인간의 질병과 관련 된 유전자 변종 발견 될 하기 시작, 그것은 점점 더 빠르게 그 확인 된 이체의 생물학적 의미를 평가 하는 시스템을 개발 하는 것이 중요 되고있다. 이 프로토콜에는 인간 유전자 기능 여성 감수 분열 동안 마우스 oocytes를 사용 하 여 나로 평가 하는 방법을 설명 합니다.
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방법 논문
감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
배아 이수성은 인간에서 불모의 주요 유전 원인입니다. 이러한 이벤트의 대부분 여성 감수 분열 동안 시작 하며 나이 혼자 항상 aneuploid 배아 생성의 위험 예측은 긍정적으로 산 모 나이 상관, 이기는 하지만. 따라서, 유전자 변형 oogenesis 동안 잘못 된 염색체 분리에 대 한 계정 수 있습니다. 인간의 oocytes에 대 한 액세스는 제한 된 연구 목적을 위해, 분석 실험의 시리즈 마우스 oocytes를 사용 하 여 내가 감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 공부에 개발 되었다. 첫째, 유전자 및 유전자 변형 관심의 메신저 RNA (mRNA) 의향 나 체포 마우스 oocytes에 microinjected 있다. 후 식에 대 한 시간을 허용, oocytes 동기적으로 감수 분열을 완료 meiotic 성숙에 출시 되 나. 형광 기자, 녹색 형광 단백질 (Gfp) 등의 순서로 mRNA에 태그를 추가 하 여 인간의 단백질의 지역화 phenotypic 변경 뿐만 아니라 평가 수 있습니다. 예를 들어 이득 또는 기능의 손실 meiotic 오류를 해결 하기 위해 유전자 제품에 도전 하는 실험 조건을 설정 하 여 조사 수 있습니다. 이 시스템은 유리한 oogenesis 동안 인간의 단백질 기능을 조사, 결과의 적절 한 해석 이루어져야 한다 단백질 표정은 내 생 수준에서 그에 주어진 고 (즉, 절에 대 한 제어 하지 않는 한 밖으로 또는 아래로), murine homologs 시스템에 있습니다.
서론
불 임은 재생산 나이 1에서 거의 절반 추구 치료 2인간의 인구의 10-15%에 영향을 미치는 조건이 다. 많은 경우 multifactorial 및 불 임 증의 병 인은 다양 한 인간에서 가장 흔한 유전 이상이 배아 이수성 3입니다. 이수성은 염색체 셀에 올바른 수의 편차 (이득 또는 손실)로 정의 됩니다. 인간 태아의 이수성의 현상 일반적 이며 진보 된 임산부 나이 4,5증가. 이 전략 증가 주입 속도, 낮은 유산 률과에 대 한 짧은 시간에 결과 때문에 자 궁 전송만 chromosomally 정상 (euploid) 배아 선택의 혜택을 강조 하는 4 개의 무작위 통제 실험 임신 6,7,,89를 달성. 따라서, 도움된을 재생산에 중요 한 의미를 가질 수 있습니다 인간의 이수성의 병 인을 이해.
Aneuploidies에 대 한 사전 주입 유전자 검사 하는 것이 불 임 치료에 도움이 있지만 aneuploidies 시작 하는 방법에 대 한 철저 한 이해는 여전히 부족 한. 그러나 Meiotic aneuploidies (생식 체 생산 동안 유래)와 산 모 나이,, 일부 여성 현재 배아 이수성 속도 그들의 주어진된 나이 4에 대 한 평균 속도에서 이탈 하는 긍정적인 상관관계가 있다는 것을 널리 받아들여진다. 이러한 경우는 혼자 나이 항상 aneuploid 배아 생성의 위험 예측 하지 것이 좋습니다. 다른 요인 배아 이수성, 유전자 변형 등의 위험 증가에 역할을 재생할 수 있습니다.
