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방법 논문

초음파의 이용 가이드 생물학 관련 전이성 종양 Xenografts의 설립을 위한 세포 이식 조직 감독

7.9K 조회수

DOI:

10.3791/57558

2018년 5월 25일

이 논문에서

요약

여기, 우리는 암에 대 한 신뢰할 수 있는 전 임상 모델을 만드는 생물학 관련 사이트에서 초음파 유도 신경 (NB) 및 Ewing의 육 (ES) 세포의 주입을 활용 (설립 세포 및 종양 환자에서 파생 된 셀) 프로토콜 제시 연구입니다.

초록

항 암 치료의 임상 시험 관련이 종이 식 모델을 암의 타고 난 경향을 모방에 의존 합니다. 표준 피하 측면 모델의 장점 절차 간편 하 고 모니터 종양 진행과 침략 적 영상 없이 응답 하는 기능을 포함합니다. 이러한 모델 자주 변환 임상 시험에서 일치 하지 않는 고 네이티브 microenvironment의 부족으로 전이 생산 하기 위해 낮은 경향으로 생물학으로 관련 된 특성을 제한 했다. 비교에서는, 기본 종양 사이트에서 orthotopic이 종이 식 모델 종양 microenvironment를 모방 하 여 먼 전이성 확산 등 중요 한 질병 특성을 복제 표시 되었습니다. 이러한 모델은 종종 지루한 수술 연장된 마 취 시간 및 회복 기간을 필요합니다. 이 해결 하기 위해 암 연구자는 최근 조직 감독 murine 모델의 신속 하 고 신뢰할 수 있는 설립에 대 한 수 있는 전 임상 실험에 대 한 암이 종이 식 모델 확립을 초음파 유도 주입 기술을 활용 하 고. 초음파 시각화는 또한 종양 engraftment 성장과의 경도 평가 대 한 비 침범 성 방법을 제공 한다. 여기, 우리는 ES에 대 한 주 및 신장이 캡슐에 아드레날린 선의 활용 암 세포의 주입 초음파 유도 하는 방법을 설명 합니다. 이 최소한 침략 적 접근 암 세포 성장 및 전이, 조직 특정 위치에서의 지루한 오픈 수술 주입을 극복 하 고 병 적인 복구 기간 상거래. 우리가 설립된 셀 라인과 orthotopic 주입에 대 한 환자 파생된 셀 라인의 사용률을 설명합니다. 미리 만든된 상업 키트 종양 분리 및 luciferase 셀의 태그에 대 한 사용할 수 있습니다. 이미지 지도 사용 하 여 세포 현 탁 액의 주입 전 임상 모델의 생성에 대 한 최소한 침략 적 하 고 재현 가능한 플랫폼을 제공 합니다. 이 메서드는 방광, 간, 췌 장 수많은 암 모델에 대 한 미 개발된 잠재력을 예증 등 다른 암에 대 한 신뢰할 수 있는 전 임상 모델을 만드는 데 이용 된다.

서론

동물이 종이 식 모델은 새로운 항 암 제 치료의 전 임상 연구를 위한 필수적인 도구입니다. 표준 murine xenografts 종양 성장 모니터링에 대 한 효율적이 고 쉽게 접근할 수 있는 사이트를 제공 하는 셀의 측면은 피하 주입에 의존 합니다. 피하 모델의 단점은1전이를 그들의 잠재력을 제한 수 있습니다 종양 특정 생물 학적 특성의 그들의 부족. 이러한 한계는 종양에서 세포는 전이성 잠재적인2관련 microenvironment를 제공 하는 기본 조직 위치에 engrafted orthotopic xenografts 사용 하 여 극복 됩니다. Orthotopic이 종이 식 모델 원래 생물 학적 기능을 유지 하 고 전 임상 약 발견3,4에 대 한 신뢰할 수 있는 모델을 제공. 암 세포 이식 조직 감독에 대 한 활용은 설립된 셀 라인 또는 환자 종양에서 환자에서 파생 된 셀입니다. 암 세포 선에서 설립 xenografts 환자 파생된 xenografts5에 비해 기본 종양에서 높은 유전 분기를 전시 수 있습니다. 이 감안할 때, 환자 파생 orthotopic xe....

