방법 논문

만성 림프모구 백혈병에서 면역 글로불린 유전자 순서 분석: 시퀀스 해석 환자 자료에서

DOI:

10.3791/57787

⸱

2018년 11월 26일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Applied Biosciences, Centre for Research and Technology Hellas, 2Department of Immunology, Genetics and Pathology, Science for Life Laboratory, Uppsala University, 3Department of Molecular Medicine and Surgery, Karolinska Institutet, 4Division of Immunology, Transplantation and Infectious, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 5Department of Immunology, Laboratory for Medical Immunology, Erasmus University Medical Center, 6Hematology Department, Nikea General Hospital, 7Assistance publique - Hôpitaux de Paris (AP-HP), Hopital Pitié-Salpêtrière, Department of Hematology, and UPMC University Paris 06, UMRS 1138, 8Division of Experimental Oncology, IRCCS Istituto Scientifico San Raffaele and Università Vita-Salute San Raffaele

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 우리 제시 내용은 기술적인 측면 및 만성 림프모구 백혈병 (CLL) 환자에서 강력한 IG 유전자 순서 분석을 위해 필수적인 요구 사항에 유럽 연구 이니셔티브의 축적 된 경험에 기반 하는 프로토콜 CLL (에릭)입니다.

초록

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B 세포 성숙, 동안 면역 글로불린 (IG) 유전자 V (D) J 재결합의 복잡 한 과정 각 개별 B 세포 내에서 독특한 DNA 시퀀스에 신체적인 hypermutation (SHM) 제공 증가 함께 결합. 이후 B 세포 악성 결과 단일 셀의 클론 확장에서 IG 유전자 독특한 분자 서명 일반적인 개별 환자; 내 모든 악성 세포 대표 따라서, IG 유전자 재배열 클론 표식으로 사용할 수 있습니다. 중요 한 클론 식별자로 봉사 이외에 IG 유전자 시퀀스 이후 특정 발달 단계와 관련 하 고 따라서 종양 약 변환에 관련 된 B 세포의 역사를 반영 하는 '분자 타임 라인'으로 작동할 수 있다. 또한, 특정 악성 종양에 대 한 특히 만성 림프모구 백혈병 (CLL), IG 유전자 시퀀스 보유 전조 및 잠재적으로 예측 기능. 즉, IG 유전자 순서 분석에서 의미 있는 결론을 바탕 불가능할 경우 강력한 방법 및 도구 들의 분석에 도움이 사용할 수 없었습니다. 이 기사, CLL (에릭), 정보 기술 측면 및 필수 요구 사항을 안정적이 고 재현 IG 유전자 시퀀스 분석 CLL, 지금 권장 테스트를 보장 하기 위하여 필요한 유럽 연구 이니셔티브의 광범위 한 경험에 그리기 치료 전에 모든 CLL 환자에 대 한 좀 더 구체적으로, 다양 한 분석 단계 clonotypic IG 유전자 재배열의 신분증과 뉴클레오티드 순서의 결정에서 IG 유전자 시퀀스 데이터의 정확한 임상 해석에 이르기까지 설명 합니다.

서론

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만성 림프모구 백혈병 (CLL), 서방 국가에서 성인 백혈병의 가장 일반적인 형태는 성숙한 종양 약 B 세포1의 클론 확장 특징 이다. 임상 관점에서 적극적인 질병 발생, 매우 일찍 진단 후, 치료를 필요로 하 고 자주 돌아가는 또는 치료에 내 화 되 고 몇몇 환자와 질병 과정은 매우 변수. 이것은 나태 한 질병으로 제시, 결코 치료를 필요로 하 고 건강 한 나이 일치 하는 개인2와 유사한 수명을 환자 (~ 30%)의 상당한 비율에 스 탁 대조에서. 이 임상이 성분 분자 이상은 CLL 환자는 궁극적으로 병 인3이 질병 진행을 드라이브에서 발견의 다양성에서 반영 된다.

그러나 정확한 CLL 진단을 일반적으로 간단 합니다,, 상기 임상이 CLL 환자의 효과적인 관리를 방해할 수 있습니다 수립과 전조 및 예측 마커에 지원할 수에 대 한 필요성을 밑줄 치료 의사 결정2. 다 수의 연구는 소설 임상 및 생물 학적 마커 제안된4되의 풍부에 culminating CLL의 prognostication를 수정 하려고 했습니다. Clonotypic 면역 글로불린 무거운 변수 (IGHV) 유전자의 mutational 상태가입니다 CLL에 가장 강력한 전조 마커 중 주로 인해 사실은 시간 이상과 질병 진행 되는 동안, (i) 그것은 안정적으로 유지 하 고 (ii) 독립적입니다. 임상 및 생물 학적 매개 변수5. 그 불구, 아주 몇 가지 경우 마커, IGHV mutational 상태를 포함 하 여 현재 적용 됩니다 임상 일과에서 진단의 때에.

