시 냅 스에서 사이클링 하는 FM 염료: 높은 칼륨 도발은, 전기 및 Channelrhodopsin 자극을 비교

요약

시 냅 스 소포 (SV) 자전거는 신경 시 냅 스에서 세포 커뮤니케이션의 핵심 메커니즘. FM 염료 통풍 관 및 릴리스 양적 SV 엔도-및 exocytosis 시 금의 기본 수단입니다. 여기, 우리는 모든 자극 방법 FM1 43 초파리 신경 근육 학 교차로 (NMJ) 모델 시 냅 스에서 자전거를 비교 합니다.

초록

FM 염료는 시 냅 스 소포 (SV) 주기를 공부 하는 데 사용 됩니다. 이러한 amphipathic 프로브는 친수성 머리와 소수 성 꼬리, 수용 성 역 입력 하 고 종료 막 지질 bilayers 능력 들을 만들고 있다. 이러한 styryl 염료는 상대적으로 비-형광 수성 매체에 있지만 원형질 막의 외부 전단에 삽입 한 > 형광 40 X 증가. 신경 시 냅 스에서 FM 염료는 SV endocytosis, 매매 모두 시간과 SV 풀 사이 함께 출시 된 SV exocytosis neurotransmission의 연 접 단계를 시각화 하는 강력한 도구를 제공 하는 동안 내 면. Glutamatergic 냅 개발 및 기능의 기본 유전자 모델은 Drosophila 신경 근육 학 교차로 (NMJ), FM 영상을 염색 SV 역학 돌연변이 조건의 넓은 범위에서 계량을 광범위 하 게 사용 되었습니다. NMJ 시 냅 스 터미널은, 아름 다운 배열의 큰 시 냅 스 boutons 이미징 응용 프로그램에 적합 합니다. 여기, 우리가 비교와 초파리 NMJ 활동 종속 FM1 43 염료 글귀/릴리스를 자극 하는 세 가지 방법으로 대조: 높은 [⁺K] 신경 근육 학 조직 depolarize, 2) 흡입 전극 모터 신경의 응용 프로그램 1) 목욕 연 접 신경 맨끝, 및 3 depolarize를 자극) 대상의 도발은 빛 자극, 공간 제어를 위한 channelrhodopsin 이체의 유전자 변형 식. 이러한 메서드의 마다 장점과 단점 SV 주기 유전자 변이 효과의 연구에 대 한 초파리 NMJ에. 우리는 이러한 장점과 단점 각 전략을 구체적인 방법론을 함께 자극 방식의 선택에 도움을 논의할 예정 이다. 형광 이미징, 뿐만 아니라 FM 염료 ultrastructural 수준에서 SV 사이클 메커니즘 연구를 전송 전자 현미경 (TEM)을 사용 하 여 시각화 하는 전자 밀도 신호를 photoconverted 수 있습니다. 우리 confocal의 비교를 제공 하 고 전자 현미경 이미징 도움말 가이드에 초파리 NMJ 자극의 다른 방법에서 미래 실험 패러다임의 선택.

서론

초파리 애벌레 신경 근육 학 교차로 (NMJ) glutamatergic 냅 모델 아름 답게 특징은 시 냅 스 형성 유전자 섭¹의 광대 한 스펙트럼과 기능을 공부 하 고 사용 되었습니다. 여러 축 삭 분 지, 각각 많은 확대 시 냅 스 boutons 모터 신경 맨끝에 의하여 이루어져 있다. 이 널찍한 varicosities (최대 5 µ m 직경에서) neurotransmission 기계, 균일 한 glutamatergic 시 냅 스 소포를 포함 하 여 모든 포함 (SVs; ~ 40 nm 직경에서) cytosolic 예비에 쉽게 releasable 풀². 이 소포는 연 접 원형질 막 퓨전 사이트 활성 영역 (AZs), 어디 exocytosis 트랜스에 대 한 조미료 신경 전달 물질 방출을 중재에 도킹-시 냅 스 통신. 그 후, SVs는 반복된 엑 소/endocytosis 사이클 키스 실행 재활용 또는 clathrin 중재 된 endocytosis (CME)를 통해 원형질 막에서 검색 됩니다. Drosophila NMJ은 쉽게 접근 가능 하 고 모두 분리 및 SV 주기 돌연변이 적합. 앞으로 유전 스크린을 사용 하 여, 새로운 돌연변이 SV 사이클³에 대 한 중요 한 새로운 유전자의 식별을 끌고있다. 또한, 이미 알려진된 유전자로 시작 하는 역 유전 접근은 돌연변이 고기⁴사이클의 주의 설명을 통해 새로운 SV 사이클 메커니즘의 해명에 이르렀다. Drosophila NMJ 광학 트랙 소포 neurotransmission 동안 순환 하는 방법을 통해 SV endocytosis 및 exocytosis 메커니즘을 해 부에 대 한 실험 시 냅 스 준비로 거의 이상적 이다.