빠르게 meiotic 유전자 기능을 평가 하는 시스템 설계 조사 oocyte 감수 분열 동안 이수성을 유전자 이체의 잠재적인 기여의 핵심 요소가입니다. 윤리적 제약 및 제한 된 액세스, 인간의 계란을 사용 하 여이 실험을 수행 하는 실용적입니다. 마우스 oocytes를 사용 하 여 이러한 문제를 피할 수 있으며 여기 감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 분석 실험의 시리즈 나 설명. 관심사의 유전자 변형에 대 한 코딩 하는 메신저 RNA (mRNA) microinjecting에 의해 마우스 달걀에서 인간 단백질의 지역화 시각 고 수 경우는 야생 형 및 돌연변이 인간 단백질의 소성 식에서 결과 확인 하는 데 사용 이수성 이어질 수 있는 phenotypic 변경 Kinetochore 그리고 중요 한 것은 감수 분열 나의 분열에서 염색체 맞춤 지원 못하는 동생에 게 부적 절 한에 연결 하는 microtubules에 증가 포함 하는이 고기, 이득 및 기능의 상실을 조사 하이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 도전 oocyte 감수 분열의 키 이벤트와 같은 특정 실험 조건 설정 하 여 유전 이체는 건물 및 염색체 정렬 10스핀 들.
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프로토콜
1. 분자 클로닝
- 관심과 전사 (pIVT) 벡터11 생체 외에서 플라스 미드의 유전자의 전체 길이 코딩 시퀀스를 가져옵니다.
참고: 전장 cDNA 클론 상업적으로 다양 한 공급 업체에서 제공 또는 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (RT-PCR)을 통해 생성 될 수 있습니다. 생물 공학 정보 (NCBI) 온라인 리소스에 대 한 국립 센터는 뉴클레오티드에서 유전자에 대 한 사본을 시퀀스를 제공 합니다 및 명시적 시퀀스 태그 (EST) 데이터베이스. 단백질의 용이성에 대 한 시각화 및 분석 식 수준, 녹색 형광 단백질 (Gfp)를 융합 또는 다른 적합 한 형광 태그의 복제 전략에 원하는 수 있습니다. - 유효한 복제 전략을 사용 하 여, pIVT의 다중 복제 영역에 관심사의 유전자의 코딩 순서를 삽입 합니다. 분자 클로닝의 자세한 설명 및 필요한 단계는 이전 설명된 12왔다 합니다.
참고: 유전자 융합 제품 생성 해야 하는 복제를 사용 하는 경우 적절 한 독서 프레임입니다. - 순서를 올바른 유전자 삽입, 적절 한 프레임에 융합, 그리고 아무 중 합 효소 유도 점 돌연변이 생성 된 Globin 뇌관을 사용 하 여 구문.
참고: 생어 DNA 시퀀싱 장비를 사용할 수 없는 경우 많은 기업 저가 DNA 시퀀싱 옵션을 제공 합니다. - 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp) 또는 삽입/삭제 (INDELS) 생성 하는 경우 DNA를 mutagenize. DNA mutagenesis 단계 1.5-1.7 아래에 설명 되어 있습니다. 야생-타입 구문에 대 한 선형화 단계 1.7 진행.
- Mutagenesis 뇌관을 디자인 하 고 제조 업체의 프로토콜 당 돌연변이 구문을 생성 하 mutagenesis PCR 반응 완료. 사이트 감독 mutagenesis PCR 중재는 앞에서 설명한 13되었습니다. 또한, 많은 회사는 프로토콜을 포함 하는 사이트 지시 된 mutagenesis 키트를 제공 합니다.
- Mutagenized DNA 세균성 호스트 변환. 분리 하 고 순화 하는 플라스 미드.
참고: 많은 회사 확인 키트 쉽게 격리 하 고 플라스 미드 DNA를 정화 하는 데 사용할 수 있습니다. 그에 따라 제조 업체 프로토콜을 따릅니다. 대장균같은 그램 음성 세균성 긴장을 사용 하는 경우 독을 제거 하는 키트를 사용 하는 것이 좋습니다. - 표준 생어 DNA 시퀀싱을 사용 하 여 원하는 SNP 나 INDEL의 소개를 확인 하는 세균성 transformants에서 고립 된 DNA 순서.
- 순화 된 DNA의 단일 제한 효소 소화를 사용 하 여 최종 제품 선형화
참고: pIVT 벡터에는 여러 단일 효소 Addgene 14에 플라스 미드 지도에 나열 된 사이트 컷이 포함 되어 있습니다. - 제품 agarose 젤 전기 이동 법을 통해 선형 인지 확인 합니다. Agarose 젤 전기 이동 법에 대 한 방법론 이전 정의 14되었습니다.
