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방법 논문

급속 한 비보에 평가 보조의 세포 독성 T 림프 톨 생성 기능의 백신 개발에 대 한

7.8K 조회수

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DOI:

10.3791/57401

⸱

2018년 6월 19일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Vaccinology and Applied Microbiology, Helmholtz Centre for Infection Research

이 논문에서

요약

선물이 여기 표준 면역학 기술에 대 한 응용 프로그램 (CFSE 스테인드 OT-내가 확산) 빠르게 보조 중재 된 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 세대를 모니터링 하기 위한 vivo에서. 이 빠른 CTL 용량 추정 세포내 병원 체에 대 한 예방 백신으로 치료 암 백신의 개발에 대 한 유용합니다.

초록

현대 소 단위 백신의 평가의 중화 항 체 생성은 중요 하지만 보조 선택에 대 한 충분 한 보여준다. 따라서, 세포 독성 T 세포 (CTL) 응답을 홍보할 수 있는 체액과 세포 면역 물질로 기능 adjuvants 절실히 필요 합니다. 따라서, 크로스 못쓰게 유도 하 고 이후 CTL 세대 강화 보조 후보자의 충실 한 모니터링 백신 개발에 중요 한 단계를 나타냅니다. 여기에 우리는 SIINFEKL 전용을 사용 하는 방법에 대 한 응용 프로그램을 제시 (OT-나)는 크로스-프레 젠 테이 션 모델 항 ovalbumin (OVA)는 비보에 다른 보조 후보자의 존재를 모니터링 하는 T 세포. 이 메서드는 adjuvants 최고의 크로스 못쓰게 기능을 선택 하는 빠른 테스트를 나타냅니다. CD8 확산+ T 세포 간 못쓰게의 가장 중요 한 표시 이며 그것은 또한 보조 유도 크로스-프레 젠 테이 션의 상관으로 간주 된다. 이 기능은 림프절과 비장 같은 다른 면역 기관에 평가할 수 있습니다. CTL의 정도 모니터링할 수 있습니다, 따라서 로컬의 특성에 통찰력을 주는 (주로 림프절 배수) 또는 조직의 반응 (먼 파선 또는 비장). 이 기술은 더 또한 종래와 유전자 변형 쥐의 다른 긴장에 사용 될 가능성을 제공 하 고 특정 크로스-프레 젠 테이 션 경로 억제할 수 있는 약물 테스트에 대 한 여러 수정 수 있습니다. 요약 하자면, 우리는 여기에 제시 하는 응용 프로그램 개발 하거나 백신 연구와 개발에 대 한 화학 adjuvants 수정 업계 또는 학계에서 백신 연구소에 대 한 유용할 것 이다.

서론

세포 독성 T 세포 (CTL) 유도 하는 백신은 주요 치료 개입 싸움 암1의 특정 유형을 위해 개발 되었습니다. CTL은 또한 세포내 병원 체2에 대 한 예방 백신에 대 한 중요 합니다. 또한, CTL 누구 또한 초기 생활 감염5에 대처 하기 위해 CTL에 따라 신생아3,4 등 위험 인구에 기능적으로 활성 몇 면역 방어 메커니즘 중 하나입니다. 이와 관련, 백신 호흡 Syncytial 바이러스 (RSV)에 대 한 CTL 응답 (졸업생)을 유도 하지 않는 한 보조 제와 함께 개발 된 유아6에 감염 시 심각한 합병증에 지도 하는 백신의 완전 한 실패 귀착되는. 예방 접종의 이러한 부정적인 효과 CD8에 의해 반전 될 수 있다+ T 세포 응답7. 우리는 이전 인터페론 유전자 (스 팅) 주 작동 근의 어떤 자극에 의해 elicited (유형 I interferons) 주요 cytokines의 확산을 측정 하 여 일부 이러한 adjuvants8에 의해 생성 된 CTL 응답 필수적입니다 증명 하고있다 오티-예방 접종 및 기능을 유도 하는 CTL의 관찰에서 이러한 결과 사용 하 여 확장 예방 접종 일정9후 나 T 세포. OT의 확산의 측정-난 CD8+ T 세포는 야생 타입 (WT) C57BL/6 받는 사람 마우스 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE) 염료 희석은 생성 하는 백신의 보조 능력의 강력한 추정 크로스-SIINFEKL, (ovalbumin, OVA의 면역 지배 펩타이드)의 프라이 밍 이 기술은 OT의 확산의 평가 위해 널리 이용 된다-내가 CD8+ 및 OT II CD4+ T 세포. 예를 들어 그것은 WT 동물에서 항 원 리콜 후 백신 효능을 측정 하거나 선택한 cytokines (코 쥐)의 부재에 사용 되었습니다. CFSE 스테인드 OT의 수동 전송 후 짧은 프로토콜 (실험 4 일)는 고안-난 CD8+ T 세포, 50의 1 개의 복용량의 구성 된 피하 (사우스 캐롤라이나) 면역 테스트 adjuvants 보충도 없는 OVA의 µ g 관리 (그림 1)입니다. 예방 접종 후 48 h 결과의 후속 CTL 응답을 생성 하는 보조의 용량의 신뢰할 수 있는 증거를 제공 한다. 이 전략에 의해 비장 (또는 먼 림프절) CTL 활동을 측정 하 여 응답의 범위 뿐만 아니라 예방 접종 후 배출 림프 노드의 로컬 면역 반응의 힘을 평가 가능 하다.