다양 한 형광 마커 중 역학, 소포의 시각적 추적 허용 하지만 가장 다재 다능 한 마오, F., 동부 표준시 알에 의해 처음 합성 FM 염료 아날로그. ⁵. FM 염료는 친수성 머리와 스펙트럼 속성 부여 중앙 지역으로 향기로운 반지를 통해 연결 된 질 성 꼬리를 포함 하는 구조적으로. 이러한 styryl 염료 역 막에 분할 할 하지 '플립플롭' 막 전단지 사이 고 그래서 결코, cytosol에서 무료 고 물⁵보다 훨씬 더 막에 형광. 지질 bilayer에 가역 삽입 형광⁶에 40-fold 증가 발생합니다. 신경 시 냅 스에서 클래식 FM 염료 라벨 실험 SV endocytosis 통해 염료를 로드 depolarizing 자극 하는 동안 염료와 시 냅 스 준비 목욕 이루어져 있다. 외부 염료 다음 씻 고 SV 주기 이미지 로드 시 냅 스⁷를 칼슘 무료 벨소리 솔루션에 체포 됩니다. 염료 무료 목욕에 자극의 두 번째 라운드 exocytosis, 형광 강도 감소를 측정 하 여 따라 할 수 있는 과정을 통해 FM 석방을 트리거합니다. 풀 vesicles의 수백을 포함 하는 단일 소포에서 SV 인구 양적 모니터링된^6,7일 수 있다. 기능적으로 뚜렷한 SV 풀의 활동-종속 동원 해 부 키스-및-실행 CME 사이클링^8,9대를 비교 하 고 FM 염료 사용 되었습니다. 방법은 별도로 분석 결과 갖는, 자연과 소형 시 냅 스 사이클 활동 (아주 작은 형광 변화를 감지 하 여 photobleaching를 줄이기 위해 매우 중요 한 장비)와¹⁰에 수정 되었습니다. 분석 실험으로 확장할 수 있습니다 ultrastructural 단계로 photoconverting 형광 FM 신호 전송 전자 현미경 검사 법^{11,12,13,14 전자 밀도 라벨으로} .

역사적으로, 칼륨 ("높은 [K⁺]" 라 함)의 높은 농도에 입욕 시 냅 스 준비 되었습니다 depolarizing SV 사이클링;을 유도 하는 자극에 대 한 선택의 방법 개구리 해 NMJ⁵년까지 경작 설치류 두뇌 hippocampal 신경¹⁵, 초파리 glutamatergic NMJ 모델^16,17. 높은 [K⁺] 이렇게 간단, 특수 장비, 필요 고 따라서 대부분의 실험실에 액세스할 수 하지만 응용 프로그램 및 데이터 해석에 대 한 제한이 있습니다. 훨씬 더 순수 적절 한 방법을 사용 하는 신경^4,5,12의 흡입 전극 전기 자극. 이 방법은 활동 전위 전파 연 접 신경의 직접적인 자극에 대 한 터미널, 고 결과 electrophysiological 분석 neurotransmission 함수^{13,14의 직접 비교 될 수 있다 15}, 하지만 특수 장비를 필요로 하 고 기술적으로 훨씬 더 도전적인는. Optogenetics의 출현으로 channelrhodopsin 신경 자극의 사용 이진 Gal4/UAS 시스템²⁰을 사용 하 여 채널 식의 꽉 spatiotemporal 제어를 포함 하 여 추가적인 이점이 있다. 이 방법은 흡입 전극 자극 보다 기술적으로 훨씬 쉽게 하며 매우 저렴 한 LED 광원 보다 아무것도 더. 우리 모두 비교 하 고 대조 초파리 NMJ에서 이러한 세 가지 다른 자극 방법 FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide)의 이미지를 사용 하는 여기,: 간단한 높은 [K⁺ ], 전기 및 새로운 channelrhodopsin 접근을 도전.

