플라스 크;의 외부 유리를 건조 한 손으로 사용 하 여 경사 벤치에 다른 손을 부드럽게 각 플라스 크에서에서 매체 각 원심 분리기 병에 부 어 1 L 압력가 원심 병.
  14. 스핀 5000 × g에서 10 분 작은 박테리아. 4 ° C
  15. 원심 분리, 다음 부드럽게 가만히 5 L 압력가 폐기물 비 커에는 상쾌한을 따르다.
  16. 100 mL의 멸 균 필터링 1.0 mM HEPES, pH 7.4, 각 병 채우기 고 200 rpm에서 물의 resuspension 펠 릿에에서 도움이 각 병 압력가 자석 볶음 바 추가. 소용돌이 자석 교 반 중 몇 분 마다 병 벽에서 전체 펠 릿을 꺼내. 일단 펠 릿을 녹 각 병을 살 균 필터링 1.0 mM HEPES, pH 7.4의 추가 400 mL을 채우십시오.
  17. 원심 분리기 5000 × g에서와 4 ° C 10 분 Decant 상쾌한, 병에 저 어 바 유지에 대 한.
  18. 한 번 1.16 1.17 단계를 반복 합니다.
  19. 저 어 바의 도움으로 살 균 필터링 10% 초순 글리세롤의 500 mL에 각 펠 릿을 resuspend. 소용돌이 자석 교 반 중 몇 분 마다 병 벽에서 전체 펠 릿을 꺼내.
  20. 원심 및 단계 1.17에서 가만히 따르다. 1.19 단계를 한 번 반복 합니다. 긴 팔 압력가 마로 소독 집게를 사용 하 여 저 어 바 제거.
  21. 5000 × g와 15 분 Decant는 상쾌한 4 ° C에서 원심 고 각 원심 분리기는 피 펫 병에서 상쾌한의 남아 있는 흔적을 제거 합니다.
  22. 한 병에 10% 초순 글리세롤의 3.0 mL를 추가 하 고 부드럽게 pipetting으로 펠 릿을 resuspend. 다음 병에 정지를 전송 하 고 알 약의 모든 resuspended 고 한 병에 결합 될 때까지 반복 합니다. 고 농도 세포의 약 6 mL11 cfu/mL 주위 3 x 10의 titer로 가져옵니다.
  23. 전 진정 압력가 microcentrifuge 1.5 mL 튜브 및이 단계 전에 적어도 1 시간을 위한-80 ° C에서 분배자 없이 한 96-잘 튜브 저장 상자. 셀 펠 렛 서 스 펜 션의 aliquots를 pipetting 전에 얼음 차가운 방에 미리 냉장된 microcentrifuge 튜브 전송. 각 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 세포 현 탁 액의 aliquot 350 μ를 피 펫을 사용 합니다.
  24. 거품 상자 컨테이너 가득 플래시 동결에 액체 질소로 (3-5 분)에 aliquots를 전송 합니다.
    1. 거품 상자-80 ° C 냉장고를 액체 질소로 전송 (1.23 단계 참조).
    2. -80 ° C 냉장고에서 1.5 mL microcentrifuge 튜브 저장 상자를 제거 (1.23 단계 참조) 얼음에 넣어.
    3. 신속 하 게 체 액체 질소에서 aliquots 튜브 저장소 상자에 그들을 배치 하는 금속 메시를 사용 합니다. -80 ° c.에 게