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프로토콜

이 연구에 사용 된 모든 마우스 C57BL/6 배경에서 했다. 모든 동물 병원 체 자유로운 조건에서 유지 했다. 모든 실험은 (TierSchG BGBl 독일 동물 보호 법률의 규범에 따르면 수행 했다. 내가 S 1105; 25.05.1998) 허가 번호 33.4-42502-04-13/1281 및 162280에서 색 소니의 낮은 위원회 동물 실험의 윤리 및 국가 사무실 (낮은 색 소니 국가 사무실의 소비자 보호 및 식품 안전)에 의해 승인 했다.

1. CFSE OT의 얼룩-나 T 세포와 입양 전송

참고: OT-난 마우스 transgenically 생성된 동물 고정된 α와 β 사슬 함께 OVA의 면역 지배 펩 티 드를 인식 하는 T 세포 수용 체 (TCR)를 표현 하는 SIINFEKL10,11. 결과적으로, 이러한 마우스 수가 상당히 높은 SIINFEKL 전용 CD8+ T 세포 (97%)12 13정상 또는 OVA-예방 접종을 마우스 (≤ 1%) 비해.

  1. 추적 CD8의 절연 OT에서+ T 세포-나 쥐 T 림프 구 특정은 Thy1는는 (Thy1.1) 대립 유전자 표현:
    1. 6-9 주 된 OT를 안락사-나 CO2 흡입에 의해 쥐 뒤에 자 궁 경부 전위14. 피부 외과 플라이어 집게의 도움으로 몸에서 피부를 분리 수술가 위로 절단 하 여 비장 및 주요 림프절 (사 타 구니, 겨드랑이, 자 궁 경부 쌍만) 해 부 고에 넣어 접시 (60 x 15 m m) 각각 포함 하는 100 µ m 기 공 메쉬 컵 조직 연 삭 및 셀 릴리스에 대 한.
    2. 얼음에 있는 완전 한 RPMI 매체 (RPMI 1640, 10 %v / v, FCS 100 U/mL 페니실린, 50 µ g/mL 스)의 3-5 ml 접시 (각각 하나의 메쉬 컵)를 유지 합니다.
    3. 주사기 나 비슷한 무 균 악기의 도움으로 장기 매 시 (사전 절단 불필요) 15 mL 원심 분리기 튜브에 결과 단일 세포 현 탁 액을 수집.
    4. 300 x g 4 ° c.에서 10 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심 폐기는 상쾌한. 원심 분리에 의해 차가운 PBS의 10 mL에 세포를 세척 하 고 다시 염화 암모늄 버퍼 (ACK 버퍼, 상용)의 1 mL/비장에 펠 릿을 일시 중단 하 여 비장에서 적혈구를 lyse. 얼음에 1.5 분에 대 한 셀을 품 어 하 고 이후 원심 분리 (으로 이전)에 의해 차가운 PBS의 10 mL로 세포를 씻어.
    5. 다시 1 ml의 PBS (pH 7.2) 포함 5% 태아 둔감 한 혈 청 자석 절연에 대 한 같은 튜브에 펠 릿을 일시 중단 합니다.
  2. 마그네틱 격리를 수행 하려면 CD8의 부정적인 선택을 진행+ T 제조업체 지침에 따라 자기 절연 키트를 사용 하 여 셀 또는 프로토콜15게시.
  3. CFSE 얼룩을 수행 하려면 먼저 CD8 수 계산+ T 세포 OT에서 얻은-난 자동된 셀 카운터 (입자 카운터)를 사용 하 여 마우스. 1-5 107 셀/mL 15 ml 송 골 매 관에 빛에서 보호 하는 37 ° C에서 7 분 5 µ M PBS에 CFSE와 1-5 mL의 볼륨에 배 얼룩.
  4. CFSE는 세포를 소 태아 혈 청의 같은 볼륨 (1:1)를 추가 하 여 얼룩을 냉각 하 고 빛 으로부터 보호 하는 37 ° C에서 추가적인 7 분에 대 한 그들을 품 어. PBS의 10 mL와 함께 셀을 두 번 세척.
  5. 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 3-5 100 µ L에 106 셀/마우스 배를 정 맥 주사 3-5 107 셀/mL PBS의 배을 셀 수 설정 (i.v.) 꼬리 정 맥을 통해.
  6. 꼬리 정 맥 주사를 수행 하려면 적절 한 restrainers에 마우스를 고정. 다시 영역 및 쥐 꼬리 정 맥 혈관 확장을 허용 하도록 1-3 분 거리 20 ~ 25 cm 사이 붉은 빛 램프를 사용 하 여 주입에 쥐의 꼬리를 따뜻한.
    참고:이 쉽게 정 맥 검색 및 세포 현 탁 액의 관리에 도움이 됩니다.
  7. (손으로 쥐와 램프 사이 배치) 확인 그것 너무 쥐에 대 한 뜨거운 고 꼬리 정 맥 명확 하 게 표시 될 때, 주입은. 셀 25 게이지 바늘161 mL 주사기를 사용 하 여 측면 또는 지 느 러 미 꼬리 정 맥에 주사.

