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방법 논문

만들기, 테스트 및 성인 뇌의 조직 조각에 칼륨 이온 선택적 Microelectrodes를 사용 하 여

12.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57511

⸱

2018년 5월 7일

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 2Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 3Department of Neurobiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

이 논문에서

요약

칼륨 이온은 세포의 휴식 막 잠재력에 기여 하 고 extracellular K+ 농도 세포 흥분의 중요 한 레 귤 레이 터 이다. 우리가 확인 하 고, 보정 하 고 monopolar K+를 사용 하는 방법을 설명-선택 microelectrodes. 같은 전극을 사용 하 여 성인 hippocampal 조각 전기 evoked K+ 농도 역학 측정 수 있습니다.

초록

칼륨 이온이 세포의 휴식 막 잠재력에 크게 기여 하 고, 따라서, extracellular K+ 농도 세포 흥분의 중요 한 레 귤 레이 터 이다. 활동 전위의 기반이 되는 전압 종속 이온 채널에 대 한 폐쇄, 오픈 및 비활성 상태 사이 평형 이동 하 여 휴식 막 잠재력과 세포 흥분 extracellular K+ 영향의 농도 변경 개시와 전도 따라서, 그것은 extracellular K+ 역학 건강 및 질병 상태를 직접 측정 하는 중요 한입니다. 여기, 우리가 확인 하 고, 보정 하 고 monopolar K+를 사용 하는 방법 설명-선택 microelectrodes. 우리는 전기 evoked K+ 농도 역학 측정 hippocampal 뇌 조각에 그들을 배포. 이러한 전극의 사리 분별이 사용 신 경계에 extracellular K+ 농도 제어 하는 세포와 생물 메커니즘을 평가 하는 데 필요한 도구 키트의 중요 한 부분 이다.

서론

칼륨 이온 농도 두뇌에 긴밀 하 게 규제 하 고 그들의 동요는 모든 세포의 휴식 막 잠재력에 강력한 영향을 발휘. 이러한 중요 한 공헌에 비추어 생물학의 중요 한 목표는 시체1 의 다른 장기에서 세포 외 공간에서 단단히 K+ 의 농도 조절 하는 데 사용 되는 셀룰러 및 생물 메커니즘을 결정 하는 , 2. 이러한 연구에 중요 한 요구는 K+ 농도 정확 하 게 측정 하는 능력. 건강 하 고 병에 걸린 상태에서 뇌의 칼륨 항상성에 공헌 하는 많은 구성 요소 식별된3,,45, 있다 지만 더 진행 되었습니다 둔화의 특성 상 전문 이온 선택적 microelectrodes 칼륨 측정에 대 한 준비. Microelectrode 센서 K+ 농도 생체 외에서조직 조각에서 vivo에서 측정 하기 위한 금 표준을 나타냅니다.

그러나 모니터링 K+ 에 대 한 새로운 접근법 개발이 K의 생물학 관련 범위+ 농도 검색 하지 않습니다 또는 하지 완전히 홀더 되었습니다 생물 학적 시스템에 있지만 광학 센서를 사용 하 여 초기 결과 유망한6,,78나타납니다. 광학 센서에 비해, microelectrodes는 근본적으로 이온, 포인트 소스 측정 전극 배열9공간 해상도 향상 시킬 수 있지만. 이 문서는 K+ 역학을 모니터링 하기 위한 단일 질주 microelectrode 센서에 초점을 맞추고.

이 작품에서는, 우리는 선택적 microelectrodes, 높게 선택적인 허용 하는 valinomycin 기반 칼륨 ionophore를 사용 하 여 (104 배 K+ + 나 선택도를) K+ 수 있도록 상세한 단계적 절차 보고 K+ 막10이상 운동입니다. 자연스럽 게 발생 polypeptide, valinomycin K+ 침투성 숨 구멍으로 작동 하 고 그것의 전기 화학 기온 변화도 아래로 K+ 의 흐름을 용이 하 게 한다. 우리는 또한 전극, 보정 하는 방법을 설명 저장 하 고 그들을 사용 하는 방법 및 마지막으로 성인 쥐에서 급성 hippocampal 두뇌 조각에서 K+ 농도 역학을 측정 하기 위해 그들을 배포 하는 방법. Extracellular K+ 역학 규제를 제안 하는 특정 이온 채널 부족 유전자 변형된 생쥐와 같은 전극의 사용 K의 주위 농도 제어 하는 신경 시스템에서 사용 하는 셀룰러 메커니즘을 계시 해야 한다 + extracellular 환경에.