      주의: 액체 질소 화상을 일으킬 수 있다 고 주의 안전 보호를 위해 해야 한다. 팹 백본 phagemid를 사용 하 여 (팹 백본 phagemid 주식 400 ng / µ L에서 초순 (MilliQ)에 있어야 합니다) 준비 된 전기 유능한 세포의 효율성을 확인 하기. 10 µ L의 초순에 팹 백본 phagemid의 1 μ g, 얼음, 전기 유능한 SS320의 약 350 μ 수 thaw 그리고 얼음에 0.2 cm 간격 electroporation 멧 prechill.
  25. 녹고 후 10 µ L DNA에 350 μ 전기 유능한 SS320 셀을 추가 하 고 얼음 혼합물을 유지 하면서 여러 번 pipetting으로 혼합. 거품을 소개 하지 마십시오.
  26. 미리 15 mL 50 mL 튜브 electroporation 전에 적어도 30 분 동안 37 ° C 물 목욕에 SOC 매체의 따뜻한. 에 베트를 360 μ 혼합물을 전송 하 고 electroporation 제조업체의 지침에 따라 수행 합니다.
  27. 즉시 (단계 1.27)에서 미리 데워 SOC 매체의 1 mL을 추가 하 고 pipetting 여 electroporation 후 셀 구조. 미리 미리 따뜻하게 soc 5 mL 로드 125 mL 플라스 크에는 베트에서 매체를 전송
  28. 린스는 멧 두 번, 각각 미리 따뜻하게 SOC 매체의 1 mL와 함께 시간과 125 mL 플라스 크에 매체를 전송 (단계 1.27 참조). 미리 데워 진된 SOC 매체 125 mL 플라스 크에 10 mL의 최종 볼륨을 추가 합니다.
  29. 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 30 분 동안 10 mL 세포 배양 품 어.
  30. Transfection 효율 및 M13KO7 감염 이전의 속도 확인 하려면 직렬 희석을 확인 합니다.
    1. 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 각 잘 96-microwell 접시의 단일 열에 2YT 미디어의 180 μ를 추가.
    2. 8 열 배 직렬 게 희석: pipetting, 혼합 판의 첫 번째 우물을 단계 1.29에서에서 문화의 20 μ를 전송 하 고 잘 다음 혼합물의 20 μ를 전송. 직렬 희석의 끝에이 단계를 반복 합니다.
    3. 플레이트 중복에서 파운드/수화물, 파운드/칸, 그리고 파운드/tet 접시에 각 직렬 희석의 10 μ.
    4. 37 ° c.에서 밤새 품 어
    5. 효율 계산 공식: M 희석된 배 10N 에서 계산 평균 지 수는 가정 (N은 1-8에서). 팹 백본 phagemid LB/수화물 접시에서의 대장균 SS320 전기 유능한 세포 transfection 효율은N + 3 M X 10 cfu / µ g. M13KO7 사전 감염 속도 LB/칸에 LB/tet 식민지의 비율에서 추정 된다. 대장균 SS320 유능한 세포 팹 백본 phagemid와 페의 비율 LB/수화물 및 LB/칸에서 식민지의 비율에서 추정 된다.

