만들기, 테스트 및 성인 뇌의 조직 조각에 칼륨 이온 선택적 Microelectrodes를 사용 하 여

Summary

칼륨 이온은 세포의 휴식 막 잠재력에 기여 하 고 extracellular K⁺ 농도 세포 흥분의 중요 한 레 귤 레이 터 이다. 우리가 확인 하 고, 보정 하 고 monopolar K⁺를 사용 하는 방법을 설명-선택 microelectrodes. 같은 전극을 사용 하 여 성인 hippocampal 조각 전기 evoked K⁺ 농도 역학 측정 수 있습니다.

Abstract

칼륨 이온이 세포의 휴식 막 잠재력에 크게 기여 하 고, 따라서, extracellular K⁺ 농도 세포 흥분의 중요 한 레 귤 레이 터 이다. 활동 전위의 기반이 되는 전압 종속 이온 채널에 대 한 폐쇄, 오픈 및 비활성 상태 사이 평형 이동 하 여 휴식 막 잠재력과 세포 흥분 extracellular K⁺ 영향의 농도 변경 개시와 전도 따라서, 그것은 extracellular K⁺ 역학 건강 및 질병 상태를 직접 측정 하는 중요 한입니다. 여기, 우리가 확인 하 고, 보정 하 고 monopolar K⁺를 사용 하는 방법 설명-선택 microelectrodes. 우리는 전기 evoked K⁺ 농도 역학 측정 hippocampal 뇌 조각에 그들을 배포. 이러한 전극의 사리 분별이 사용 신 경계에 extracellular K⁺ 농도 제어 하는 세포와 생물 메커니즘을 평가 하는 데 필요한 도구 키트의 중요 한 부분 이다.

Introduction

칼륨 이온 농도 두뇌에 긴밀 하 게 규제 하 고 그들의 동요는 모든 세포의 휴식 막 잠재력에 강력한 영향을 발휘. 이러한 중요 한 공헌에 비추어 생물학의 중요 한 목표는 시체¹ 의 다른 장기에서 세포 외 공간에서 단단히 K⁺ 의 농도 조절 하는 데 사용 되는 셀룰러 및 생물 메커니즘을 결정 하는 ^{, 2}. 이러한 연구에 중요 한 요구는 K⁺ 농도 정확 하 게 측정 하는 능력. 건강 하 고 병에 걸린 상태에서 뇌의 칼륨 항상성에 공헌 하는 많은 구성 요소 식별된^3,,45, 있다 지만 더 진행 되었습니다 둔화의 특성 상 전문 이온 선택적 microelectrodes 칼륨 측정에 대 한 준비. Microelectrode 센서 K⁺ 농도 생체 외에서조직 조각에서 vivo에서 측정 하기 위한 금 표준을 나타냅니다.

그러나 모니터링 K⁺ 에 대 한 새로운 접근법 개발이 K의 생....

Protocol

모든 동물 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 헬스 가이드의 국립 연구소에 따라 실시 했다 고 장관의 동물 연구 위원회, 로스 앤젤레스가 주 대학에 의해 승인 했다. 모든 마우스 음식과 물을 사용할 수 있는 광고 libitum 12 h 빛 어두운 환경에 함께 보관 되어 있었다. 모든 동물 명백한 행동 변경 없이 건강 한, 이전 연구에 관여 되지 않은 되었고 빛 주기 동안 희생 했다. 실험 데이터는 성인 쥐 (모든 실험에 대 한 오래 된 6-8 주)에서 수집 했다.

1. 선택적 microelectrodes K⁺ 의 준비

1. 붕 규 산 유리의 Silanization
   1. 포장에서 충분 한 유리 모세 혈관을 제거 하 고 50 mL 원뿔 관으로 장소. HCl 밤새 또는 최소 6 시간에 대 한 부드러운 동요와 1 M HCl 세척 전극에 원뿔 튜브 위로 채우십시오.
   2. 짧게 70% 에탄올과 모세 혈관을 헹 구 고 6-8 시간 동안 100-120 ° C에서 완전 하 게 건조. 더 사용 하기 전에 최대 4 주 동안 무수 칼슘 황산 염 방 습 제로 용기에 씻어 모 세관을 저장 합니다.
   3. Silanization, 이전 microelectrode 끌어당기는 사람을 ....

Results

Extracellular K⁺의 선택적 측정을 위해 우리는 깨끗 한 붕 규 산 유리 펫 (그림 1A)의 silanization 통해 소수 레이어와 코팅 이온 선택적 microelectrodes 준비. 이 코팅 전극의 끝에 휴식 하 고 전극 팁 (그림 1B)에 좁은 개방을 통해 K⁺ 플럭스만을 허용 하는 valinomycin를 포함 하는 K⁺ ionophore를 수 있습니다. 못쓰게 백필 염와 K⁺ ionophore 전극, 후 전극 시험 될 수 있다 그들의 신속 하 고 선형 변화에 대응 stepwise 목욕 K⁺ 농도 (그림 3A)와 그들의 응답에 대 한 목욕 K⁺ 염 분에 교정 범위 (

Discussion

우리가 여기에 설명 하는 방법 성인 쥐에서 급성 hippocampal 조각에서 Schaffer collaterals의 전기 자극에 대 한 응답에서 K⁺ 역학 평가 허용 했다. 준비 K⁺ 이온 선택적 microelectrodes의 우리의 방법은 앞서 설명한 절차^12,13,,1415와 비슷합니다. 그러나,이 메서드는 장점이 대체 전극 구성 이라는 점에서 신속 하 고 단순한 K⁺ 선택적인 microelectrodes를 준비 하. 적절 한 교정 후 이러한 전극 튼튼하게 전기 자극, 동안 조각에 K⁺ 역학 측정을 발견 했다 그리고 이러한 응답 TTX에 의해 차단 되었습니다. 이 실험에서는 10 Hz에서 80-160 uA의 stimul.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome	DSK	Microslicer Zero 1
마우스: C57BL/6NTac 근친 마우스	Taconic	Stock#B6
현미경	Olympus	BX51
전극 풀러	셔	P-97
Ag/AgCl 접지 펠릿	WPI	EP2
pCLAMP10.3	분자 장치	n/a
사용자 정의 microfil 28G 팁	세계 정밀 기기	CMF28G
텅스텐 막대	AM 시스템	716000
바이폴라 자극 전극	FHC	MX21XEW(T01)
자극 아이솔레이터	세계 정밀 기기	A365
잔디 S88 자극기	잔디 악기 회사	S88
붕규산 유리 피펫	세계 정밀 기기	1B150-4
A to D 보드	Digidata 1322A	축삭 기기
신호 증폭기	멀티 클램프 700A 또는 700B	축삭 기기
헤드 스테이지	CV-7B Cat 1	축삭 기기
패치 컴퓨터	Dell	N / A
염화나트륨	시그마	S5886
염화칼	시그마	P3911
HEPES	시그마	H3375
중탄산나트륨	시그마	S5761
인산나트륨 일염기성	시그마	S0751
D-포도	당 시그마	G7528
염화칼슘	시그마	21108
염화마그네슘	시그마	M8266
발리노마이신	시그마	V0627-10mg
1,2-디메틸-3-니트로벤젠	시그마	40870-25ml
테트라키스 칼륨(4-클로로페닐)보레이트	시그마	60591-100mg
헵탄의 5% 디메틸디클로로실란	시그마	85126-5ml
TTX	케이맨 Chemical Company	14964
염산	시그마	H1758-500mL
수크로오스	시그마	S9378-5kg
피펫 미세 조작기	셔터	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
대물 렌즈	Olympus	PlanAPO 10xW