1999 년, 2 독립적인 연구 없이 환자 또는 최소한의 신체적인 hypermutation (SHM) 부하 (unmutated CLL, U-CLL)를 보고 하는 때까지 다시 CLL 날짜에 IG 유전자 시퀀싱의 임상 유틸리티에 초기 보고서는 들고 환자 보다는 더 나쁜 예 후를 높은 SHM 부담 (돌연변이 CLL, M-CLL)6,7. 좀 더 구체적으로, U-CLL 그룹 이루어져 있었다 clonotypic IGHV 유전자 몇몇 또는 SHM 은닉 하는 경우 따라서 가까운 생식 IGHV 유전자 (≥ 98%), 높은 백분율 정체성 반면 M CLL의 경우 높은 mutational 부하 구성 (%id는 가장 가까운 생식 IGHV 유전자 < 98%). 이러한 초기 연구 이후 그것은 지속적으로 입증 되었습니다 U CLL의 경우 짧은 시간에 우선 치료 (TTFT) 및 전반적인 생존 (OS) M CLL에 비해 표시.

돌이켜보면, 이러한 정액 연구 강조는 B 세포 수용 체 (BcR) IG CLL pathobiology에 따라서 성패의 중추적인 역할 광범위 한 연구는, 차례 차례로,의 더 포괄적인 감사 CLL microenvironmental 상호 작용으로 이 질병8,9의 생물 학적이. 더 최근의 연구 개별 사례 하위 집합 공유 (외견상) 동일한 BcR IG 유전자 시퀀스 때문에 클러스터 수 있습니다 공개 CLL에 immunogenetic 분석의 중요성에 대 한 추가 지원을 제공, 현상이 나 BcR IG stereotypy10 ,11,,1213. 개념 같은 진부한 하위 집합 하버 비슷한 clinicobiological 속성을 명확 하 게 다른 CLL 환자 다른 IG 유전자 시퀀스; 하지만 동일한 SHM 범주 내에서 그들을 분리에 할당 된 그 환자 지원 증거를 축적 그것은 실제로 알려졌다 CLL 환자 BcR IG stereotypy 추가에 따라 분류 U CLL 또는 M CLL 그룹14,,1516, 으로 CLL 환자의 대량 분리를 통해 생생한 17 , 18 , 19 , 20.

임상의 관점에서 그것은 주목할 만한 SHM 상태 clonotypic IGHV 유전자의 chemoimmunotherapy에 대 한 특정 응답 연관 시킬 것. 특히, M-CLL 환자에서 fludarabine/cyclophosphamide/rituximab (FCR)의 조합으로 치료, TP53 유전자 결함, 부족 한 의학적으로 맞는 CLL 환자에 대 한 금 치료 더 이상 크게 진행 무료 전시 생존 (PFS)와 같은 치료21,,2223받은 U CLL 환자에 비해 운영 체제. 따라서, SHM 상태의 식별 중요 해지고 있다 특히 예측 마커 CLL 환자 즉, 의 치료 관리에 도움 보다는 질병 즉, 임상 과정 평가 전조 표식입니다. 사실, CLL에 대 한 국제 워크샵에서 NCI 후원 지침 서의 최신 업데이트에 따라 재배열된 IGHV 유전자의 SHM 상태 되어야 모든 CLL 경우 모두 일반적인 연습에 있는 치료 개시 이전에 결정 하 고 임상 실험24. 또한, 비 발한 치료 대리인, 승인 최근 시험에서 약물의 증가 때문 SHM 상태 서 분자의 재생할 수 있습니다 훨씬 더 큰 역할 근처 미래5CLL 환자의 치료 관리.

이 보고서는 IG 유전자 순서 분석, 적절 한 재료를 선택 하 고 시퀀싱 결과의 임상 해석와 culminating으로 시작의 모든 측면을 자세히 설명 합니다. 단계 심층 평가 임상 시험에서 정확한 환자 층 리를 보장 하기 위해 신뢰할 수 있는 결과의 생산에 대 한 진단 루틴에서 중요 하다. 프로토콜 IG 유전자 순서 분석, 그 결과 다른 실험실 사이 비교는 보장의 조화에 도움이 제공 됩니다.

