매핑 대사: 조직에서 직접 젖 산 효소 활동 모니터링

요약

우리 nicotinatmide 아데닌 디뉴클레오티드 인산 (NAD(P)H) + H + 조직 샘플에서 직접 생성 하는 효소 효소 활동의 공간적 분포를 매핑하기 위한 프로토콜 설명.

초록

공간과 시간에 효소 활동을 매핑 하는 것이 정상 조직과 질병에서 셀 동작의 분자 기초를 이해 하기 위한 중요 합니다. 신진 대사 활동 분석 실험 현장에 는 조직 내에서 신진 대사 활동의 공간적 분포에 대 한 정보를 제공할 수 있습니다. 여기 조직 샘플에서 직접 효소 젖 산 효소의 활동을 모니터링 하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 젖 산 효소 포도 당 소비 호 기성 또는 혐 기성 해당 분해를 통해 에너지로 변환 하는 것입니다 여부의 중요 한 결정 이다. 젖 고 나드를 포함 하는 솔루션은 냉동된 조직 섹션에 제공 됩니다. 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD) NADH를 검출 될 수 있다 양성자의 감소에 따라 제공 하는 동시에 변환 하는 동안 높은 젖 산 효소 활동에 포함 된 셀 pyruvate에 제공 된 젖 산을 변환 됩니다. nitrotetrazolium 블루 침전으로 시각화 formazan 블루. 우리는 마우스 피부에서 젖 산 효소 활동을 모니터링 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜을 적용, 우리는 젖 산 효소 활동은 높은 무부하 머리 여 포 줄기 세포는 피부 내에 발견. 마우스 미 발달 섬유 아 세포 보다 배양된 미 발달 줄기 세포에서 높은 얼룩 공개 교양된 마우스 배아 줄기 세포를 적용 하는 프로토콜. 갓 절연된 마우스 대동맥의 분석 계시 수직 대동맥 평활 근 세포에 얼룩. 제공 하는 방법론 공간적으로 냉동 또는 신선한 조직에 양성자를 생성 하는 효소의 활동을 매핑하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

있는 효소는 높은 또는 낮은 활동 조직 내의 위치를 이해 하는 것은 이해 개발 및 생리학에 대 한 필수적입니다. 사본 또는 단백질 레벨은 효소 활동에 대 한 대리 모 알선으로 자주 사용 된다. 이러한 연구는 유익 수 있습니다, 그들은 포스트 번역 상 수정, 단백질 복합물, 또는 효소의 subcellular 지 방화의 존재 하는 효소의 활동을 결정 하기 위한 중요 한 수 있는 정보를 제공 하지 않습니다. 효소 활동은 직접 측정 하는 경우 더 이상 높은 또는 낮은 활동은 조직 내에서 혼합물 또는 셀의 공간 분포 내에서 개별 셀에 대 한 정보를 포함 하는 무 균된 단백질 lysates에 자주 모니터링 합니다.

여기는 조직 샘플 내에서 효소 활동의 공간 배급을 매핑하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 방법론은 tetrazolium 염 dehydrogenases, reductases, 및 냉동된 조직¹에서 oxidases의 활동을 지역화를 사용할 수 있습니다 설명 하는 이전 연구를 기반으로 합니다. 이러한 방법으로, 물 불용 성 formazan 형성 때 양성자 tetrazolium 소금^2,3에 전송 ....

프로토콜

설명 하는 모든 실험 동물 관리 위원회, 로스 앤젤레스가 주 대학에 의해 승인 되었다.