2. 예방접종 (보조 + OVA도 무료)

  1. OT와 이식 생쥐를 배치-마 취 챔버 (1.7, 그림 1단계) 세포와 산소에서 isoflurane 마 취 기계14에 의해 관리.
  2. 마우스 마 취에서 완전히 잠들 때, 약 실에서 그것을 꺼내와 gluteus superficialis (측면 허리)를 통해 깨끗 한 주사를 수행 하기 위해 전기 머리 트리밍 기계를 사용 하 여 영역에 마우스의 모피를 면도 와 응용 분야의 좋은 보기.
  3. 백신, 25 게이지 바늘을 사용 하 여 면도 영역에 사우스 캐롤라이나의 50 µ L을 주입.

3. 림프 톨 및 흐름 Cytometry 분석에 대 한 얼룩의 격리

  1. 림프 톨 및 splenocytes의 격리
    1. 뒤에 자 궁 경부 전위 공동2 흡입에 의해 예방 접종된 마우스를 안락사.
    2. 배출 및 먼 림프절과 비장 추출 하 고 조직 연 삭 및 셀 출시 100 µ m 기 공 메쉬 컵 포함 된 별도 접시에 그들을 배치. 1.1.3 통해 1.1.2 단계.
    3. 원심 분리 후에 상쾌한 가만히 따르다와 다시 셀 펠 릿 잔해 PBS의 동일한 볼륨에 (약 100 µ L) 일시 중단.
  2. 교류 cytometry 분석에 대 한 얼룩
    1. 15 mL 원심 분리기 튜브에 표 1에 표시 된 농도에서 착 항 체를 포함 하는 마스터 믹스를 준비, 얼룩 믹스 집중 따라서 2 x 열매를 산출. 샘플 당 100 µ L를 마스터 믹스의 충분 한 볼륨을 준비 합니다. 셀 및 마스터 혼합 1:1 혼합 하 고 30 분 동안 4 ° C에서 품 어.
      참고: 샘플 당 최종 착 볼륨 200 µ L (항 체 마스터 믹스의 셀 릿 + 100 µ L의 100 µ L) 이어야 한다.
    2. 1.1.3, PBS의 10 mL를 두 번 추가에 설명 된 대로 셀 원심 분리에 의해 두 번 세척.
    3. 다시 0.5-1에 얼룩진된 셀 중단 수집 및 전송 중단 교류 cytometer 튜브에 대 한 PBS의 mL. 항상 얼음 샘플을 유지 하 고 빛 으로부터 보호.