프로토콜

1. 애벌레 접착제 해 부

1. 철저 하 게 혼합 실리콘 탄성 엘라 스토 머 키트 (자료 테이블)에서 에이전트를 경화 실리콘 탄성 중합체의 1 부분으로 기본의 10 개 부분.
2. 몇 시간 (때까지 더 이상 터치 스티커)에 대 한 탄성 중합체와 75 ˚C에서 뜨거운 접시에 치료 22 x 22 m m 유리 coverslips 코트.
3. 단일 탄성 중합체 코팅 유리 coverslip을 애벌레 해 부에 대 한 준비에 맞춤 plexi 유리 절 개 챔버 (그림 1, 하단)에 넣으십시오.
4. 표준 microelectrode 끌어당기는 사람을 사용 하 여 원하는 테이퍼 팁 크기를 붕 규 산 유리 모 세관에서 접착제 펫을 준비 합니다.
5. 부드럽게 micropipette 팁 오프 하 고 다른 쪽 끝을, 유연한 플라스틱 튜브 (1/32"내부 직경, ID 3/32" 외부 직경, OD, 1/32"벽;의 2 피트 자료의 테이블) 와 입 (P2 피 펫 팁) 피팅.
6. 애벌레 해 부에 대 한 준비에 접착제 (자료 테이블)의 작은 양 (~ 20 µ L)으로 작은 컨테이너 (0.6 mL Eppendorf 관 모자)를 채우십시오.
7. 챔버 (mM)에 염 분 채우기: 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, 70 자당 및 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 산 (HEPES) pH 7.2.
8. 알 렉 사 Fluor 647에 활용 된 안티-말 무 과산화 효소 (HRP) 항 체를 추가 (안티-HRP:647; 1 mg/mL 재고에서 희석 1시 10분)은 NMJ를 라벨에 대 한 해 부^21,22동안 연 접 맨끝.
9. 좋은 붓 (크기 2)를 사용 하, 식품 유리병에서 방황 하 고 세 번째 탈피를 제거 하 고 탄성 중합체 코팅 커버 유리에 놓습니다.
10. 유리 제 micropipette 팁을 첨부 (1.5 단계)와 입에 의해 생성 된 부정적인 공기 압력을 사용 하 여 접착제의 작은 볼륨을 채우십시오.
11. 위치 유 충 등 사이드를 집게와 접착제 탄성 중합체 코팅 coverslip 작은 머리 입으로 긍정적인 공기 압력을 사용 하 여 접착제의 드롭.
12. 확인 하 고 동물 상당량이 두 접착제 첨부 파일 사이의 긴장 된 유 충의 후부 끝이 절차를 반복 합니다.
13. 가 위를 사용 하 여 (블레이드 3 m m; 테이블의 자료), 후부 및 수직 컷 등 쪽 midline 따라 수평 컷 (~ 1 m m)를 확인.
14. 부드럽게 잘 집게 (#5, 테이블의 자료)를 사용 하 여 등 기관, 창 자, 뚱뚱한 몸 및 다른 내부 장기를 덮고 있는 근육 제거.
15. 4 몸 벽 날개, 수평 및 수직으로 체 벽을 부드럽게 스트레칭 하를 접착제로 붙이는 절차를 반복 합니다.
16. 집게를 사용 하 여 복 부 신경 코드 (VNC), 신중 하 게 모터 신경은가 위로 잘라 들어올린 다음 VNC를 완전히 제거.
17. 해 부 생리를 바꿉니다 캘리포니아^{2 +}-SV를 막으려고 (CaCl₂없이 위의 해 부 식 염 수와 동일)는 염 분을 무료 자전거.