2. Phagemid 템플릿에서 Uracil 포함 된 ssDNA (뒤-ssDNA) 준비

참고: A는 이전 팹 백본 phagemid 뒤 ssDNA 준비15에 대 한 템플릿으로 사용 되었다 보고. 팹 백본 phagemid의 아키텍처는 그림 2에 표시 됩니다. 플라스 미드 스핀 키트 (QIAprep 스핀 M13) 약간의 수정을 뒤 ssDNA의 추출에 사용 됩니다.

  1. 미리 살 균 루프 또는 미리 따뜻하게 LB/cmp 접시에 팁 1 h. 행진 대장균 CJ236 셀 (또는 다른 dut−/ung− 스트레인)의 글리세롤 주식 밖으로 대 한 37 ° C 배양 기에서 LB/cmp 플레이트 (준비 및 저장에서 4 ° C 미만 1 주 된) 따뜻한. 약 12-15 h 37 ° C 하룻밤 사이에서 격판덮개를 품 어.
  2. 멸 균 팁 하나의 식민지를 선택 하 고 폴 리 프로필 렌 14 mL 라운드 하단 튜브에 2YT/cmp 매체의 2 mL에 접종.
  3. OD600 0.4-0.8 (로그 단계 성장) 주변에 도달할 때까지 3-4 h 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 매체를 품 어.
  4. 문화, 팹 백본 서식 파일의 5-10 μ 페이지를 추가 하 고 살 균 소 감염 수 있도록 30 분 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 품 어.
  5. 부 화, 후 37 ° c.에 미리 따뜻하게 LB/수화물 접시에 문화의 10 μ 밖으로 행진 하 멸 균 팁 사용 약 12-15 h 37 ° C 하룻밤 사이에서 품 어.
  6. 접종 3 mL 2YT/수화물/cmp 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 튜브,의 시작 문화 성장과 37 ° C에서 약 12 h에 대 한 하룻밤 200 rpm에서 떨고와 대장균 CJ236 포함 팹 백본 phagemid의 단일 식민지를 선택 합니다.
  7. 당황 하 게 250 mL 병에서 30 mL 2YT/수화물/cmp로 0.3 mL 스타터 문화를 예방.
  8. OD600 0.4-0.8 (로그 단계 성장) 주변에 도달할 때까지 3-4 h 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 세포 배양 품 어.
  9. 추가 M13KO7 (약 1 x 1013 cfu/mL의 실험실 재고, titer)에서 문화에 약 10의 감염 (MOI)의 다양성을 가진 2.8 단계 M13KO7의 마지막 titer 이며 약 1 x 1010 cfu/mL.
  10. 200 rpm에서 1 h 동안 37 ° C를 품 어.
  11. 50 mL 라운드-하단 튜브 5000 × g 및 20 분 동안 25 ° C에서 원심 분리 하 여 문화를 작은.
  12. 가만히 따르다는 상쾌한 고 신선한 2YT/수화물/칸/uridine의 30 mL와 펠 릿을 resuspend. 새로운 250 mL 절망 속된 병에 있는 물의 resuspension 전송.
  13. 200 rpm 및 22-24 h에 대 한 25 ° C에서 품 어.
  14. 50 mL 라운드-하단 튜브에 단계 2.13에서에서 문화를 전달 하 고 세균성 세포 펠 릿에서 표면에 뜨는 페이지를 분리 하는 문화 20 분 12000 × g에서 원심. 새로운 50 mL 라운드-하단 튜브로 표면에 뜨는 페이지를 전송 하 고 추가 1/5 페이지 침전을 못/NaCl 솔루션의 최종 볼륨. 잘 혼합 하 고 30 분 살 균 소 입자를 침전 얼음에 품 어.
  15. 12000 × g에서와 4 ° C 원심 30 분 Decant는 상쾌한에 대 한 고 2 분에 대 한 4000 × g와 4 ° C에서 원심 분리기 남아 상쾌한 발음.
  16. 2 ml PBS와 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 1 살 균 필터링의 살 균 소 펠 릿을 resuspend. 모든 나머지 세균 파편을 제거 하 고 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브 표면에 뜨는 페이지 전송 4 ° c.에 저장 벤치탑 microcentrifuge에서 5 분 12000 × g에서 원심