참고: 모든 나머지 단계를 사용 하 여 장벽 (필터) 피펫으로 팁과 RNase 자유 자재 안정적이 고 높은 품질 RNA의 생산을 위해. - 유효성이 검사 된 DNA 정리 프로토콜 또는 키트를 사용 하 여 소화 제품을 정화 하 고 30 µ L RNase/DNase 무료 물에 elute.
참고: 열 기반 장비 높은 품질을 위해 권장 하는 실리 카 매트릭스 스핀 DNA 정화. 그에 따라 제조 업체 프로토콜을 따릅니다. - 시험관에서 DNA 제조 업체의 프로토콜을 따르고 T7 중 합 효소를 사용 하 여 녹음.
- 정화 하 고 RNA RNase/DNase 무료 물 실리 카 매트릭스의 스핀 열 기반 핵 산 정화 키트 다음 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여 30 µ L에 elute.
- 변성 agarose 젤 전기 이동 법 최종 RNA 제품 크기를 확인 하는 포름알데히드를 사용 하 여 수행 합니다. 1.13-1.22 14아래 단계를 참조 하십시오. (그림 1)입니다.
- 해산 때까지 물 72 mL에 1 g agarose를가 열 하 여 젤을 준비 다음 60 ° c에 냉각
- 10 X MOPS 0.4 M MOPS (pH 7.0), 아세트산 나트륨 0.1 M, 0.01 M EDTA를 추가 하 여 버퍼를 실행을 준비 합니다.
- 10 X MOPS 실행 버퍼, 그리고 37% 포름알데히드 (12.3 M)의 18 mL 냉각된 agarose 솔루션의 10 mL를 추가 합니다.
- 젤 젤 형성 컨테이너에 agarose 솔루션을 붓는 의해 계급. 충분히 10 µ L 큰 빗을 사용 합니다. 젤 설정 터치 회사를 후 부드럽게 빗을 제거 합니다.
- 젤 전기 이동 법 탱크에 조립 하 고 충분 한 1 X MOPS 버퍼, 실행 젤 완전히 덮여 보장을 추가 합니다.
- 0.5 X 양의 포름알데히드 포함 된 로드 염료에 RNA의 1 µ g을 추가 하 여 RNA 샘플을 준비 합니다.
- 10 µ g/mL의 농도에서 RNA 솔루션 ethidium 평범한 사람을 추가 합니다.
- 5 분 동안 70 ° C에서 RNA 샘플 솔루션 변성
- 살 균을 사용 하 여, 10 µ L 필터 팁, 분자량 마커의 5 µ L을 로드 하 고 RNA의 5 µ L 젤의 별도 우물으로 sample(s) 될 때까지 염료가 젤의 길이의 2/3 이상 5 V/cm에 electrophorese.
- UV 트랜스 조명 기에 젤에 RNA를 시각화 합니다. RNA 분자 무게 마커를 비교 하 여 올바른 크기 인지 확인 합니다.
- 농도 및 RNA의 순도 측정, UV 분 광 광도 계에 무 균 10 µ L 필터 팁을 사용 하 여 순화 된 RNA의 1.2 µ L를 전송 합니다.
참고 높은 품질 RNA A260/280 (1.8-2.2)와 260/230의 흡 광도 비율 있어야 (> 1.7) 각각. - 살 균 0.5 µ L 원심 분리기 튜브 (3-5 µ L/튜브)로 10 µ L 필터 팁, aliquot 잔여 순화 된 RNA를 사용합니다. Microinjection에 대 한 준비까지-80 ° C에서 튜브를 저장 합니다.
참고: 500 ng / µ L의 최종 주입 농도 최적의 출발점입니다. 1:2 RNase H20 microinjection microinjection 피 펫에서 RNA의 끈 적 거 림을 줄이기 위해 이전 무료 RNA를 희석 하는 것이 좋습니다.
2. kinetochore-Microtubule 첨부 파일 분석 결과
- Microinjection에 대 한 동등한 그룹으로 oocytes를 나눕니다.
참고: Oocyte 수집, 전송, microinjection, 및 meiotic 성숙 설명 하고있다 정돈에 자세히 이전 15. - 실험적인 mRNA와 하나의 그룹과 WT 제어 및 PBS 또는 Gfp 다른 그룹 microinject mRNA.
