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방법 논문

재조합 콜라겐 나 세포 확장과 생물에 셀 납품 시스템으로 그들의 잠재적인 사용에 대 한 펩 티 드 Microcarriers 모델

7.5K 조회수

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DOI:

10.3791/57363

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2018년 2월 7일

 ,  ,  ,  , 

이 논문에서

요약

우리는 macroporous microcarriers에 셀 확장 프로토콜 및 decellularized 조직 매트릭스를 시드하 관류 생물에서 배달 시스템으로 그들의 사용을 제안 합니다. 우리는 또한 세포 증식 및 microcarriers에 경작 하는 세포의 생존 능력을 결정 하기 위해 다른 기술을 포함 합니다. 또한, 생물 반응 기 배양 후 세포의 기능을 설명합니다.

초록

조직 공학 유망 분야, 조직 및 장기 이식 목적에 대 한 수요 증가 대 한 솔루션 개발에 초점을 맞춘입니다. 같은 조직을 생성 하는 과정 복잡, 고 특정 세포 유형, 건설 기계, 및 세포 성장 및 분화를 안내를 물리적 또는 생 화 확 적인 자극의 적절 한 조합을 포함 한다. Microcarriers 셀에 3 차원 (3D) microenvironment, 이후 그들은 더 높은 표면에 볼륨 비율을 제공 하 고 더 밀접 하 게 전통적인 2 차원 방법에 비해 vivo에서 상황을 모방 확장 하는 매력적인 도구를 나타냅니다. 혈관 시스템, 세포에 산소와 양분을 공급 하 고 폐기물 제거, 조직 설계를 생성 하는 때 중요 한 빌딩 블록을 구성 합니다. 사실, 대부분 구조 혈관 지원 부족 인해 이식 되 고 후 실패 합니다. 이 연구에서 우리 스피너 플라스 크 및 생물 반응 기, 동적 조건 하에서 재조합 형 콜라겐 기반 microcarriers에 내 피 세포 확장에 대 한 프로토콜을 제시 하 고이 설정 세포 생존 능력 및 기능을 결정 하는 방법을 설명. 또한, 우리는 필요한 추가 분리 단계 없이 vascularization 목적 셀 배달 하는 방법을 제안합니다. 또한, 우리 decellularized 생물 매트릭스에 관류 생물에 잠재적인 셀 vascularization를 평가 하는 전략을 제공 합니다. 제시 방법의 사용 조직 엔지니어링 임상 연습에서 응용 프로그램의 큰 범위에 대 한 새로운 세포 기반 치료법의 발전으로 이어질 수 믿습니다.

서론

조직 공학 응용 프로그램에 하나의 일반적인 문제는 수익률 높은 세포 질량의 위치에서 올바른 차별화 표현 형을 필요. 이 문제를 해결 하려면 microcarriers의 응용 프로그램은 피부, 뼈, 연골, 힘 줄1의 대규모 세대에 대 한 정형 외과 조직 공학 분야에서 최신의 증가 함께 1967 년에 시작 했다. 그들은 허용 부착 문화의 처리 방법으로 현 탁 액 문화2 와 비슷한 미 3 차원 (3D) 기판에 셀을 확장 하 여. 그로 인하여 세포 균질 영양소 공급 및 세포-매트릭스 상호 작용 vivo에서3,4 차별화의 차원에서 시간이 지남에 따라 자주 분실 되는 더 나은 유지 보수를 리드5접근 경험. 결국 높은 수익률6,7셀, 높은 가스 이어지는 높은 표면 볼륨 비율-고 영양 환율 정적 시스템8, 규제 하 고 물리적 문화 주제 가능성에 비교 자극9, 그리고 잠재적인....

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프로토콜

hBMSCs 대 퇴 골 머리 대체 수술 관절염 환자의 대 퇴 골 머리에서 분리 했다. 절차는 뷔르츠부르크 대학의 로컬 윤리 위원회 및 환자의 동의의 승인 아래 수행 되었다. 기본 microvascular 내 피 세포 포 피 biopsies 청소년 기증자의 분리 했다. 그들의 법률 representative(s) 전체 동의 서 면을 제공합니다. 연구는 뷔르츠부르크 대학교 (182/10 투표)의 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.

1입니다. hBMSCs 및 HDMECs의 격리

  1. 인간 골 수 유래 중간 엽 stromal 세포 (hBMSCs)
    1. 메 마른 숟가락을 사용 하 여 대 퇴 골 머리에서 해 면 뼈를 제거 합니다.
      참고: 해 면 뼈는 단단하고 딱딱한 외피 뼈 내부 느슨하게 하 고 세분화 된 물질으로 나타납니다. 그것은 메스를 사용 하 여 외피 뼈에서 해 면 질 뼈의 스크래치 부분에 필요할 수 있습니다.
    2. 2 50 mL 튜브에 제거 해 면 뼈를 삽입 합니다. 해 면 뼈의 볼륨 엉덩이 교체 수술 동안 제거 된 대 퇴 골 머리의 크기에 따라 10 mL에 5에서 달라질 수 있습니다.
    3. DMEM-F12 (DMEM 및 햄의 F12 매체의 1:1 혼합물), 세척 매체의 약 30 mL와....