  17. E. 콜라이 SS320와 나란히 비교 통해 대장균 CJ236의 uracil 법인 효율성을 확인 하십시오.
    1. 2YT 미디어의 180 μ 96 잘 접시의 한 행의 각 음을 추가 합니다.
    2. 10 10 배 직렬 게 희석: 판의 첫 번째 잘 20 μ 표면에 뜨는 페이지의 전송, pipetting, 혼합 및 다음 잘 혼합의 20 μ를 전송. 직렬 희석의 끝에이 단계를 반복 합니다.
    3. 마지막 8 개의 직렬 희석 CJ236 대장균 및 대장균 SS320 90 μ 로그 단계에서 감염에서 살 균 소의 10 μ를 추가 (OD600 = 0.4-0.8). 부드러운 진동으로 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    4. 플레이트 각 감염 대장균 CJ236에 중복에서 2YT/수화물 접시에 대장균 SS320의 직렬 희석에서 10 μ.
    5. 37 ° c.에서 밤새 품 어
    6. Titer 계산 공식: M 희석된 배 10N 에서 계산 평균 지 수는 가정 (N은 1-10에서). 대장균 CJ236 또는 대장균 SS320 titer가N + 2 M X 10 cfu/mL와 같습니다. CJ236 대장균 및 대장균 SS320 titer 비율에서 uracil 관 효율을 견적 한다.
  18. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 표면에 뜨는 페이지에 페이지 강수량 버퍼 MP의 1/100 볼륨을 추가 하 고 여러 번 섞어 부드럽게 거꾸로 차례. 적어도 2 분 살 균 소 입자는 문화 매체에서 시 켰 던에 대 한 RT에서 품 어 하 고 따라서, 흐린 솔루션 표시 되어야이 시점에서.
  19. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 단계 2.18 플라스 미드 스핀 열 (예를 들어, QIAprep)에 샘플을 적용 됩니다. SsDNA 한 스핀 열 바인딩 용량에 도달할 수 10 µ g. 원심 분리기 6000 × g 30 25 ° C에서 벤치탑 microcentrifuge에 s. 흐름-microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 통해 삭제 합니다. 살 균 소 입자는이 단계에서 열 매트릭스에 바인딩된 남아 있습니다.
  20. 열에 UT MLB 살 균 소 세포 및 바인딩 버퍼 ( 토론참조)의 0.7 mL을 추가 하 고 적어도 1 분 동안 RT에서 품 어.  6000 x g와 25 ° C 30 s와 흐름을 통해 삭제에 대 한 원심.
  21. UT-MLB 버퍼의 또 다른 0.7 mL을 추가 하 고 적어도 1 분 동안 RT에서 품 어.
  22. 플로우 스루 30 s. 폐기를 위해 6000 × g에서 원심. 이 단계에서 살 균 소의 외 투 단백질 열 매트릭스에 바인딩된 남아 뒤 ssDNA에서 분리 된다.
  23. 워시 버퍼 PE 포함 에탄올 제조업체의 지침에 따라 0.7 mL를 추가 합니다. 30 s를 통해 흐름 삭제 6000 × g에서 원심.
  24. 반복 단계 2.23, 다음 한 번 더 30 6000 × g에서 원심 잔여 버퍼 PE를 제거 하는 s.
  25. 새로운 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 열을 전송 하 고 추가 차입 버퍼 EB (10 m m Tris·의 100 μ CL, pH 8.5) 열 막의 센터에.
  26. 10 분, 1 분 뒤 ssDNA elute 6000 × g에서 원심 분리기에 대 한 RT에서 품 어. 약, 1.5-2.5 μ g 뒤-ssDNA/mL 문화 얻어질 수 있다.
  27. 태 젤 1 %agarose electrophoresing 1 μ에 의해 eluted DNA를 분석. DNA는 아무 번짐으로 주로 단일 밴드로 표시 되어야 합니다.
  28. 260에 nanodrop 분 광 광도 계에 흡 광도 측정 하 여 DNA 농도 결정 nm (260 = 1.0 ssDNA의 33 ng/μ에 대 한). 전형적인 뒤 ssDNA 농도 200-500 ng/μ 내에 있습니다.