참고: 500 ng / µ L 10권장된 주입 농도 이다. 주입 양을 제어 하는 picoinjector는 사용할 수 있습니다. 5-10 pL의 주입 볼륨 15것이 좋습니다. - 손 또는 입 어디 유리 플라스틱 개방 운영된 pipetting 기구는 약간 사용 하는 oocyte (100-150 µ m), 페 트리 접시에 milrinone 무료 문화 매체의 100 µ L 드롭으로 전송 oocytes의 직경 보다 큰 덮여 배아 품질 미네랄 오일 그리고 5% C02 감수 분열의 분열에 충분 한 성숙 수 있도록에서 37 ° C에서 7 h oocytes를 품 어 난 (내가 만난) 15.
- 위의 동일한 피 펫 장치를 사용 하 여 부 화 후 잘 센터에 미리 냉장된 최소 필수 미디어 (MEM) 컬렉션 매체의 700 µ L 500 µ H L20 외부 반지에서 포함 된 센터 잘 기관 문화 접시에 oocytes를 전송 및 7 분 동안 얼음에 접시를 놓습니다.
참고: 미리 진정 MEM 미디어 센터 oocytes의 치료 전에 적어도 20 분 동안-20 ° C에서 기관 문화 요리 잘 하 추천 된다. - 실 온에서 20 분에 대 한 1 X PBS에 2 %paraformaldehyde 400 µ L을 포함 하는 투명 유리 자리 격판덮개의 우물으로 피 펫 장치를 사용 하 여 전송 하 여는 oocytes를 수정.
- 플라스틱 장치, 전송에 oocytes 다른 잘으로 400 µ L 차단 솔루션 (PBS + 0.3 %BSA + 0.01% 트윈 20 + 0.02% 할머니3) 및 저장소를 포함 하는 자리 접시에 동일을 사용 하 여 immunostaining을 처리할 준비가 될 때까지 4 ° C에서.
참고:에 대 한 4 ° C, parafilm 증발을 방지 하기 위해 커버 유리 별색 플레이트에 oocytes를 저장. - 동일한 피 펫 장치를 사용 하 여, 전송 oocytes 자리에 새로운 우물을 포함 400 µ L permeabilization 솔루션 (PBS + 0.3 %BSA + 0.1 %TritonX-100 + 0.02% 할머니3) 플레이트와 3를 통해 신속 하 게 전송 oocytes 20 분에 대 한 실 온에서 품 어 400 µ L의 삭제 차단 어떤 잔류 세제를 제거 하는 솔루션.
참고: 9-잘 분명 유리 자리 접시 (2.4-2.5 단계) 한 접시에 여러 치료를 통해 그룹을 이동 하기 위한 잘 작동 합니다. - 실 온에서 빛 으로부터 보호 습도 챔버에 나머지 immunocytochemistry 절차를 수행. 중간 크기의 플라스틱 용기를 사용 하 여 젖은 종이 수건 및 알루미늄 호 일 커버 늘어서 있다.
- 30 µ L oocytes 전송 피 펫 장치를 사용 하 여 10 분 동안 습도 챔버 내에서 장소와 96 잘 접시의 뚜껑에 솔루션을 차단.
참고: 방울은 접시에 원형 들여쓰기에 배치 됩니다. - Centromeres 및 스핀 들, 피 펫 장치를 사용 하 여, 30 µ L에 oocytes를 전송 차단 항 centromeric 항 원 (ACA, 크레스트)를 포함 하는 솔루션 (1:30) 및 안티 acetylated tubulin (1:1000) 및 적어도 1 시간에 대 한 품 어.
- 10 분에 대 한 솔루션을 차단의 세 가지 30 µ L 획득 옮겨서 oocytes를 씻어.
- 피 펫 장치, 전송 oocytes를 사용 하 여 30 µ L을 포함 하는 2 차 항 체 항 체 (반대로 인간 IgG 1: 200, 반대로 마우스 IgG 1: 200) 위에 사용 무료 차단 솔루션의 드롭하고 1 시간에 품 어.
- 30 µ L 3, 10 분 헹 구는 단계를 반복 단계 2.11에에서 설명 된 대로 솔루션을 차단.
- Oocytes, 3-5 µ L 중간 포함 DAPI 장착으로 피 펫 장치를 사용 하 여 전송 (5.9 µ g / µ L) 유리 현미경 슬라이드에서.