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프로토콜

모든 작업과 미시간 대학 기관 검토 위원회 (흠 00052430)에 따라 수행 되었다 사용과 관리의 동물 (UCUCA)에 대학 위원회에 의해 승인 하는 절차를 따릅니다. 단위에 대 한 실험실의 동물 의학 (ULAM) 동물 보호를 만들었다.

모든 작업과 미시간 대학 기관 검토 위원회 (흠 00052430)에서 승인 되었으며 모든 인간의 연구 윤리 위원회 규정에 따른다. 인간의 세포는 잠재적으로 유해 물질, 그래서 모든 특별 한 예방 조치 및 해당 교육 기관에 필요한 적절 한 biosafety 관행에 따라 간주 됩니다. NSG 마우스는 심하게 immunocompromised 그리고 환경에서 일반적으로 발견 되는 박테리아에 의해 발생 하는 질병에 취약.
이식 하 고 주사를 수행에 대 한 자료를 준비할 때 항상 엄격한 무 균 기술을 사용 합니다.

1. 세포 배양

  1. 최소한의 필수적인 매체 설립된 인간의 NB 셀 라인 (SH-SY5Y, SK-N-BE2, 및 IMR32)을 성장 10% 태아 둔감 한 혈 청, 2mm 글루타민, 100 단위/mL 페니실린, 및 100 μ g/mL 스 보완. 1 mM pyruvate와 0.075% NaHCO3IMR32 셀 추가 보충. 3....

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결과

제시 하는 절차를 사용 하 여, 초음파 유도 주입 주의 세포의 아드레날린 선으로 온수 수술 테이블을 갖춘 전용된 프로시저 룸에서 이루어졌다. 팔과 발 패드 murine 심장 활동 (그림 1A)를 모니터링 하기 위한 배치 했다. 동물 마 취 isoflurane 원뿔 흡입을 사용 하 여 아래에 남아 있었다. 고해상도 초음파 프로브를 사용 하 여 왼쪽된 신장 신장 (그림 1B)에 그냥 두개골 아드레날린 선으로 확인 되었다. 바늘 다음 직접 시각화 (그림 1C)에서 아드레날린 선으로 전진 되었다. 초기이 기술 활용, 동안 methylene 청색 염료 혼합 matrigel 부 신 동맥의 올바른 지역화를 확인 사용 되었다. 동물을 희생 하 고 프로시저의 성공 부 신 캡슐 (그림 1D

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토론

NB 및 ES 세포의 주입 초음파 기반 암 생물학에서 전 임상 연구에 대 한 안정적인 murine xenografts를 설정 하는 효율적이 고 안전한 방법입니다. 초음파 유도의 성공에 중요 한 조직 대상으로 이식 존재와 해부학 관심의 기관 현지화 및 종양 세포의 정위 적 주사에 전문성을 갖춘 훈련 된 인원의 가용성 이다.

종양 조직의 분리 설명된 환자 파생이 종이 식 모델을 개발 하는 중요 한 단계로 판명. 기본 종양 조직 세포 microenvironment 및 주변 기질 종양 통풍 관 또는 engraftment에 영향을 미칠 수 있습니다 포함 되어 있습니다. 셀 계산, 분리 과정 완전 하 던 후, 주입 및 성공적인 종양 engraftment 최적의 셀 수를 고려 하는 2 x 105 셀/10 μ와 샘플에서 세포 밀도의 계기를 제공 합니다.

Luciferase 종양 engraftment의 유효성 검사에 대 한 허.......

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공개 사항

저자 아무 공개 있다.