프로토콜

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연구 프로토콜 산 라파엘 레 과학 연구소, 밀라노, 이탈리아의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 소재 선택

  1. 시작 물자의 선택
    참고: CLL의 대부분의 경우 종양 세포 수는 진단에 높은 (> 80-90%). 따라서, 셀 정렬 또는 농축 leukemic 세포의 일반적으로 필요 하지 않습니다.
    1. 말 초 혈액 (PB)를 사용 하 여, IG 유전자 순서 분석을 위해 선택의 가장 일반적인 재료 사이 10-20 mL 혈액 볼륨을 사용 합니다.
    2. 또는 낮은 CLL 세포 부담으로 경우, 셀 정렬 PB 샘플 또는 골 (BM) 또는 림프 노드 (LN) 같은 다른 조직에서 자료의 사용.
  2. 샘플링 시간
    1. 샘플링 시간은 중요 하지 않습니다 IG SHM 상태는 안정적인 초과; 즉, 피하 샘플링 특정 기간에서와 같은 직후 또는 치료 동안 CLL 세포의 낮은 수 분석을 복잡 하 게 하 고 신뢰할 수 없는 결과가 발생할 수 있습니다.
  3. 자료를 수집 및 저장
    참고: 수집 및 저장 시작 물자에 따라 다릅니다 강하게 소재 선택.
    1. PB 또는 BM 샘플에 대 한 PCR 증폭 과정;의 저해를 방지 하기 위해 EDTA 또는 CPT (시트르산-트리 스-pyridossalphosphate) 컬렉션 튜브 사용 또는 헤 파 린 튜브를 사용 하 여.
    2. LN 샘플에 대 한 컬렉션 옵션은 어느 셀 정지, 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직 드문 경우에에서, 또는 신선한 냉동된 조직 생 검.

2. 밀도 그라데이션 분리

참고: 경우 PB 또는 BM 가장 빈번한 시나리오 선택의 시작 물자 단 세포 격리 밀도 그라데이션 분리를 사용 하 여 것이 좋습니다.

  1. EDTA의 200 µ L 추가 (0.5 M EDTA / pH 8.0) 50 mL 살 균 컬렉션 튜브를. 20 mL의 PB와 RPMI의 15 mL를 추가 합니다. Pipetting으로 믹스 (2-3 시간 충분 하다).
  2. 새로운 50 mL 수집 튜브를 밀도 그라데이션 매체의 15 mL를 추가 합니다.
    참고: PB 볼륨 20 mL 미만의 경우, RPMI (이전 단계) 및 밀도 그라데이션 볼륨 해야 수정 따라.
  3. 그라디언트를 방해 하지 않습니다 있도록 천천히 단계 2.1에서에서 솔루션에 레이어. 원심 800 x g에 20 분 동안 원심 브레이크 해제.
  4. 단 셀 링 위 플라즈마/혈소판 레이어 및 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 밀도 그라데이션 중간 레이어 사이 형성 했다 수집 다음 살 균 15 mL 컬렉션 튜브를 전송.
  5. RPMI 12 mL의 최종 볼륨을 추가 하 고 섞으십시오. 8 분 동안 750 x g에서 원심. 폐기는 상쾌한.
  6. Resuspend RPMI의 10 mL를 사용 하 여 셀 펠 릿 고 2.5 단계를 반복 합니다.
  7. 1 mL의 PBS (DPBS, 아무 칼슘 아니 마그네슘)에 셀 펠 릿을 디졸브. 샘플의 20 µ L 1시 10분의 80 µ L를 혼합 하 여 Neubauer 플레이트를 사용 하 여 셀 수를 수행 터키어의 솔루션.
  8. 샘플의 다운스트림 처리 같은 날에 대 한 예약 되지 않은 경우 8 분 동안 750 x g에서 샘플을 원심. 삭제는 상쾌한 고-80o c.에 셀 펠 릿 저장

3. 핵 산 추출

  1. SHM 상태의 IG 유전자의 분석에 대 한 기판에 결정 합니다. 반전 녹음 방송 단계;에 대 한 필요가 없습니다으로 게놈 DNA (gDNA) 가장 인기 있는 선택은 또는, RNA/보완 DNA (cDNA) 사용 하면, 적어도 transcriptional 수준에서 생산, 기능성 clonotypic IG 재배치 "선호" 대상.
  2. CDNA의 합성 및 gDNA 또는 총 RNA 추출에 적합 한 수많은 상용 키트 중 하나를 사용 하 여 ( 재료의 표참조).
  3. DNA 또는 RNA를 사용 하 여 중요 한 핵 산의 정량화 시스템의 무결성을 평가 합니다. 예: retinoic 산 성 수용 체 알파 (RARa), 알려진된 하우스키핑 유전자의 PCR 증폭에 의해 추출 된 gDNA/cDNA의 양과 품질 평가 FFPE 자료 분석을 위해 사용 하는 경우 베타-걸, 등.