- 석유 젤리의 4 작은 방울 (핀 머리의 크기)는 oocytes의 분쇄를 방지 하기 위해 커버 슬립의 모서리에 놓습니다.
- 슬라이드에 커버 슬립 석유 젤리 측면 아래로 부드럽게 장소.
- 가장자리를 매니큐어를 취소 하 고 5 분 동안 말리는 것을 허용 하는 coverslip 인감.
- 4 ° C, confocal 현미경 검사 법을 통해 처리까지 빛에서 보호에 슬라이드를 저장 합니다.
참고: 설치 매체 및 coverslip, 일치의 굴절률 널리 사용 되 고 현미경 목표를 확인 합니다. 자료 이전 되었습니다 권장된 장착 설명 15. - Oocytes confocal 현미경, 작은 단계를 캡처에 40-63 x 목표를 사용 하 여 이미지 (≤ 1 µ m) z-평면에서 작업 목적과 이미지 분열 스핀 들의 전체 영역에 대 한 최적화.
참고: 단계 2.11에서에서 사용 하는 특정 이차 항 체에 따라 모든 3 채널의 이미지를 확인 하십시오. 평균 ≥ 4와 3의 확대/축소 하는 이미지는 적절 한 해상도 이상적입니다. 1 µ m 스텝 크기 microtubules 마우스 oocytes에서 kinetochores의 명확한 시각화를 제공합니다. 이미지 캡처를 위한 절차 현미경 현미경에서 달라질 수 있습니다. 현미경 설정을 구성 하는 방법에 대 한 특정 단계에 대 한 제조 업체 confocal 사용자 가이드를 참조 하십시오. - 다음 단계 2.21-2.23 아래 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 kinetochore microtubule 첨부 파일 상태를 식별 합니다.
그러나 참고: 다음 단계 이미지 J (NIH) 무료 다운로드할 수 있는 소프트웨어를 사용 하 여이 절차를 설명 합니다, 그리고, 대체 이미징 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 첨부 파일 상태 유형 되었습니다 이전 16 정의. - 오픈 이미지 이미지 J 도구 모음에 파일을 드래그 하 여.
- 열린된 z 시리즈에서 모든 채널 표시 (DNA, kinetochore, 및 스핀 들) "병합 채널", "이미지" 메뉴에서 사용할 수 있는 "색상" 하위 탭에서 클릭 하 여 확인 합니다.
- 이미지의 하단에 토글을 사용 하 여, 각 z 슬라이스를 통해 이동 하 고 kinetochore microtubule 첨부 파일을 결정 합니다. 설명 이전 되었습니다 자세한 첨부 파일 설명 16
3. 염색체 맞춤 도전 분석 결과
- 2.3 단계에서 설명한 대로 피 펫 장치를 사용 하 여, 기름에서 milrinone 무료 문화 매체의 100 µ L 드롭에 oocytes 전송과 감수 분열의 분열에 충분 한 성숙 수 있도록 7 h oocytes를 품 어 난 (내가 만난) 2.3 17 단계에서 앞에서 설명한 .
참고: Oocyte 컬렉션, microinjection, 및 성숙 절차 설명 했다 이전 15. 2.1-2.2 컨트롤에 대 한 단계와 단계에서 RNA microinjection 농도 대 한 첨부 파일 분석 결과 프로토콜을 참조 하십시오. - 동일한 피 펫 장치를 사용 하 여 전송 oocytes 센터 잘 기관 문화 접시 포함 700 µ L 문화 매체 센터 잘하고 400 µ L H20 주변 링에서 monastrol [100 µ M]를 포함 하 고 2 h 37 ° C에서 품 어.
- Monastrol oocytes를 100 µ L CZB 문화 매체의 3 드랍 스를 통해 위의 피 펫 장치를 사용 하 여 전송 하 여 밖으로 헹 구 고 700 µ L 문화 매체 + MG132를 포함 하는 새로운 센터 잘 기관 문화 접시 oocytes 전송 [5 µ M] 센터에서 3 h 링입니다. 외부 반지에 400 µ H L20을 추가 합니다.
- 피 펫 장치를 사용 하 여 실 온에서 20 분에 대 한 PBS에 400 µ L 2 %paraformaldehyde 포함 하는 투명 유리 자리 격판덮개의 우물에 그들을 전송 하 여는 oocytes를 수정.