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결과

그림 1A에서 같이, 우리는 문화의 라이브/죽은 얼룩에 의해 결정 7 일 후 RCP microcarriers에 가능한 셀의 높은 수를 얻었다. 그 결과 완전히 식민지 화 microcarriers 숨 구멍, 분할 그들 (그림 1B)를 overgrowing 주위 관찰 되었다 SEM 분석에 의해 확인 되었다. 다른 한편으로, 없는 셀은 균등 하 게 시드되지 않습니다 실험 결과 여러 빈 microcarriers. 실패 한 실험 해서는 안 이상 총 셀 금액 (그림 1C)의 10%는 죽은 세포의 비정상적으로 높은 숫자를 특징 이다. 또한, HDMECs의 DNA 콘텐츠 정량화 시간 (그림 1D) dsDNA의 증가 보였다.

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토론

Microcarrier의 하나의 주요 목표는 필요의 위치로 셀을 전달 하기 위하여 그들의 차별화를 유지 하면서 세포의 확장입니다. 표현된 방법 소개 RCP microcarriers 세포 부착, 증식, 및 높은 세포 밀도 microcarriers 식민지를 수 있었다. 이 라이브/죽은 얼룩, 어떤 실행 가능한 세포의 90% 이상 검색만 몇 죽은 세포의 동적 문화 7 일 후 가져온 동안에 의해 관찰 되었다. 마찬가지로, SEM 이미지 셀 문화의 7 일 후에 microcarriers의 전체 표면을 커버 확인.

3D 모델에서 세포 생존을 보장 하기 위해, 그것은 세포에 산소와 양분의 공급을 유지 하 고 폐기물 물질의 제거를 허용 하는 것이 중요. 혈관에는 있는 내 피 세포 들은 혈관23의 안쪽 부분을 일렬로 세우는 세포 때문 핵심적인 역할을 담당할이 교환 과정의 책임 구조. 그들은 격 증, 마이그레이션, 준수, 새싹, 및

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이러한 결과 연구 자금에서 유럽 연합 7 번째 프레임 워크 프로그램 FP7/2007-2013 부여 계약 n ° 607051에서 (바이오 영감)을 받고 있다. SEM 분석에 대해 규 산 연구 ISC를 위한 RCP 제조, 프라 운 호퍼 연구소에서 베르너 Stracke 동안 기술 지원에 감사 반 Carolien Spreuwel-후 지 필름 제조 유럽 변환기에서 Goossens 하 고.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT)Serva Electrophoresis GmbH20395.01
4',6-디아미디노-2-페닐린돌디하이드로클로라이드 (DAPI)시그마-알드리치D9542
아세트산 100%시그마-알드리치533,001
분석 저울 Kern EG 2200-2NMKern & Sohn GmbH
Ascorbate-2-phosphateSigma-AldrichA8960
BioreactorChair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 뷔르츠부르크, 독일
명시야 현미경 Axiovert 40CCarl Zeiss AG
CellnestFujifilm
Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL)Greiner Bio-One
콜라겐 R 용액 0,4%Serva Electrophoresis GmbH47254.01
DMEM-F12Gibco11320-033
Dulbecco's Phosphate 완충 식염수Sigma-AldrichD8537변형, 염화칼슘 및 염화마그네슘 없음
Eosin 1%Morphisto10177.01000
에탄올 96%Carl Roth GmbHT171.4변성
태아 송아지 혈청 (FCS)Bio& FCS를 판매합니다. ADD.0500열 비활성화되지 않음
형광 현미경 BZ-9000Keyence
HaematoxylinMorphisto10231.01000
HexamethyldisilazaneSigma-Aldrich440191시약 등급, ≥ 99%
생물반응기용 인큐베이터뷔르츠부르크
라이브/데드 셀 이중 염색 키트Fluka04511KT-F
자기 교반기 플레이트2Mag80002
매체 199Sigma-AldrichM065010X
마이크로플레이트 리더
Tecan Infinite M200
Tecan
바늘 21G 16mmVWR613-5389
파파야 라텍스에서 추출한 파파인Sigma-AldrichP4762동결건조 분말, ≥ 10 units/mg 단백질
파라Carl Roth GmbH6642.6
페니실린/스트렙토마이신Sigma-AldrichP4333
연동 펌프Ismatec
Quanti-iT PicoGreen dsDNA 분석 키트, Thermo Fischer ScientificP7589
Histofix 4%Carl Roth GmbHP087
주사 전자 현미경 Supra 25Carl Zeiss AG
수산화나트륨 용액 1.0 NSigma-AldrichS2770
스피너 플라스크(25mL)Wheaton356879
주사기 1mLVWR720-2561
조직 배양 플라스크 (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2)TPP Techno Plastik Products AG
Trypan blue 0.4%Sigma-AldrichT8154
VascuLife VEGF-MvLifeline cell technologyLL-0005
독일 조직 공학 및 재생 의학 의장핀

참고문헌

  1. Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic. 3 (2), Translation 51-57 (2015).
  2. Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins. Methods ....

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