4. Cytometry

  1. 항상 사전에 70-100 µ m 필터를 사용 하 여 셀 샘플 필터.
  2. 표 1 (구슬 또는 셀)에 대 한 자세한 fluorophores에 대 한 하나의 얼룩 보상 컨트롤을 준비 합니다.
    참고: 보상 한다 cytometer 또는 분석 소프트웨어17,,1819 에서 수행 되며 모든 샘플에 적용.
  3. 그림2 제어 전략을 따릅니다. 앞으로 피해 지역 (그림 2A), 그리고 다시 사이드 분산형 및 측면 분산형 영역 (특수, 그림 2B) 남자를 제외 하려면 넓은 대 앞으로 살포 높이에 짧게, 게이트 인구.
  4. 문 사실 CFSE 차별을 위해 BV 650 (자동-형광) FITC (CFSE) 대를 그려서 그림 2B 에서 인구 스테인드 높은 자동 형광 세포에서 세포. 구슬 또는 보상 컨트롤로 BV 650에 활용 된 항 체로 얼룩진 셀을 포함 합니다. 이 그림 (그림 2C) FITC 대 BV 650의 OT 게이트 하는 데 사용 됩니다-난 CFSE 셀 스테인드.
  5. 받는 사람 마우스 대 기증자에서 파생 된 세포를 구별 하기 위해 APC (CD8) 대 Pe-Cy7 (Thy1.1-CD90.1-)에 대 한 그림 2 C 에서 인구를 게이트.
    참고: 셀 OT에서 파생 된-난 기증자 마우스는 Thy1.1+ (CD90.1), 반면 WT (C57BL/6, 받는 사람) 마우스 파생 셀 Thy1.2+ (CD90.2) (그림 2D). 일부 연구소는 OT-난 Thy1.2 배경과 WT (C57BL/6)는 Thy1.1에 있는 쥐. 오티에 대 한 Thy1.2에 대 한 항 체를 사용 해야 하는 경우에-게이팅 셀.
  6. 다시 CD8 게이트+ BV 450 (CD4)를 구성 하는 게이트에 APC (CD8) 대 그것을 그려서 Thy1.1+ 인구에서 세포 (그림 2E).
  7. 인구는 CD8의 막대 그래프 디스플레이 사용 하 여 그림 2E 에 문이 표시+ (FITC, 530/15 채널-블루 레이저-), CFSE를 보여주는 셀 게이트 증식된 인구 10에서 농도 포함 하 여 수준2 곳 전적인된 제어 (농도 10 ~5, CFSE 얼룩이 지 고 교류 cytometer에서 전압 설정의 효능에 따라)는 (그림 2F).
  8. 죽은 세포 확산 평가를 병행 평가 추가 게이트 (그림 2에에서는 표시 되지 않음) 플로팅 FITC 대 L/D 마커 (450/20 채널, UV 레이저)를 확인 합니다.
  9. 취득 보상 컨트롤에 대 한 적어도 5000 이벤트 및 교류 cytometer에서 샘플에서 10.000 이벤트 (게이트 E, 그림 2). 낮은 또는 중간 흐름에는 cytometer 실행 (20.000 이벤트/s의 유량을 초과 하지 않는).

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결과

Adjuvants (ADJ1 및 ADJ2)의 다른 조합을 사용 하 여 치료를 테스트 하려면 우리 adoptively 전송된 OT의 확산을 측정 하 여 CTL 세대 용량 평가-내가 CD8 cytometry (그림 2)에 의해+ T 세포. 이 위해, 우리는 이전 배출 림프절과 비장 (표 1)에서 격리 된 셀 스테인드. CD8의 확산을 측정 하 여 림프절과 비장,+ T 세포는 CTL 세대 고용량 ADJ2의 배수 림프절 (그림 3)에 비교 될 때 ADJ1, OVA 혼자 또는 PBS 컨트롤 확증 수 있었습니다. 반면, 우리는 관찰 ADJ2 조직 (비장)에 CTL 응답을 생성 하지 못했습니다, 반면 ADJ1 비장 CD8에 의해 확산의 표시 높은 수준의+ T 세포, 하지만 하지만 또한 우수...