4. 증폭 및 IGHV-IGHD-IGHJ 유전자 재배열의 연속

  1. IGH PCR 뇌관 선택
    1. 가급적 이면, IGHV 하위 특정 5' 뇌관 및 IGHJ 유전자 특정 3' 뇌관25,에서26멀티플렉스 PCR을 수행 합니다. 결과 최적의 단일 IGHV 하위 특정 뇌관을 사용 하 여 별도 PCR 믹스를 준비.
    2. 5' 중 하나에 있는 지도자 지역 anneal 뇌관을 사용 하 여 즉시 업스트림 IG 재배치 또는 IGHV 유전자의 코딩 영역 (예: 프레임 워크 1, FR1) 내.
      1. 전체 뜯어 IGHV-IGHD-IGHJ 유전자 순서, 차례 차례로 SHM 레벨의 정확한 추정 하면의 확대를 위한 허용 지도자 뇌관을 사용 합니다. 따라서, IGHV 지도자 뇌관 에릭에 의해 IG 유전자 시퀀스 분석27에 대 한 그들의 업데이트 지침에 권장 됩니다.
      2. 지도자 뇌관 clonotypic IG 재배치를 증폭 하는 실패 하는 경우에 IGHV FR1 뇌관을 사용 합니다. 그러나, 프레임 워크 뇌관 전체 clonotypic IG 유전자 재배열, SHM의 레벨의 부정확 한 결정으로 이어질 수 있는 증폭 하지 않습니다. 이 시나리오, IGHV FR1 뇌관의 사용 수 있습니다 가까운 생식 유전자 진정한 % 정체성과 대 평가 하는 임상 보고서에 명확 하 게 상태에 대 한.
    3. 3' 끝, IGHJ 유전자, IGHJ 유전자 특정 뇌관 또는 기판에 따라 isotype-특정 뇌관의 다중 세트를 대상으로 하는 합의 뇌관을 사용 합니다. 그림 1 다양 한 뇌관 어 닐 링의 위치를 묘사 하는 반면 뇌관 순서 표 1에 제공 됩니다.
  2. IGHV-IGHD-IGHJ 유전자 재배열의 PCR 증폭
    1. 사용 하 여 각 하위 그룹 primer(s)의 아데닌 수량 편견된 확대 뇌관 믹스를 준비 합니다.
      1. 예를 들어 지도자 뇌관을 사용 하 여, 2 개의 다른 뇌관 IGHV1 하위 그룹에 속하는 재배열을 증폭에 사용 됩니다. 따라서, IGHV4L, IGHV4 하위 재배열에 대 한 유일한 뇌관은에 비해 절반이 2 뇌관 (IGHV1L 및 IGHV1bL)의 수량을 사용 합니다.
      2. IGHJ1-2와 IGHJ4-5 뇌관의 경우 반대 접근을 적용 합니다. 이 프라이 머 두 개의 서로 다른 IGHJ 유전자 하위를 대상으로 두 배 수량에 비해 IGHJ3와 IGHJ6 뇌관.
      3. 표 1 를 사용 하 여 관련 뇌관 믹스를 준비할 때 정확한 뇌관 수량을 결정 하.
    2. 표 2에 나열 된에 약을 믹스 PCR PCR 튜브에 모든 PCR 시 약 결합, 추가 Taq 중 합 효소의 0.5 µ L 100 gDNA 또는 cDNA의 2 µ L의 ng (cDNA은 RNA의 1 µ g으로 준비 되어야 한다).
      참고: 교정 활동와 Taq 효소 증폭 에러율 매우 낮은 이며 따라서 미치지 SHM의 수준으로 필수적입니다.
    3. 표 3에 대 한 자세한 열 PCR 프로토콜을 실행 합니다.
  3. Clonality 평가
    참고: 중요 한 다음 단계 PCR 제품의 clonality 패턴 평가 포함 한다. CLL 환자에서 clonality를 평가할 때 가장 일반적인 찾기는 단일, 단일 클로 널 피크/밴드 이다.
    1. Clonality 평가28,29에 대 한 높은 감도, 조각 또는 heteroduplex 분석 같은 방법을 사용 합니다.
    2. 파편 분석
      1. 멀티플렉스 PCRs 5' 표시 된 IGHV 지도자 또는 FR1 하위 특정 PCR 뇌관;를 사용 하 여 수행 이 모 세관 전기 이동 법으로 분리 될 수 있다 PCR 제품을 얻을 것입니다, 그리고 그로 인하여 허용 IGH PCR의 clonality 평가 제품 기반 지역 결정 그들의 IGHV complementarity 3 (CDR3) 길이.