- 고정, 후에 oocytes, 400 µ L을 포함 하는 투명 유리 자리 판의 새로운 우물으로 피 펫 장치를 사용 하 여 차단 솔루션 및 저장소까지 4 ° C에서 immunostaining에 대 한 처리.
참고:에 대 한 4 ° C, parafilm 증발을 방지 하기 위해 커버 유리 별색 플레이트에 oocytes를 저장. - Permeabilize 및 단계 2.6 2.16에에서 설명 된 대로 immunocytochemistry 통해 oocytes를 레이블.
- Oocytes는 confocal 현미경에 40-63 x 목표를 사용 하 여, 캡처 이미지 < 분열 스핀 들의 전체 영역을 이미지를 확인 하 고 z-평면에서 1 µ m 단계.
- 염색체 맞춤 식별 하려면 상태 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 파일을 엽니다.
그러나 참고: 다음 단계 이미지 J (NIH) 무료 다운로드할 수 있는 소프트웨어를 사용 하 여이 절차를 설명 합니다, 그리고, 대체 이미징 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. - 이미지 J 컨트롤 패널에 이미지를 드래그 합니다.
- 열린된 z 시리즈에서 (이미지 J 컨트롤 바에는 도구 아이콘을 클릭 하 여 사용 가능) 포인트 도구 사용 하 여 이미지에서 스핀 들 극 위에 도구를 배치 하 고 이미지를 클릭 하 여 그들의 각 z 슬라이스 각 스핀 들 장 대의 끝에 포인트를 표시. 명령 + t를 눌러 키보드에 관심 (ROI) 관리자의 지역에이 포인트를 추가 합니다.
- 각 위치 단계 3.10에서에서 ROI 관리자에서 특정 시점을 강조 표시 하 고 측정값 단추를 클릭 하 여 설정에 대 한 특정 좌표를 결정 합니다. 이 결과 제공할 것입니다 x 테이블을 포함 하 고 각 포인트에 대 한 y 좌표. 이들은 각각 X1, Y1, X1, Y2, 포인트를 될 것입니다.
- 다음으로, 진정한 Z 좌표를 결정 합니다. 이 스핀 들 극 확인 되었다 z 스택의 특정 z 슬라이스 조각 수를 곱하여 이루어집니다 (즉, # 2의 조각 6) 각 개별 포인트에 있는 스택 두께 (즉, 1 µ m)에 의해 (예: 슬라이스 2 x 1 µ m = 2). 이들은 각각 Z1 그리고 Z2 포인트 될 것입니다.
- 피타고라스의 정리 방정식을 사용 하 여 스핀 들 길이 결정 (2 + b2 c2를 =) 사용 하 여 이전에 정의 된 x, y 및 z 좌표 단계 3.11 3.13에서에서. 각 스핀 들에 대 한 최종 길이 동일 하:
√((X1-X2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2) - 스핀 들 midzone을 확인 합니다. 이 스핀 들의 길이 1/2로 계산 됩니다. 이미지 J에 선 도구를 사용 하 여, 이미지 J 도구 모음에서 줄 아이콘을 클릭 하 여 하나의 스핀 들 극에서 스핀 들 midzone 하는 선을 그립니다. 길이는 이미지 J 도구 모음에 표시 됩니다.
- 선 측정 도구를 사용 하 여 스핀 들 midzone에서 염색체 거리를 평가 하 여 염색체 정렬 상태를 확인 합니다. 이미지 J 도구 모음에서 줄 아이콘을 클릭 하 여 사용할 수 있는 선 도구를 사용 하 여, 염색체에 스핀 들 midzone에서 선을 그립니다. 길이는 이미지 J 도구 모음에 표시 됩니다. 스핀 들 midzone에서 4 µ m 보다 큰 염색체 정렬된 18간주 됩니다.