2. 옵션 1: 높은 [K⁺] FM 염료 로드

1. FM1 43 재고 솔루션 (4 m m)에서 90 m KCl 해결책 (높은 [K⁺] 해 부 염 분에서) 4 µ M의 최종 농도 대 한 m의 1 mL에 1 µ L를 추가 합니다.
2. 교체를 피 펫을 사용 하 여 Ca^{2 +}-SV endocytosis 염료의 통풍 관을 자극 하 고 [K⁺] FM 염료 솔루션과 영상 실에서 무료 염 분.
3. 즉시 시작 자극 기간 depolarizing [K⁺]의 미리 결정 된 기간에 대 한 디지털 타이머 (예., 5 분; 그림 2)입니다.
4. 건강 한 애벌레 준비를 확인 하려면 높은 [K⁺] 도발은 기간 동안은 근육의 강한 수축 note.
5. 타이머 기간 끝나면 신속 하 게 높은 [K⁺] FM 염료 솔루션을 제거 하 고 대체 캘리포니아^{2 +}-SV를 막으려고 무료 염 분 사이클링.
6. 캘리포니아^{2 +}빠른 승계에서 세척-높은 [K⁺] FM 염료 솔루션 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.
7. 신선한 캘리포니아^{2 +}에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경으로 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.

3. 영상: Confocal 현미경 검사 법

1. 똑바로 confocal 현미경을 사용 하 여 이미지 NMJ 염료 형광 (다른 현미경 사용 될 수 있다)에 물 집중 목표 X 40.
2. 이미지 근육 복 부 세그먼트 2-4 (다른 NMJs 몇 군데 수)의 4 NMJ 적절 한 소프트웨어 (테이블의 재료)를 사용 하 여 이미지를 수집 하 고.
3. HeNe 633 nm 레이저를 사용 하 여 HRP:647 (와 긴 패스 필터 > 635 nm)와 아르곤 488 nm 레이저 FM1-43 (대역 통과 필터 530-600 nm)와 자극을 자극.
4. 운영 체제는 최적의 이득 및 두 채널에 대 한 오프셋을 결정 합니다.
   참고:이 설정은 실험의 나머지 부분에 걸쳐 일정 한 유지 됩니다.
5. 시 냅 스 터미널의 바닥에 HRP 표시 위에서 전체 선택한 NMJ 통해 confocal Z 스택 가져가 라.
6. 주의 주의 NMJ 몇 군데 (세그먼트, 측면 및 근육)의 FM 역 염색 후 정확한 동일한 NMJ에 초과 되도록 합니다.

4. 높은 [K⁺] 자극: FM 염료 내리기

1. 대체 캘리포니아^{2 +}-무료 염 분 높은 [K⁺] 염 (FM1 43 염료) 없이 드라이브 도발은를 가진 SV exocytosis 염료 릴리스.
2. 높은 [K⁺] 자극 기간 미리 결정 된 기간에 대 한 디지털 타이머를 즉시 시작 (예., 2 분; 그림 2)입니다.
3. 타이머 기간 끝나면 즉시 높은 [K⁺] 염 분을 제거 하 고 대체 캘리포니아^{2 +}-SV를 막으려고 무료 염 분 사이클링.
4. 캘리포니아^{2 +}빠른 승계에서 세척-높은 [K⁺] 염 분 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.
5. 신선한 캘리포니아^{2 +}에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경으로 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.
6. 동일한 confocal 설정을 사용 하 여 위에서 설명한 동일한 NMJ에 FM1 43 염료 형광 이미지를 특정 수 있습니다.