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프로토콜

모든 동물 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 헬스 가이드의 국립 연구소에 따라 실시 했다 고 장관의 동물 연구 위원회, 로스 앤젤레스가 주 대학에 의해 승인 했다. 모든 마우스 음식과 물을 사용할 수 있는 광고 libitum 12 h 빛 어두운 환경에 함께 보관 되어 있었다. 모든 동물 명백한 행동 변경 없이 건강 한, 이전 연구에 관여 되지 않은 되었고 빛 주기 동안 희생 했다. 실험 데이터는 성인 쥐 (모든 실험에 대 한 오래 된 6-8 주)에서 수집 했다.

1. 선택적 microelectrodes K+ 의 준비

  1. 붕 규 산 유리의 Silanization
    1. 포장에서 충분 한 유리 모세 혈관을 제거 하 고 50 mL 원뿔 관으로 장소. HCl 밤새 또는 최소 6 시간에 대 한 부드러운 동요와 1 M HCl 세척 전극에 원뿔 튜브 위로 채우십시오.
    2. 짧게 70% 에탄올과 모세 혈관을 헹 구 고 6-8 시간 동안 100-120 ° C에서 완전 하 게 건조. 더 사용 하기 전에 최대 4 주 동안 무수 칼슘 황산 염 방 습 제로 용기에 씻어 모 세관을 저장 합니다.
    3. Silanization, 이전 microelectrode 끌어당기는 사람을 사용 하 여 좋은 팁을 모 세관을 당겨. 우리가 사용 하는 microelectrodes는 직경에서 대략 2-5 미크론. 항상 취급 하십시오 장갑, 세척 된 모세 혈관 피부에서 기름 silanization를 방해할 수 있습니다.
    4. 전극 팁 파손을 방지 하기 위해 바닥에서 상승는 되도록 유리 용기에 microelectrodes를 놓습니다. Microelectrodes 멸 테이프 또는 유사한 접착 테이프를 사용 하 여 컨테이너를 수정 합니다.
    5. 약 0.5 mL 5 %dichlorodimethylsilane (DDS) silanization 솔루션의 질소 대체 방법을 사용 하 여 컨테이너에서 제거 ( 그림 2참조). 질소 가스는 풍선을 풍선에 주사기 또는 튜브와 바늘 연결. 더 긴 바늘을 통해 별도 주사기에 DDS를 그리는 동안 DDS 컨테이너에 바늘을 삽입 합니다.
    6. 펫의 팁에 dropwise silanization 솔루션을 적용 하 고 즉시 커버. 들고 silanization 솔루션 microelectrodes 미리 따뜻하게 (170-180 ° C) 실험실 오븐에 10-12 시간 또는 200-220 ° C에서 30 분에 대 한 컨테이너를 놓습니다
    7. 부 화 후 오븐을 해제 하 고 오븐에서 제거 하십시오. 그것은 매우 뜨거운는 인큐베이터에서 접시를 제거할 때는 주의 해야 합니다. 냉각 유리를 수 있도록 10-15 분간 실 온에서 벤치에 접시를 놓습니다.
    8. microelectrodes (테이프를 잘라 면도날 또는 메스 블레이드 사용) 접시에서 제거 건조제 채워진된 밀폐 용기에 그들을 배치. 수 분의 자유로운 유지 하는 Silanized microelectrodes silanization 다음 최대 1 주일까지 사용할 수 있습니다.
  2. 전극을 못쓰게
    1. 재고 솔루션 K+ ionophore 칵테일의 준비: 5 %w / v valinomycin, 93 %v / v 1, 2-디 메 틸-3-니트로 벤젠, 2 %w / v 칼륨 tetrakis(4-chlorophenyl) 붕 산 염11. 이 솔루션은 희미 한 노란 색상입니다. 실내 온도에 밀폐, 불투명 용기에 계속. 제대로 저장 된 경우이 솔루션에 게 몇 개월 지난 수 있습니다.
    2. 10 mM HEPES pH 7.4에서 300 mM NaCl 버퍼링의 재고 솔루션을 준비 합니다. 28 G microfil 팁 주사기에 연결을 사용 하 여 버퍼링된 NaCl와 전극 클램프 및 백필으로 수정. 준수는 염 microelectrode 팁의 끝에 도달 했습니다. microelectrode의 전류 흐름을 방해할 수 있는 큰 거품의 무료 되는지 확인 합니다.
    3. 약 10-20 µ m 폭, 메스 또는 면도칼의 무딘 사이드를 사용 하 여 전극의 팁을 휴식.
    4. 사용 하는 micropipette, K+ ionophore는 microelectrode의 끝 근처의 작은 물방울 (~0.1 µ l)를 적용 합니다. 만약 전극은 제대로 silanized 드롭릿에 깨진된 팁으로 흡수 될 것 이다. 채우기 1-2 m m K+ ionophore와 제거 초과 전극 휴지를 사용합니다.