3. Kunkel 메서드 기반 Mutagenesis Oligonucleotide 감독

노트: 그것은 돌연변이 oligonucleotide 및 반응 부품의 품질을 보장 하기 위해 전체 규모 반응 전에 소규모 반응을 수행 하는 것이 좋습니다. Kunkel의 방식 만화 oligonucleotide 감독 mutagenesis는 그림 3에 표시 됩니다. 다양 한 아미노산 다양성 IMGT 명명법16 (표 2) 번호와 CDRH1, CDRH2, CDRH3, 및 CDRL3 지역으로 소개 된다. 각 CDR의 이론적인 아미노산 다양성, 총 이론적인 아미노산 성과 oligonucleotide 시퀀스는 표 2에 나열 됩니다.

  1. T4 polynucleotide 키와 oligonucleotide 인 산화
    1. 2 μ 10 X TM 버퍼, 2 μ 10mm ATP, 1 μ 100mm DTT와 단일 CDR을 변형 하도록 설계 된 돌연변이 oligonucleotides의 0.6 μ g를 결합 한다. 1.5 mL 튜브에 18 μ의 전체 볼륨에 초순 h 조2O를 추가 합니다. 라이브러리 건설에 대 한 4 별도 및 병렬 인 산화 반응에 해당 하는 CDRH1, CDRH2, CDRH3, 그리고 CDRL3, 각각 설정 됩니다.
    2. 20 U를 추가 (2 uL) T4 polynucleotide 키 각각의 튜브와 37 ° C (반응 1 표 3)에서 1 시간에 품 어. 사용 하 여 즉시 어 닐 링입니다.
  2. 서식 파일에 oligonucleotides의 어 닐 링
    1. 뒤 ssDNA 템플릿의 20 μ g, 0.5 mL 튜브에 250 μ의 최종 볼륨을 10 X TM 버퍼의 25 μ, 각 phosphorylated oligonucleotide 솔루션 및 초순 H2O의 20 μ 추가. 잘 혼합 하 고 표 3에 반응 2로 0.20 mL PCR 튜브 (각 50 μ)로 전송. 이러한 DNA 수량 oligonucleotide 및 서식 파일의 길이 비율 1: 100 이라고 가정 하면 oligonucleotide 템플릿, 사이 3: 1의 몰 비율을 제공 합니다.
    2. 품 어는 PCR 기계 90 ° C에서 3 분, 3 분, 50 ° C에서에서 반응 하 고 5 분 동안 20 ° C.
  3. CCC dsDNA의 효소 합성
    1. 250 μ 단련 oligonucleotide/템플릿 혼합물에 10mm ATP의 10 μ, 25mm dNTP 믹스의 10 μ, 100 mM DTT의 15 μ, 30와 이즈 단위 T4 DNA 리가, 그리고 30 U T7 DNA 중 합 효소 반응 3 표 3에 추가 합니다.
    2. 하룻밤 20 ° C에서 1.5 mL 튜브에 반응을 품 어.
    3. 세척 하 고 합성된 CCC dsDNA 실시간에 30 kDa 기 공 크기 막으로 0.5 mL 원심 필터 장치에 집중
      1. 필터 장치에 하룻밤 반응 혼합물을 전송 하 고 400 µ L 최종 볼륨을 초순 h 조2O를 추가 합니다. 10 분;에 대 한 14000 × g에서 회전 볼륨은 50 미만 μ.
      2. 삭제를 통해 흐름 필터, 초순 H2O의 400 µ L을 추가 하 고 10 분 14000 × g에서 회전.
      3. 3.3.3.2 단계를 한 번 더 반복 합니다.
      4. CCC dsDNA를 복구 하려면 깨끗 한 microcentrifuge 튜브에 필터를 거꾸로 놓습니다. 2 분;에 대 한 1000 × g에서 회전 복구 볼륨은 일반적으로 약 20-40 μ. 복구 된 CCC dsDNA electroporation 대장균 의 즉시 사용 하거나 나중에 사용-20 ° C에서 냉동 수 있습니다. 일반적으로 20-40 μ g CCC DNA는 얻을 수 있습니다.
    4. 반응의 결과 시각화 뒤 ssDNA 템플릿 함께 eluted 반응 제품의 1.0 µ L electrophorese