5. 옵션 2: 전기 자극 FM 염료 로드

1. 필요한 테이퍼 팁 크기를 microelectrode 끌어당기는 사람 (테이블의 재료)를 사용 하 여 흡입 피 펫을 준비 합니다.
2. 화재-폴란드어 마이크로 포지 microelectrode 끝까지 단일 모터 신경 꽉 맞는와 빨려 수 있습니다.
3. micromanipulator에 흡입 피 펫 전극 홀더에 고 긴 유연한 플라스틱 튜브와 주사기를 연결 하십시오.
4. 자극 매개 변수 설정 (예., 15 V, 20 Hz 주파수, 20 ms 기간 및 시간 5 분 (그림 2) 또는 1 분 (그림 3)).
5. 대체 Ca^{2 +}-FM1 43 염 분 (4 µ M, 1 mM CaCl₂) 전기 생리학 장비에 위의 애벌레 준비에 무료 염 분.
6. 현미경 단계에 준비 넣고 유 충과 흡입 피펫은 초점 (40 X 물 침수 목표)에 때까지 무대를 마련 합니다.
7. 부정적인 공기 압력 흡입 전극으로 주사기에 의해 생성 된 선택 된 hemisegment를 innervating 컷된 모터 신경의 루프를 빨 아.
8. 선택 된 hemisegment에 있는 근육 수축에 대 한 시각적으로 모니터링 하는 동안 자극의 짧은 버스트와 함께 흡입 전극 기능을 테스트 합니다.
9. SV endocytosis를 선택한 매개 변수 (단계 5.4) 및 FM1 43 염료의 통풍 관 (그림 2)를 사용 하 여 모터 신경 자극.
10. 캘리포니아^{2 +}빠른 승계에서 세척-FM1 43 염료 솔루션 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.
11. 신선한 캘리포니아^{2 +}에서 애벌레 준비를 유지-위에서 confocal 영상 프로토콜을 사용 하 여 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.
12. (세그먼트, 측면 및 근육) FM 염료 내리기 후 정확한 동일한 NMJ에 대 한 액세스를 보장 하기 위해 몇 군데 NMJ의 주의 기록해 둡니다.

6. 전기 자극: FM 염료 내리기

1. 대체 Ca^{2 +}-(FM1 43 염료) 없이 일반 식 염 수와 염 분 및 전기 생리학 장비 무대에 다시 준비를 놓습니다.
2. 역에 대 한 자극 매개 변수 설정 (예를 들어, 15 V, 20 Hz 주파수, 20 ms 기간 및 2 분 (그림 2) 또는 20 시간 (그림 3)).
3. 동일한 모터 신경, 위와 같이 동일한 전극에 빨 아 그리고 SV exocytosis FM1 43 염료 릴리스를 활성화 하 자극.
4. 캘리포니아^{2 +}빠른 승계에서 세척-외부 염료 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.
5. 신선한 캘리포니아^{2 +}에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경으로 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.
6. 동일한 confocal 설정을 사용 하 여 위에서 설명한 동일한 NMJ에 FM1 43 염료 형광 이미지를 확인 합니다.

7. 옵션 3: Channelrhodopsin 자극 FM 염료 로드

1. ChR2 공동 인자 모든 trans 망막 (에탄올에 용 해, 100 µ M 최종 농도)를 포함 하는 음식에 ChR2 표현 애벌레를 올립니다.
2. 카메라 포트를 장착 해 부 현미경 스테이지에 플 렉 시 유리 챔버에 애벌레 준비를 놓습니다.
3. 파란색 LED를 연결 (470 nm; 자료의 테이블) 프로그래밍 가능한 자극 하는 동축 케이블을 사용 하 고 카메라 포트에 LED를 배치.
4. 블루 LED 빛 빔 현미경 확대/축소 기능을 사용 하 여 해 부 애벌레 함수에 초점.
5. 대체 Ca^{2 +}-optogenetic 스테이지의 FM1 43 염 분 (4 µ M, 1 mM CaCl₂) 위의 애벌레 준비에 무료 염 분.
6. (예를 들어, 15 V, 20 Hz 주파수, 20 ms 기간 및 시간 5 분 (그림 2)의) 자극 기를 사용 하 여 LED 매개 변수를 설정 합니다.
7. 빛 자극을 시작 하 고 (예를 들어, 5 분; optogenetic 자극 기간 미리 결정 된 기간에 대 한 타이머 추적 그림 2)입니다.
8. 타이머 중지, 신속 하 게 FM 염료 솔루션을 제거 하 고 대체 캘리포니아^{2 +}-SV를 막으려고 무료 염 분 사이클링.
9. 캘리포니아^{2 +}빠른 승계에서 세척-FM 염료 솔루션 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.
10. 신선한 캘리포니아^{2 +}에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경 위에서 이미징 프로토콜을 사용 하 여 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.
11. (세그먼트, 측면 및 근육) FM 염료 내리기 후 정확한 동일한 NMJ에 대 한 액세스를 보장 하기 위해 몇 군데 NMJ의 주의 기록해 둡니다.