2. 선택적 Microelectrodes K+ 의 교정

  1. 교정 솔루션의 준비
    1. KCl과 NaCl을 대체 하 여 동등한 osmolarity 인공 뇌 척추 액체 (실제)에서 KCl의 다양 한 농도의 솔루션을 준비 합니다. 우리는 0.1, 1, 4.5, 10, 100 m m K+ 실제, 전극의 교정에 대 한 사용. 이러한 교정 솔루션에 대 한 조리법은 표 1에 나열 됩니다.
화학MW마지막 m m0.1 m m [K +]1 m m [K +]4.5 m m [K +]10 m m [K +]100 m m [K +]
(g / mol)
NaCl58.44다릅니다.1.51 g1.50 g1.44 g1.4 g0.345 g
KCl1 M 주식다릅니다.20 µ l200 µ l900 µ l2 ml20 ml
CaCl2 1 M 주식2400 µ l
MgCl2 1 M 주식1200 µ l
NaH2포4 119.981.20.29 g
NaHCO3 84.01260.437 g
D-포도 당180.16100.360 g
물q.s. 200 ml

표 1입니다. 칼륨 교정 솔루션

  1. Microelectrode 교정
    1. 실험을 시작 하기 전에 적어도 20 분 동안 95% O2/5% CO2 와 모든 솔루션을 거품. 4.5 m m [K+] 목욕 perfusing 시작 분 당 3 mL의 속도로 실제. K+ 선택적인 전극을 조작자에 전극 headstage에 연결 된 전극 홀더 넣으십시오. 이 headstage는 적절 한 앰프에 연결 된다. 목욕 perfusate에는 전극의 끝을 삽입 합니다.
    2. Ag/AgCl 접지 전극은 동일한 솔루션에서 목욕을 하 고 흐름은 꾸준한 확인 하십시오. Stepwise 방식에서 교정 솔루션을 적용 하 고 전극 팁에 걸쳐 mV에 잠재적인 변화를 기록 합니다. 다음 솔루션으로 전환 하기 전에 안정적인 값에 도달 하는 전극 팁에서 잠재력을 기다립니다
    3. 전극 끝에 교정 솔루션의 응용 프로그램에 대 한 응답에서 안정 상태 전압 변화를 측정 합니다. 전극 응답의 사면은 적어도 52와 58 보다 더 큰 확인 mV 로그 변경 [k+] 당.