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토론

현대 백신은 이상적으로 composedof 정화 항 리, 바이러스 같은 입자, 나노 입자 또는 라이브 벡터 처럼 전달 시스템의 가능한 추가 adjuvants. 백신을 디자인할 때 중요 한 부분은 임상 필요에 따라 올바른 보조 제를 선택 하는. 범위에 속하는 체액 세포 면역 응답 (또는 둘 다) 대, 조직의 면역 반응 (또는 둘 다), 대 로컬의 선거 및 백신 대상 모집단에 생성 해야 하는 메모리의 종류를 선호 포함할 수 있었다. 보조 평가의 1 개의 중요 한 양상은 빠르게 CTL을 생성 하는 용량을 결정 하는. 우리 여기에 급속 하 게 OT를 측정 하 여는 CTL 응답에서 vivo에서 마우스 모델에서의 기능을 결정을 이미 알려진된 기술에 기반 하는 방법 제시-난 CD8 T 세포 확산. 이 방법은 수 adjuvants 여 elicited 면역 반응의 힘의 예측에 대 한 (OT의 확산-내가 T 셀)만 4 작업 일에. 이 방법은 더 이상 adjuvants 면역 반응 (전신 대 로컬) 측면에서 행동 및 그것의 효과적인 ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리는 우리의 기술 도우미에 게 빚을: 미국 형제와 H. Shkarlet, 실험 절차 동안 우리를 도운. 이 작품은 EU 보조금 (UniVax, 계약 번호 601738, 및 TRANSVAC2, 계약 번호 730964), 및 헬름홀츠 협회 부여 (하이-IDR)에 의해 부분적으로 투자 되었다. 자금 출처 조사에 영향을 주지 않았다 디자인, 원고 또는 게시를 위해 제출 하는 결정의 세대.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BD LSR Fortessa 세포 분석기BD특별 주문유세포 분석기
CFSE분자 프로브C34554Proliferation Dye
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation KitBiolegend480007Magnetic Isolation Beads and Antibodies for negative selection of untouched CD8 T cell.
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, UV excitation MolecularProbesL23105Dead Cell Marker
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal 항체 (HIS51), PE-Cyanine7eBioscience25-0900-82항체
APC anti-mouse CD8a 항체BioLegend100712항체
BV421 Rat Anti-Mouse CD4BD740007항체
Z2 coulter 입자 수와 크기 해석기Beckman Coulter9914591DA세포 카운터. Z2 자동 입자/세포 계수기
EndoGrade Ovalbumin (10 mg)Hyglos(독일)321000Ovalbumin 내독소 무료 테스트 완료.
세포 스트레이너 100µ m 나일론Corning352360셀 스트레이너(100 &마이크로; M 모공 메쉬 컵).
샘플 바이알Beckman Coulter899366014Z2 자동 카운터
C57BL/6 마우스(CD90.2)Harlan(Rossdorf, 독일)Company는 이제 Envigo
OT-I(C57BL/6 배경, CD90.1)Harlan(Rossdorf, 독일)우리 동물 시설에서 근친 교배입니다. Envigo FACS 튜브를 요청한 회사는 현재
Fischer (Corning)14-959-5Corning Falcon Round-Bottom 폴리스티렌 튜브
Falcon 15 mL 튜브Fischer (Corning)05-527-90Falcon 15mL 원추형 원심분리기 튜브
PBS (500 mL)Fischer (Gibco)20-012-027Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2
Red lamp (heating lamp)Dirk Rossmann GmbH (독일)405096가열 infrred 램프 (100 와트)
IsoFlo (Isoflurane)Abbott Laboratories (미국)5260.04-05.이소플루란 마취제(250mL 플라스크).
CO2 흡수기가 있는 탁상용 마취 기계/모바일 마취 기계Parkland ScientificV3000PKIsoflurane 마취 기계.
RPMI 1640 배지Gibco (ThermoFischer에서 배포)11-875-093기본 배지 글루타민(500mL)
펜 스트렙트 항생제 용액(Gibco)Gibco(ThermoFischer에서 배포)15-140-148Gibco 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)
태아 보빈 혈청(Gibco)Gibco(ThermoFischer에서 배포)10082147소 태아 혈청, 인증, 열 비활성화, 미국 원산지
ACK 용해 완충액 (100 ml)Gibco (ThermoFischer에서 배포)A1049201염화 칼륨 (ACK) 전혈 용해 버퍼, 비장 현탁액의 적혈구 용해에 적합
플라스틱 페트리 접시Nunc (ThermoFischer에서 배포)15034060 x 15mm 플라스틱 페트리 접시, 비처리
세포 덩어리 필터CellTrics (Sysmex)04-004-2317셀트릭스® 50 &뮤; M, 멸균
용 샘플 바이알

참고문헌

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