8. Channelrhodopsin 자극: FM 염료 내리기

1. 대체 캘리포니아^{2 +}-카메라 포트 LED와 해 부 현미경 스테이지 (FM1 43 염료) 없이 일반 염 분으로 무료 염 분 유 충에 초점을 맞춘.
2. 언로드 (예를 들어, 15 V, 20 Hz 주파수, 20 ms 기간 및 2 분 (그림 2)의 시간)에 대 한 자극 매개 변수를 설정 합니다.
3. 빛 자극을 시작 하 고 optogenetic 자극 기간 미리 결정 된 기간에 대 한 타이머 추적 (예: 2 분; 그림 2)입니다.
4. 타이머 기간 끝나면 빨리 FM 염료 솔루션을 제거 하 고 바꿉니다 캘리포니아^{2 +}-SV를 막으려고 무료 염 분 사이클링.
5. 캘리포니아^{2 +}빠른 승계에서 세척-외부 염료 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.
6. 신선한 캘리포니아^{2 +}에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경으로 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.
7. 동일한 confocal 설정을 사용 하 여 위에서 설명한 동일한 NMJ에 FM1 43 염료 형광 이미지를 확인 합니다.

9. 형광 정량화

1. 이미지 J (NIH 오픈 소스)에서 이미지를 로드 하 고 이미지를 클릭 하 여 최대 강도 투영을 만듭니다 | 스택 | Z 프로젝트입니다.
2. 안티를 사용 하 여-HRP:647 채널, 이미지 이동 | 조정 | 임계값와 슬라이드 그냥 NMJ 선택 될 때까지 상단 도구 모음.
3. 자동 선택 도구 사용 하는 NMJ에 클릭 합니다. 불연속은 NMJ 이면 Shift 버튼을 누른 상태 고 모든 부품을 선택 합니다.
4. FM1 43 염료로 이미지를 변경 하 고 이동 분석 | 형광 측정을 측정 합니다.
5. (식별 된 세그먼트, 측면 및 근육) 같은 NMJ에서 "내려진된" 이미지에 대 한 단계 9.1-9.4 반복 합니다.
6. 로드 된 염료의 백분율을 얻으려면, 언로드/로드 형광 강렬의 비율을 가져가 라.
   참고:이 절차는 "타원형" 또는 "자유형" 선택 도구를 사용 하 여 bouton 당 bouton 기준 형광 분석을 수정할 수 있습니다. 배경 형광 근육 형광을 샘플링 하 여 공제 될 수 있습니다. 에이전트를 줄이기 위해이 배경을 추가할 수 있습니다.

결과

그림 1 프로토콜 이미징 활동 종속 FM 염료에 대 한 작업 흐름을 보여 줍니다. 실험은 항상 이후에 사용 되는 자극 방법에 관계 없이 같은 애벌레 접착제 해 부로 시작 합니다. 그림 1a 보여주는 복 부 신경 코드 (VNC), 신경 및 반복된 hemisegmental 근육 패턴을 발산 해 부 유 충의 회로도 이다. VNC 제거 되 고 준비 FM1-43 (그림 1b, 핑크)의 4 µ M 솔루션에 목욕. 준비는 다음 활동 종속 SV endocytosis (그림 1cI-III) 통해 염료를 로드 하는 세 가지 가능한 옵션 중 하나를 사용 하 여 FM 염료의 자극. 다음, FM 염료 사용 하 여 Ca^{2 +}체포 사이클...