3입니다. 급성 Hippocampal 뇌 조각의 준비

  1. 조각 솔루션의 준비
    1. 500 mL 자당 준비 절단 솔루션 구성: 194 m m 자당, 30 m NaCl, 4.5 m KCl, 10mm D-포도 당, 1mm MgCl2m m, 1.2 m m NaH2포4, 26mm NaHCO3, 290-300 mOsm, 5% CO2와 95% O2 포화.
    2. 준비의 구성 기록 솔루션 (실제)의 1-2 리터: 124 mM NaCl, 4.5 m m KCl, 1 mM MgCl2, 10 m m D-포도 당, 2 mM CaCl2, 1.2 m m NaH2포4및 26 m m NaHCO3; (버블링) 후 pH 7.3-7.4, 290-300 mOsm, 5% CO2와 95% O2 포화. 솔루션을 기록 뇌 조각 홀더 챔버를 포함 하는 비 커를 32-34 ° c.에 그것을 유지합니다 비 자금 얼음 물으로 vibratome 챔버를 채우십시오.
  2. 급성 슬라이스 준비
    1. 깊이 2-3 mL isoflurane에 미리 충전 된 벨 항아리에 그것을 배치 하 여 마우스를 anesthetize. 발가락 핀치 반사에 대 한 확인 하 고 응답 하지 않는 경우 신속 하 게 목을 벨 동물 프로토콜에서 요구 하는으로 한 쌍의 날카로운가 위 또는 단두대를 사용 하 여.
    2. 2-3 cm 절 개 잘라 중간 선 따라 두 피를 두개골의 꼬리 부분에서가 위를 사용 하 여 확인 합니다. 수동으로 제거 두 피, 하는 동안 두 개의 1 cm 가로 절 측면을 따라 구멍 매그넘에서 두개골의 확인 합니다. 그럼, 좋은 위를 사용 하 여 잘라 절 개 코에 두개골의 뒤에서 중간에 따라 두개골의 길이.
    3. 중간 선 근처 삽입 미세 집게를 사용 하 여 두 부분에 베인된 두개골을 철회. 두개골에서 쥐의 뇌를 추출 하 고 블레이드를 사용 하 여 제거 하는 소 뇌 및 후 각 전구, 두뇌의 rostral 꼬리 부분에 각각 있습니다. 이러한 큰 균열, 피 질에서 그들을 구분 하 여 확인할 수 있습니다.
    4. 슈퍼 접착제를 사용 하 여 vibratome 트레이에 두뇌 블록을 탑재 합니다. Vibratome 트레이를 차가운 얼음 절단 솔루션을 채우십시오.
    5. 300 µ m 두께에서 코로나 비행기에 조직 섹션을 잘라. 보통 6 코로나 hippocampal 조각은 수집할 수 있습니다.
    6. 각 섹션을 자른 후 즉시 전송 조각 슬라이스 잡고 비 커 32-34 ° c 예 열 섹션을 포함 하는 비 커를 제거 하기 전에 20 분 동안이 온도에 섹션을 계속 하 고 녹음 전에 적어도 20-30 분 동안 실내 온도에 배치.

4. 전기 Evoked K+ 역학의 측정

  1. 조각 준비 설정
    1. 부드럽게 뇌 조각 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 목욕에 놓고 부드럽게 나일론 문자열 플래티넘 하프와 장소에서 개최 합니다.
    2. 바이 폴라 자극 전극의 팁 서로 평행한 조각의 평면 수준 확인 합니다. 천천히, 6-7 초 동안 삽입 전극 CA3 지층 radiatum에 약 40-50 µ m 깊은 Schaffer collaterals를 자극. 코로나 섹션에서 CA3 식별할 수 있습니다 약 hippocampal genu에과 립 세포 층에 해 마 적절 한 측면의 부분으로 중간과 복 부 피라미드 세포 층에 떨어지는 지층 radiatum와 함께.
    3. 조심 스럽게 삽입 K+-깊은 약 3 4 초 동안 전극을 천천히 낮추어 CA1 지층 radiatum 약 50 µ m으로 선택적인 전극. Stimulations 슬라이스를 적용 하기 전에 전극에 걸쳐 안정 가능성을 허용:이 보통 5 ~ 10 분 정도 걸립니다. 조각 전시 자발적인 경우 extracellular k+ 변경 삭제 그리고 새로운 조각으로이 과정을 반복 합니다.
  2. 측정 갖는 K+ 출시
    1. 수동으로 디지털 응답을 녹음 하면서는 자극에 방 아 쇠를 우울 하 여 전기 자극 (8 펄스)의 열차를 적용 합니다. 10 Hz와 1 ms 펄스 폭, 10 µ A 자극 진폭에서 시작에서 자극을 적용 합니다.
    2. 최대 K+ 응답 진폭 감지 될 때까지 2의 요인에 의해 증가 자극 진폭을 적용 합니다. 표시 되지 않으면 어떤 응답 단위로 100 µ m의 자극 사이트에 가까이 K+ 전극의 위치를 이동 하는 경우
    3. 절반 최대한 응답을 생성 하는 자극 진폭을 결정 합니다. 우리의 경험에서는, 이것은 준비 품질, 동물, 그리고 자극 전극 및 K+ 선택적인 전극 사이의 거리의 나이에 따라 40-160 µ A 사이.
    4. 동일한 조각에서 사용 하 여 자극 진폭 절반 최대한 응답을 생성 하는 진폭 보다 한 단계 (예: 반 최대한 응답을 생성 하는 80 µ A 경우 사용 40 µ A) 펄스의 수를 증가의 자극 기차를 적용. 처음, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 펄스의 열차 사용 했습니다.
    5. K+ 신호 전기 자극된 Schaffer 민간인 목욕의 활동 전위 발생에 의해 중재는 것인지 10 분 동안 0.5 µ M TTX 실제에 적용 하 고 자극 프로토콜을 반복 합니다. 갖는 무반응을 관찰 한다.
    6. 마친 후 슬라이스 실험, 전극은 전극 교정 솔루션에서 다시 보정 하 여 자사의 responsivity를 유지 하 고 있다 고 응답 보장 초기 교정에서 10% 이상 벗어나지는 확인