4. Electroporation 및 라이브러리 크기의 계산

  1. 순화 CCC dsDNA 진정 (50 μ의 최대 볼륨에 20 μ g)는 1.5 mL microcentrifuge와 얼음에 0.2 cm 간격 electroporation 베트.
  2. 미리 20 mL 50 mL 폴 리 프로필 렌 원뿔 원심 분리기 튜브 적어도 30 분 동안 37 ° C 물 목욕에 SOC 미디어의 따뜻한.
  3. 전기 유능한 대장균 의 350 μ 약 수를 녹여 얼음에 SS320. DNA를 혼합 셀 추가 철저 하 게 여러 번 pipetting으로 합니다. 거품을 소개 하지 마십시오.
  4. 베트에 혼합물을 전송 하 고 electroporation 제조업체의 지침에 따라 수행 합니다. 예를 들어 BTX ECM-630 electroporation 시스템을 사용 하는 경우 관련 설정은 2.5 kV 강도, 125 Ω 저항, 및 50 µ F 커패시턴스 있습니다.
  5. 즉시 미리 따뜻하게 SOC 매체의 1 mL을 추가 하 고 17 mL 125 mL 플라스 크에 SOC 매체의 전송 여 electroporated 세포 구조. 동일한 플라스 크에 SOC 매체 및 전송의 1 mL로 두 번 베트 린스 (최종 볼륨은 20 mL).
  6. 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 30 분 동안 품 어.
  7. Electroporation 효율을 결정 합니다.
    1. 각 잘 96-microwell 접시의 단일 열에 2YT 미디어의 180 μ를 추가 합니다.
    2. 8 10 배 직렬 게 희석: 20 mL 문화 20 μ 판의 첫 번째 잘 전송, pipetting, 혼합 및 다음 잘 혼합의 20 μ를 전송. 직렬 희석의 끝에이 단계를 반복 합니다.
    3. 플레이트 각 중복에서 한 파운드/수화물 접시에 직렬 희석 10 μ. 각 식민지 수 크로스-검사에 대 한 별도 LB/수화물 접시에 직렬 희석의 남은 100 µ L 플레이트. 이 접시도 ELISA와 시퀀스 분석 (섹션 5 참조)에 대 한 단일 클론을 제공 합니다.
    4. 37 ° c.에서 밤새 품 어
    5. LB/수화물 접시에 10 μ 중복에서 식민지를 계산 합니다. M을N 숫자 계산된에 10 파운드/수화물 플레이트 (N은 1-8에서) 배 평균 식민지 가정 합니다. 총 도서관 크기는 2 M 10N + 3 식민지 배와 같습니다.
  8. 약 수 페이지 라이브러리 생성을 위한 2YT/수화물/칸 매체의 두 2-L 당황 하 고 플라스 크, 각 포함 500 mL에 똑같이 4.6 단계에서 문화.
  9. 하룻밤 사이 약 16 h에 대 한 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 품 어.
  10. 2 1-L 압력가 원심 병 및 4 ° c.에 12000 × g에서 30 분 동안 원심 분리기를 문화를 전송
  11. 두 개의 새로운 압력가 분리기 1 L 병은 상쾌한 전송 및 1/5을 추가 페이지를 침전을 못/NaCl 솔루션의 최종 볼륨. 30 분 동안 얼음에 품 어.
  12. 12000 × g에서 30 분 및 4 ° c.에 대 한 원심 분리기 신중 하 게는 상쾌한 가만히 따르다 하 고 살 균 소 펠 릿의 방해 하지 않도록. 4000 x g에서 1 분 동안 회전 시키십시오 그리고 제거는 피 펫과 나머지 상쾌한.
  13. 1 X PBS 버퍼 살 균 필터링 및 새로운 50 mL 튜브에 20 mL와 함께 살 균 소 펠 릿 resuspend
  14. 12000 × g에서 5 분 및 4 ° c.에 대 한 centrifuging 여 불용 성 물질을 작은 새로운 50 mL 튜브에는 상쾌한을 전송.
  15. 분 광 광도 계에 의해 살 균 소 농도 측정 (OD268 = 5 × 1012 살 균 소/mL의 솔루션에 대 한 1.0).
  16. 5 X 1012 살 균 소/ml 10% 초순 글리세롤과 1 X PBS에 살 균 소 농도 조정 합니다.
  17. Aliquot 1 mL 당 1.5 mL microcentrifuge 튜브 살 균 소 솔루션의. 이동에 대 한 라이브러리를 즉시 사용 하는 방법 또는-80 ° c.에 저장