토론

높은 [K⁺] 염 분 depolarizing 자극은 훨씬 활동 종속 FM 염료 사이클링, 하지만 가능성이 적어도 생리²⁹에 대 한 세 가지 옵션의 쉬운. 이 간단한 방법은 모든 액세스할 수 셀 전체 동물에 depolarizes 하 고 그래서 감독된 연구를 허용 하지 않습니다. 로컬로 micropipette와 높은 [K⁺] 염 분을 적용 하는 것만이 여전히 사전/postsynaptic 세포와 시 냅 스 연결 가능성이 명과¹depolarize 것입니다. 또 다른 주요 관심사는 그 높은 [K⁺] 도발은 드라이브 빠른 형성의 대량 endosomes 거의 unstimulated boutons에서 볼 수 있습니다. 그러나, 대량 endosome 형성 변이²⁹, 진짜 생리 적인 과정을 나타내는 의해 차단 하는 활성 메커니즘입니다. 따라서, 높은 [K

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
SylGard 184 실리콘 엘라스토머 키트	Fisher Scientific	NC9644388	해부용 커버 유리
커버 유리 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	해부용 SylGard
알루미늄 상단 핫 플레이트 유형 2200	Thermolyne	HPA2235M	SylGard
플렉시 유리 해부 챔버	경화 N/A	N/	A 핸드메이드
붕규산 유리 모세 필러리	WPI	1B100F-4	흡입 및 접착제 마이크로 피
만들기 레이저 기반 마이크로 피펫 풀러	셔터 기기	P-2000	흡입 및 접착제 마이크로 피펫 만들기
Tygon E-3603 Laboratory Tubing	Component Supply Co.	TET-031A	구강 및 흡입 피펫용
P2 피펫 팁	USA Scientific	1111-3700	구강 피펫용
0.6-mL Eppendorf 튜브 캡	Fisher Scientific	05-408-120	해부용 접착제 투
Vetbond 3M	WPI	베트본드	해부에 사용되는 접착제
염화칼	Fisher Scientific	P-217	Forsaline
염화나트륨	Millipore Sigma	S5886	식염
염화 마그네슘	Fisher Scientific	M35-500	식염
칼슘 염화물 이수화물	Millipore	Sigma C7902	염수
자	Fisher Scientific	S5-3	식염수
HEPES	Millipore Sigma	H3375	식염수
HRP : Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	신경 세포막 라벨링
Paintbrush	Winsor & Newton	94376864793	유충을 조작하기 위해
Dumont Dumostar 핀셋 #5	WPI	500233	해부 중 사용
7cm McPherson-Vannas Microscissors(블레이드 3mm)	WPI	14177	해부 중 사용
FM1-43	Fisher Scientific	T35356	형광 스티릴 염료
디지털 타이머	VWR	62344-641	FM 염료 로드/언로드 타이밍용
LSM 510 META 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경	Zeiss		형광 마커 이미징
Zen 2009 SP2 버전 6.0	Zeiss		소프트웨어 컨포칼
HeNe 633nm 레이저	Lasos		이미징 중 HRP : 647 Argon
488nm 레이저	Lasos		이미징 중 FM 염료 여기
Micro-Forge	WPI	MF200	To Fire Polish Glass 마이크로피펫
20mL 주사기 슬립 팁	BD	301625	전기 자극을 위해 축삭을 빨아들입니다.
마이크로 매니퓰레이터 (마그네틱베이스)	Narishige	MMN-9	전기 자극을위한 흡입 전극을 제어하기 위해
Stimulator	Grass	S48	LED 및 전기 자극을 제어하기 위해
Zeiss Axioskop 현미경	Zeiss		전기 자극 중에 사용됩니다.
40X Achroplan Water Immersion Objective	Zeiss		전기 자극 및 컨포칼 이미징 중 사용
All-trans Retinal	Millipore Sigma	R2500	ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port	Zeiss	2000-C	channelrhodopsin stimulation
LED 470nm	ThorLabs	M470L2	ChR 활성화에 사용
T-Cube LED 드라이버	ThorLabs	LEDD1B	LED
전원 공급 장치	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	에 전원을 공급하려면
	ThorLabs	PM100D	LED 강도를 측정합니다