1. 냉동된 마우스 스킨의 슬라이드 생성

1. 기관 정책에 따라 마우스를 안락사
   참고: 보호에 대 한 제도적 정책을 따릅니다. 동물 관련 된 모든 프로토콜 기관 동물 관리 위원회에 의해 승인을 받아야 한다.
2. 동물 털 트리머 사용 마우스의 머리를 제거 합니다.
3. 가 위를 사용 하 여 피부에 절 개를 확인 합니다. 집게를 사용 하 여 마우스에서 피부를 들어올립니다. 멀리 피부 섹션을 잘라가 위를 사용 하 여.
4. cryomold 복합 시 약 동결을 채우십시오 ( 재료의 표참조).
5. 바늘 코 집게를 사용 하 여 채워진된 cryomolds에 장소 피부 섹션입니다. 동양 피부 있도록 조직 조각 표 피에서 진 피, hypodermis와 근육 (그림 2)에 피부의 횡단면을 생성 합니다.
   참고: 가능 하면 실험 탑재 하 고 동일한 슬라이드에 구분 하 고 함께 처리 수 있도록 동일한 cryomold에서 함께 마우스 제어. 거품을 만드는 것이 아니라는 것을 주의.
6. 드라이 아이스는 얼음 양....

결과

우리는 이전 제자리에 활동 분석 실험 마우스 피부²⁰에 대 한 결과 보고 있다. 그림 3에서 같이, 우리는 절차는 위에서 설명한 때 머리 여 포의 기지에서 머리카락 뿌리 줄기 세포에서 젖 산 효소 활동의 높은 수준을 다음 관찰. 이러한 결과 형광 활성화 된 세포 피부의 머리 여 포 줄기 세포에 대 한 정렬 및 정렬된 셀에 활동 분석 실험과 줄기 세포 구획에 높은 젖 산 효소 활동을 확인에 의해 뒷받침 했다.

머리 여 포 줄기 세포는 높은 젖 산 효소 활동 우리의 연구 결과 바탕으로, 우리 교양된 미 발달 줄기 세포의 연구를 확장. 마우스 미 발달 섬유 아 세포 급지대 계층으로 혼자 또는 배아 줄기 세포의 존재를 분석 했다. 배양된 세포를 분석 하려면 매.......

토론

여기 설명 하는 방법은 젖 산 효소 또는 다른 세포 유형 조직 내에서 또는 시간이 지남에 따라 조직의 다른 부분에서에서 NADH 또는 NADPH를 생성 하는 다른 대사 효소의 활동을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 젖 산 효소, 종양 줄기 세포의 생물학을 이해 하기 위한 중요 한 효소 이며 개별 셀에서 젖 산 효소 활동을 모니터 하는 능력이이 효소의 기능에 중요 한 통찰력을 제공할 것입니다.

이 프로토콜의 중요 한 장점은 다른 방법론에 비해 하나는 모니터 효소 활동, 보다는 그냥 단백질 풍부 하, 더 결정적인에 대 한 정보 뿐 아니라 어디 젖 산 효소 효소에에서 발생할 수 있습니다. 현재, 하지만 어디 그들은 실제로 기능. 여기에 설명 된 방법은 선택 된 단백질, 예를 들어, 셀 혈통 마커 수준은 젖 산 효소 활동으로 같은 조직 샘플에서 결정 되도록 immunohistochemistry와 결합할 수 있습니다. 젖 산 효소 활동을 모니터링 하기 위한 MRI-기반 접근, 비교.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
안락사된 쥐의 피부를 채취하기 위한	수술 기구
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm	Fisher Scientific	NC9511236	쥐 피부 동결용
Tissue-Tek O.C.T. 화합물	Fisher Scientific	NC9638938	cryomolds 장착용
얼음 양동이	Fisher Scientific	07-210-106
드라이 아이스
폴리신 접착 슬라이드	Fisher Scientific	12-545-78
4% 포르말린	Fisher Scientific	23-245-684	물에 희석,
인산염 완충 식염수, pH 7.4
와류
트리스 염기	Fisher Scientific	23-245-684
NAD	시그마-알드리치	N7004
페나진 메토설페이트	시그마-알드리치	P9625
니트로테트라졸륨 블루 클로라이드	시그마-알드리치	N6876
리튬 L-락테이	트 시그마-알드리치	L2250	기판
37° C 인큐베이터 (또는 조직 배양 인큐베이터)
브라질! 카운터 스테인	Anatech	861	카운터 스테인
마운팅 매체	Vector Laboratories	H-5000
슬라이드용 커버 슬립	Fisher Scientific	12-544D
광학 현미경