5. 품질 평가 단백질 A / L 직접 바인딩 ELISA 분석 결과 및 시퀀싱

  1. 무작위로 각 잘에서 2YT/수화물의 800 μ를 포함 하는 깊은 96 잘 문화 접시에 단계 4.7.3에서에서 LB/수화물 접시에 96 단일 식민지를 선택 하십시오. OD600 1000 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 3-4 h에 대 한 품 어 0.4-0.8 =.
  2. M13KO7의 100 μ를 추가 (1 X 1011 cfu/mL) 각 96-깊은 우물을 잘 플레이트 멀티 채널 피 펫 문화. 1 시간에 1000 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 품 어.
  3. 멀티 채널 피 펫 각 잘 하 대 (500 μ g/mL)의 10 배 농도 포함 하는 2YT의 100 μ를 추가 합니다. 1000 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 밤새 품 어.
  4. 1 X PBS에서 1 µ g/mL를 L 단백질 분해. 코트 3/4는 웰 스의 384-잘 높은 단백질 바인딩 폴리스 티 렌 접시 30 µ L/L 단백질 해결책의 잘. 4 ° c.에서 밤새 품 어
  5. 5.4 단계에서 하룻밤 단백질 L 코팅 솔루션을 삭제 합니다. 50 µ L M PBST의 추가 (차단 솔루션) 모든 멀티 채널 피 펫과 384-잘 높은 단백질 바인딩 폴리스 티 렌 격판덮개 우물. 실시간에서 1 시간에 대 한 미 판 통에 번호판을 품 어
  6. 4 ° c.에서 10 분 동안 3000 x g에서 깊은 96 잘 문화 접시에 단계 5.3에서에서 하룻밤 문화 아래로 회전 페이지는 상쾌한입니다.
  7. 단계 5.5에서에서 차단 솔루션을 삭제 합니다. 3 3 중, 고 1 비 코팅 잘 부정적인 제어 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 단백질 코팅 L 우물의 15 μ M PBST의 및 각 페이지 표면에 뜨는 (5.6 단계)의 15 μ를 추가 합니다. 200 rpm 동요와 1 시간에 대 한 RT에서 품 어.
  8. 살 균 소 솔루션을 삭제 합니다. 6 번 자동된 접시 세탁기에 의해 PBST의 80 μ와 접시 세척.
  9. 각 잘 멀티 채널 피 펫을 15 μ M PBST의와 15 μ 단백질 A-HRP (1:1, 500 1 X PBS에 희석)를 추가 하 고 1 시간에 대 한 약 200 rpm에서 떨고와 RT에서 품 어.
  10. 단백질 A-HRP/M-PBST 솔루션을 삭제 합니다. 6 번 PBST의 80 μ와 접시 세척.
  11. 멀티 채널 피 펫을 TMB 기판 (30 μ/잘)을 추가 하 고 색상 개발 될 때까지 2-3 분 동안 품 어. 1.0 M H3포4 (30 μ/잘) 반응을 중지 합니다.
  12. Spectrophotometrically 450에서 번호판을 읽기 nm. 긍정적인 클론 M-PBST 잘 3.0 보다 큰에 단백질 L 우물의 OD450 흡 광도의 평균 비율을 전시 하는 그 정의 됩니다.
  13. 96-깊은에서 잘, 실시간에서 30 분 동안 엘리 사 (5.6 단계) 사용 같은 살 균 소의 5 μ와 로그 단계에서 2YT/tet에 SS320의 50 μ를 감염
  14. 단계 5.13에서에서 96-깊이에 2YT/수화물의 950 μ를 추가 하 고 1000 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 밤새 품 어.
  15. 소형 예비 DNA 추출 키트에 의해 phagemid DNA를 추출 합니다. VL의 업스트림 뇌관을 사용 하 여 (5'-TCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTA-3') 및 VH (5'-GACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCG-3') 시퀀스 분석 라이브러리 시퀀스 다양성 예측을 위해.

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결과

팹 도서관 건축의 흐름 차트를 다음 ( 그림 1참조) 우리는 M13KO7 도우미 페이지 미리 감염 대장균 SS320 전기 유능한 세포 준비. 도서관 건축을 위한 팹 phagemid 백본 사용 되었다 때 이러한 전기 유능한 세포의 효율성 2 X 109 cfu / µ g로 추정 된다 (그림 4).

Uracil 관 효율 비교 하 여 CJ236 대장균 과 대장균 SS320 세포에서 titer의 되었다 검사. CJ236 대장균 및 대장균 SS320 셀 뒤 ssDNA를 은닉 하는 살 균 소 감염 했다. E. 콜라이 SS320는 효소 (dUTPase 및 u...

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토론

높은 다양성, 팹 라이브러리 페이지 표시, 품질 관리 구성 하 체크 포인트 전기 유능한 세포, 뒤 ssDNA 서식 파일의 효율성의 품질 역량을 포함 하 여 건설 과정의 다양 한 단계를 모니터링 하는 데 필요한 CCC dsDNA 합성, electroporation, 팹 접는 성과 아미노산 Cdr의 팹 파지 클론의 시퀀스 분석 후 titer.