감사의 글

이 작품은 로버트 우드 존슨 재단/아 모스 의료 교수 개발 프로그램, Taubman 연구소, 그리고 섹션 소아 수술, 미시간 대학에서 지원을 받았다. 저자는 Kimber Converso Baran와 닥터 마커 스 Jarboe 초음파 주입 절차와 지원 및 이미징 플랫폼에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 우리를 통해 그의 그림 그래픽 폴 Trombley 감사합니다. 우리는 또한 분자 이미징 및 종양 이미징 코어 종합 암 센터 NIH에 의해 부분에서 지원 되는 센터의 사용에 대 한 미시간 대학에서 방사선과 부서 감사 P30 CA046592 부여 합니다. 미시간 생리학 형질 코어 NIH (OD016502)와 프 랭 클 순환기 센터에서 교부에 의해 부분에서 지원 되는 대학. 셀 라인 인증 IDEXX RADIL Bioresearch 시설, 컬럼비아, 미주리에서 수행 되었다 우리 태 미 스 톨 박사 Rajen Mody, 모트 고체 종양 종양학 프로그램 감사합니다. 우리의 환자와 가족은 기꺼이 그들의 영감, 용기, 그리고 우리의 연구의 지속적인 지원에 대 한 인정 했다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Mice
NOD-SCIDCharles River394
NSGThe Jackson Laboratory5557
Cell Line 
NB
IMR-32ATCCCCL-127인간 신경모세포종 세포주
확립 SH-SY5YATCCCRL-2266인간 신경모세포종 세포주
SK-N-Be2확립 ATCCCRL-2271인간 신경모세포종 세포주
ES
TC32 human Ewing's Sarcoma cell
A673확립 COGcell.ORGhuman Ewing's Sarcoma cell line
CHLA-25확립 COGcell.ORGhuman Ewing's Sarcoma cell line
A4573COGcell.ORGhuman Ewing's Sarcoma cell line
Cell Line media 확립
RPMILife Technologies11875-093
MatrigelBD BioSciences354234
Dissociation
Dissection ToolsKentScientificINSMOUSEKIT
Human Tumor Dissociation Kit MACS Miltenyi Biotec130-095-929
gentleMACS dissociatorMACS Miltenyi Biotec130-093-235
gentleMACS C tubesMACS Miltenyi Biotec130-096-334
Cell StrainerCorning431751
Luciferase Tagging
Lenti-GFP1 virusUniversity 미시간, Vector CoreLuciferase Virus
Steady Glo-Luciferase Assay KitPromegaE2510
Bioluminescence Imaging
Ivis Spectrum Imaging SystemPerkinElmer124262
D-LuciferinPromegaE160X
Anesthetic
흡입 이소플루란 Piramal Critical Care Inc66794-0017-25
Ultrasound Guided Injection
Vevo 2100 고해상도 이미징Vevo2100
Hamilton 주사기 (27 게이지 바늘)Hamilton80000
22 게이지 혈관 카테터BD Biosciences381423
광학 연고주요 제약301909
NairChurch & Dwight Co제모제
Aquasonic 100 초음파 투과 젤Parker초음파 젤
Histology
CD99DAKOM36011차 항체
Tyrosine HydroxylaseSigma-AldrichT29281차 항체
2차 HRP-폴리머 항체BiocareBRR4056KG
Miscelleneous
10 mL 피펫Fisher Scientific13-676-10J
5 mL 피펫Fisher Scientific13-676-10H
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브Fisher Scientific05-408-129
P1000 피펫Eppendorf
P200 피펫Eppendorf3120000054
P1000 피펫 팁Fisher Scientific21-375E
P200 피펫 팁Fisher Scientific21-375D
휴대용 피펫 에이드Drummond4-000-101
디지털 동물 체중계 KentScientificSCL-1015
캘리퍼스Fisher Scientific06-664-16
6well 낮은 부착 플레이트Corning07-200-601
10cm 조직 배양 처리 접시Fisher ScientificFB012924
폴리브렌Sigma-AldrichTR-1003-G
COGcell.ORG line 확립 3120000062

참고문헌

  1. Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Ann Oncol. 27 (7), 1190-1198 (2016).
  2. Fidler, I. J., Hart, I. R.

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