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결과
생체 외에서 후 전사 고품질 RNA (1.8-2.2) A260/A280 비율과 A260/A230 비율 ≥1.7은 분 광 광도 계를 사용 하 여 측정 하는 때 있을 것 이다. 그림 1 에서 그림 보여준다 생체 외에서의 마이그레이션-변성 agarose 젤 전기 이동 법 후 RNA 생성. 패턴 또는 여러 크기의 밴드는 샘플에 얼룩져 밴드 오염 또는 샘플의 저하를 나타낼 수 있습니다. 또는, 여러 밴드는 mRNA 완전히 변성 하지 또는 시작 플라스 미드는 완전히 선형화를 나타낼 수 있습니다. MRNA는 mRNA 체 외의 안정적인 식 수 있는 pIVT에 내장 된 폴 리 adenylated 꼬리 때문에 예상 보다 큰 실행 됩니다. Microinjection 후 균일 한 주입 볼륨 및 형광 현미경 검사 법을 통해 식 수준을 보장 하기는 것이 좋습니다.
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토론
질병과 관련 된 인간의 유전 이체의 신속 하 고 증가 식별, 때문에 그들의 생물 학적 중요성을 평가 하기 위해 시스템 설립은 필수적 이다. 때문에 인간의 oocytes 소중한 희귀 하 고 인간의 정자는 의무가 유전자 조작 인간 감수 분열 포즈 특정 과제에서 단백질 기능을 이해. 마우스 oocytes는 인간의 meiotic 유전자 기능 10,23를 평가 하기 위한 귀중 한 포유류 모델 시스템입니다. 어떻게 유전 이체를 이해 하는 데 유용 되 고 여성 영향을 줄 수 있습니다 인간의 생식 세포와 유사한 감수 분열을 받 다 낮은-비용, manipulable oocytes의 쉽게 사용할 수 있는 소스를 제공 하면서 인간의 계란을 사용 하 여 impracticalities를 무시 하는이 모델 불 임입니다.
때문에 이러한 메서드 microinjection 통해 마우스 oocytes에서 인...
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품 미국 생식 의학 협회와 찰스와 요한 나 부시 기념 기금 Rutgers에 연구 보조금에 의해 지원 되었다에 주립 대학 뉴저지 K.S. A.L.N.에 N.I.H. (F31 HD0989597)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.2 mL Seal-Rite PCR 튜브 | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA 로딩 염료 | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-웰 유리 스폿 플레이트 | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| 아가로스 | Sigma Aldrich | A9539 | |
| 알부민; | 시그마-알드리치 | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 공액 항마우스 IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 희석 |
| Alexa-fluor-633 공액 항인간 IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 희석 |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | 모든 표준 모델 | |
| 항 아세틸화 세뇨관 항체 | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-centromeric (CREST) 항체 | Incorportated | 15-234 | 1:30 희석 |
| Barrier (Filter) 피펫 팁 | Thermo Scientific | AM12635 | 귀하의 피펫터 브랜드와 호환되는지 확인하십시오. 이 제품은 Eppendorf 브랜드의 피펫터와 호환됩니다. |
| BD Difco 탈수 배양 매체 : LB 한천, 밀러 (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco 탈수 배양 매체 : LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| 모세관 튜빙 | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well 장기 배양 접시 | VWR | 25381-141 | |
| CO2 탱크 | 인큐베이터 | ||
| 컨포칼 현미경 | Zeiss | 모든 표준 모델 | |
| 원심분리기 (냉각 능력 포함) | Thomas Scientific | 모든 표준 모델 | |
| 커버 유리 11 x 22 mm | 토마스 사이언티픽 | 6663F10 | |
| 커버슬립 | 토마스 사이언티픽 | 6663-F10 | 두께는 특정 현미경에 따라 다를 수 있습니다. |
| DAPI | 시그마 알드리치 | D9542 | |
| DEPC H20 | 라이프 테크놀로지 | AM9922 | |
| 디지털 드라이 배스 | 써모 사이언티픽 | 888700001 | |
| 이지 A 하이 충실도 클로닝 효소 | Agilent | 600400 | DNA 클로닝용 |
| New England Biolabs | NdeI 또는 KasI를 선형 | 화하기 위한 효소 | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| 형광 현미경 | 모든 형광 현미경을 사용할 수 있습니다 | ||
| 포름 알데히드 (37 %) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| 포름 알데히드 RNA 로딩 염료 | Ambion | 8552 | |
| 젖빛 현미경 슬라이드 (비충전) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| 전장 cDNA 클론은 | 열린 판독을 제공하는 모든 공급 업체에서 얻을 수 있습니다. 프레임 클론 | ||
| 젤 전기 영동 장치 | Bio-Rad | 모든 표준 모델 | |
| 유리 파스퇴르 Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 글로빈 포워드 프라이머 for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. 맞춤형 올리고뉴셀로타이드를 생산하는 모든 회사에서 구입할 수 있습니다. | ||
| pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3'을 생산하는 모든 회사에서 구입할 수 있습니다. 맞춤형 올리고뉴셀로타이드를 생산하는 모든 회사에서 구입할 수 있습니다 | ||
| 펫 보유 | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Tupperware를 사용할 수 있습니다 | ||
| Illustra Ready-To-Go를 사용할 수 있습니다. RT-PCR 비드 | GE Life Sciences | 27925901 | |
| 인큐베이터 | CO2 및 워터 재킷 기술이 적용된 모든 표준 모델 | ||
| 도립 현미경 | Nikon 기기 | 모든 표준 모델 | |
| Image J (NIH) 소프트웨어 | NIH | 이미지 분석 소프트웨어 | |
| 96 웰 플레이트의 뚜껑 | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| 낮은 접착력 0.5 mL 마이크로 센트리프그 튜브 | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Sequence 분석 소프트웨어 | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| 현미경 슬라이드 | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| 밀레니엄 RNA 마커-포름알데히드 | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | 2.5mM 미네랄 오일에서 DMSO에 재현탁 |
| Sigma-Aldrich | M5310 | 배아 테스트, 멸균 여과 | |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | |
| 마우스피스 | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 탱크 | 에서 DMSO에 재현탁 | 방진 테이블 | |