고수익 뒤 ssDNA의 순도 높은 mutagenesis 속도 대 한 필수적입니다. 우리의 경험에서는, 25 ° C에서 살 균 소 유도 하룻밤 37 ° C에서 살 균 소 유도 하룻밤에서 그 보다 더 뒤 ssDNA를 얻을 수 있습니다. 이것은 이전 보고서19일치 하 여 이다. SsDNA 추출에 관한 초기 플라스 미드 스핀 키트 (QIAprep)는 살 균 소 세포와 바인딩 MLB를 포함. 나중에, MLB 알 수 없는 이유로 단종 되었고 PB로 대체. 우리는 뒤 ssDNA의 수익률은 MLB 치료에서 PB 치료...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자에 대 한 중요 한 의견 Kunkel의 방식 합성 팹 페이지 라이브러리 건설 Sidhu 연구소에서 박사 프레드릭 Fellouse 주셔서 감사합니다. 저자 감사 부인 Alevtina Pavlenco 및 높은 효율 전기 유능한 준비의 귀중 한 도움 Sidhu 실험실에서 다른 멤버 대장균 세포 및 고품질 뒤 ssDNA. 이 작품은 중국의 국가 자연과학 기초에 의해 지원 되었다 (허가 번호: 81572698, 31771006) DW 및 ShanghaiTech 대학으로 (부여 번호: F-0301-13-005) 항 체 공학의 실험실에.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약
1.0 M H3PO4FisherAC29570
1.0 M Tris, pH 8.0Invitrogen15568-025
10 mM ATPInvitrogen18330-019
100 mM dithiothreitolFisherBP172
100 mM dNTP dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 각각 25mM씩 함유하는GE 헬스케어28-4065-60
3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB)키르케고르 & Perry Laboratories Inc50-76-02
50X TAEInvitrogen24710030
AgaroseFisherBP160
Carbenicillin, carbSigmaC1389100 mg/mL in water,  0.22 μ M 필터 살균, 작업 농도 : 100 Μ g/mL입니다.
클로람페니콜, cmp시그마C0378에탄올 중 100mg/mL, 0.22 &μ; M 필터 살균, 작업 농도 : 10 Μ g/mL입니다.
EDTA 0.5 M, pH 8.0InvitrogenAM9620G
과립 한천VWRJ637-500G
H2O2 과산화효소 기질Kirkegaard & Perry Laboratories Inc50-65-02
K2HPO4Sigma795488
Kanamycin, kanFisherAC61129물에서 50 mg/mL,  0.22 μ M 필터 살균, 작업 농도 : 50 Μ g/mL입니다.
KH2PO4SigmaP2222
Na2HPO4Sigma94046
NaCl알파 AesarU19C015
NanodropFisherND2000C
NaOHFisherSS256! 주의 NaOH는 화상을 유발합니다.
무지방 분유, Sangon BiotechA600669
PEG-8000FisherBP233
단백질 A-HRP 접합체Invitrogen101123
QIAprep, Spin M13 키트Qiagen22704
QIAquick 젤 추출 키트,Qiagen28706
QIAquick PCR 정제 키트,Qiagen28104
재조합 단백질 LFisher77679
T4 DNA 중합효소New England BiolabsM0203S
T4 폴리뉴클레오티드 키나아제New England BiolabsM0201S
T7 DNA 중합효소New England BiolabsM0274S
테트라사이클린, tetSigmaT7660물에 있는 50 mg/mL, 0. 22 &뮤; M 필터 살균, 작업 농도 : 10 Μ g/mL입니다.
트립톤피셔0123-07-5
Tween-20SigmaP2287
초순수 글리세롤Invitrogen15514-011
UridineSigmaU375025 mg/mL in ethanol, 작업 농도: 0.25 μ g/mL입니다.
효모 추출물VWR DF0127-08
NameCompany 카탈로그 번호Comments
Strains
E.coli CJ236New England BiolabsE4141유전자형: dut-  웅<섭>-  thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). dU-ssDNA의 제조에 사용됩니다.
E.coli SS320Lucigen60512유전자형: [F'proAB+lacIq lacZΔ M15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ (araABC-leu)7679 &델타; lacX74 galUgalK rpsL thi. 고효율 전기천공법(electroporation) 및 사상(filamentous) 박테리오파지 생산에 최적화되어 있습니다.
M13KO7New England BiolabsN0315S
NameCompany 카탈로그 번호Comments
Equipment
0.2-cm 갭 전기천공법 큐벳BTX
96-well 2mL 딥웰 플레이트Fisher278743
96웰 맥시소프 면역플레이트Nunc151759
배플 플라스크,Corning
벤치탑 원심분리기Eppendorf5811000096
원심분리기 병,Nalgene
ECM-630 electroporator, BTX
Magnetic 교반 막대Nalgene
Thermo Fisher 원심분리기Fisher
고속 쉐이커TAITEKMBR-034P
마이크로플레이트 쉐이커QILINBEIERQB-9002
96 및 384웰용 리퀴드 핸들러RAININ
Mutil-channel 피펫RAININE4XLS
Amicon 농축기MerckUFC803096
용액을 혼합합니다., , , , , , , , , , ,

참고문헌

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