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결과

Extracellular K+의 선택적 측정을 위해 우리는 깨끗 한 붕 규 산 유리 펫 (그림 1A)의 silanization 통해 소수 레이어와 코팅 이온 선택적 microelectrodes 준비. 이 코팅 전극의 끝에 휴식 하 고 전극 팁 (그림 1B)에 좁은 개방을 통해 K+ 플럭스만을 허용 하는 valinomycin를 포함 하는 K+ ionophore를 수 있습니다. 못쓰게 백필 염와 K+ ionophore 전극, 후 전극 시험 될 수 있다 그들의 신속 하 고 선형 변화에 대응 stepwise 목욕 K+ 농도 (그림 3A)와 그들의 응답에 대 한 목욕 K+ 염 분에 교정 범위 (

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토론

우리가 여기에 설명 하는 방법 성인 쥐에서 급성 hippocampal 조각에서 Schaffer collaterals의 전기 자극에 대 한 응답에서 K+ 역학 평가 허용 했다. 준비 K+ 이온 선택적 microelectrodes의 우리의 방법은 앞서 설명한 절차12,13,,1415와 비슷합니다. 그러나,이 메서드는 장점이 대체 전극 구성 이라는 점에서 신속 하 고 단순한 K+ 선택적인 microelectrodes를 준비 하. 적절 한 교정 후 이러한 전극 튼튼하게 전기 자극, 동안 조각에 K+ 역학 측정을 발견 했다 그리고 이러한 응답 TTX에 의해 차단 되었습니다. 이 실험에서는 10 Hz에서 80-160 uA의 stimul...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

Khakh 실험실은 NIH MH104069에 의해 지원 되었다. Mody 실험실 NIH NS030549에 의해 지원 되었다. J.C.O.는 NIH T32 신경 칩 훈련 Grant(NS058280) 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
VibratomeDSKMicroslicer Zero 1
마우스: C57BL/6NTac 근친 마우스TaconicStock#B6
현미경OlympusBX51
전극 풀러셔P-97
Ag/AgCl 접지 펠릿WPIEP2
pCLAMP10.3분자 장치n/a
사용자 정의 microfil 28G 팁세계 정밀 기기CMF28G
텅스텐 막대AM 시스템716000
바이폴라 자극 전극FHCMX21XEW(T01)
자극 아이솔레이터세계 정밀 기기A365
잔디 S88 자극기잔디 악기 회사S88
붕규산 유리 피펫세계 정밀 기기1B150-4
A to D 보드Digidata 1322A축삭 기기
신호 증폭기멀티 클램프 700A 또는 700B축삭 기기
헤드 스테이지CV-7B Cat 1축삭 기기
패치 컴퓨터DellN / A
염화나트륨시그마S5886
염화칼시그마P3911
HEPES시그마H3375
중탄산나트륨시그마S5761
인산나트륨 일염기성시그마S0751
D-포도당 시그마G7528
염화칼슘시그마21108
염화마그네슘시그마M8266
발리노마이신시그마V0627-10mg
1,2-디메틸-3-니트로벤젠시그마40870-25ml
테트라키스 칼륨(4-클로로페닐)보레이트시그마60591-100mg
헵탄의 5% 디메틸디클로로실란시그마85126-5ml
TTX케이맨 Chemical Company14964
염산시그마H1758-500mL
수크로오스시그마S9378-5kg
피펫 미세 조작기셔터MP-285 / ROE-200 / MPC-200
대물 렌즈OlympusPlanAPO 10xW
터 륨

참고문헌

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  18. Larsen, B. R., MacAulay, N. Kir4.1-mediated spatial buffering of K(+): Experimental challenges in determination of its temporal and quantitative contribution to K(+) clearance in the brain. Channels Austin Tex. 8 (6), 544-550 (2014).
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