| 매니큐어; Clear | 모든 투명 네일폴리싱을 사용할 수 있습니다 | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis 분광 광도계 | Thermo Scientific | 모든 표준 모델 | |
| NorthernMax 10X 변성 젤 버퍼 | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X 러닝 버퍼 | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS 러닝 버퍼 | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| 장기 배양 접시 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| 파라포름알데히드 | Polysciences, Inc. | ||
| PCR 열 순환기 | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| 페트리 접시 139mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| 페트리 접시 35mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| 페트리 접시 60mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks 디지털 마이크로 주입기 | 모든 표준 모델 | |
| 피펫 풀러 | : Flaming-Brown 마이크로피펫 풀러 | : 모델 P-1000 | |
| pIVT 플라스미드 | AddGene | 32374 | 난모세포 발현에 적합한 빈 벡터. |
| 임산부 암말 혈청 성선 자극 | 호르몬 Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | 정제 플라스미드 DNA 최대 20 uL |
| QIAquick PCR 정제 키트 | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II 부위 지시 돌연변이 유발 키트 | Agilent | 삽입 및 삭제를 위한 200523 돌연변이 유발 키트 | |
| Quikchange 번개 다중 사이트 지시 돌연변이 유발 키트 | Agilent | 단일 부위 변경을 위한 210512 돌연변이 유발 키트 | |
| 가위(파인 포인트) | 정밀 과학 도구 | 14393 | |
| 가위(중간 포인트) | 정밀 과학 도구 | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL 마이크로 원심분리기 | 튜브 USA | Scientific 1615-5500 | |
| 슬라이드 워머 | 표준 모델 | ||
| 분광 광도계(Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| 실체현미경 | 모든 표준 모델 | ||
| 서브클로닝 효율 DH5a 역량 세포 | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| 주사기 | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine high-yield 캡이 있는 RNA 전사 키트 | , Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| 핀셋(파인 포인트- 크기 5) | 미세 과학 도구 | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free 증류수 | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure 에티듐 브로마이드 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield 장착 매체 | 벡터 실험실 | H-1000 |
참고문헌
- Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
- Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).
- Treff, N. R., Zimmerman, R. S. Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy. Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).
- Franasiak, J. M., et al. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening. Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Scott, R. T. Jr Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).
- Scott, R. T. Jr, Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).
- Yang, Z., et al. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet. 5 (1), 24(2012).
- Rubio, C., et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study. Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).
- Nguyen, A. L., et al. Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy. Mol Hum Reprod. , (2017).
- Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization. Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).
- Database, J. S. E. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE. , (2017).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , John Wiley & Sons, Inc. (2008).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
- Watanabe, Y. Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).
- Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes. Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).
- Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension. Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).
- Nguyen, A. L., et al. Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).
- Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5. Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).
- Jones, K. T., Lane, S. I. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Fellmeth, J. E., et al. Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes. Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).
- Rieder, C. L. The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells. Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).
- Brunet, S., et al. Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase. J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
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