      2. 사용 하 여 뇌관, 시 약 및 열 조건 동일 그 이전에 언급 한 (참조 표 1-3). 사용자 지정 5´-뇌관 표시 붙일 oligos 5' 끝에 염료의 선택으로 표시 됩니다. 기자 염료의 예로 6-식구 들, 16 진수, NED 또는 TET 있습니다. 따라서, 2 개의 반응 반응 당 3 다른 염료의 사용에 따라 필요한입니다.
    3. 1을 사용 하 여 (이 비율 귀착되는 최적의 해상도) 6% (6%) polyacrylamide 젤에 PCR 제품의 크기를 평가 실행 버퍼 x TBE. 80에서 실행 V 45 분.
      참고: PCR 제품 단일 클로 널 샘플 polyclonal 배경에서 분리 될 수 있다 DNA 크기 마커 적절 하 게 구분할 수 있도록 충분 한 시간 동안 젤에 마이그레이션할 수 있습니다 하는 것이 좋습니다. 크기와 젤의 두께 등의 요인에 영향을 마이그레이션 단일 설정 (전압 및 시간) 말했다, 그것은 너무 마이그레이션 샘플의 위험을 최소화 좋은 출발점은 45 분 동안 80 V 전압을 설정 하는 최적의 결과 보장 수 없습니다. 신속 하 고 '실행'에서 젤.
    4. IGHV 리더 뇌관을 사용 하는 경우 약 500 기본적인 쌍 및 350 기본 쌍의 PCR 제품을 위한 IGHV FR1 뇌관 믹스를 사용 하 여 확인 합니다.
      참고: 드문 경우에, CLL 경우 발견 되었습니다, 단일 클로 널 제품 하 고도 희귀 한 경우, 경우 oligoclonal 패턴을 전시 수 있습니다. Intercalating 에이전트 Ethidium 평범한 사람 (EtBr) 또는 위험 하 고 더 민감한 상용 DNA 얼룩 덜 UV 여기 또는 라이트 블루를 사용 하 여 아크릴 아 미드 젤에 DNA의 시각화에 대 한 사용할 수 있습니다.
  4. PCR 제품 정화
    참고: PCR 제품 뇌관 뿐만 아니라 CLL 샘플 내의 정상 B 세포에서 발생 하는 이합체 차선 시퀀싱을 이어질 수 있습니다 어떤 polyclonal 배경을 제거 하 정화 됩니다. 비법 인된 dNTPs와 뇌관 PCR 청소 업, 효소 치료를, 예를 들어, Sap (새우 알칼리 성 인산 가수분해 효소) 등을 제거 하는 메서드를 사용 하 여 / 엑 소 (Exonuclease 나), 또는 열 기반 정화.
    1. 3% 낮은 녹는 agarose 젤에 PCR 제품의 전체 볼륨을 로드 합니다.
    2. PCR 제품 젤에 그들은 배경에서 분리 될 때까지 실행을 허용 합니다.
    3. 날카로운, 저명한 PCR 밴드를 소비 세, 정화 하 고 elute. 두 재배열 검색 되 면 두 밴드 excised 해야 하 고 별도로 시퀀스.
    4. Sap/엑 소 정리를 수행 하려면 사용할; 특정 볼륨에 대 한 제조업체의 지침에 따라 그러나 전형적인 반응 1 µ L를 포함할 수 있습니다 Sap, 0. 5 µ L 엑 소 및 2 µ L 5 배 부 화 당 5-10 µ L PCR 반응 버퍼. 부드럽게 vortexing에 의해 각 샘플을 혼합 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 PCR 블록에 품 어. 15 분 동안 85 ° C에가 열 하 여 효소 비활성화.
    5. 제품의 순도 평가 하기 위해 3 %agarose 젤에 PCR 제품의 소량을 로드 합니다.

5. 생어 시퀀싱

그러나 참고: 여러 시퀀싱 전략 존재,, 정확한 접근, 직접 두 가닥의 시퀀싱에 신뢰할 수 있는 결과 보장 하기 위해 필수입니다.

  1. 일반 시퀀싱 프로토콜
    1. 증폭 수행 단일 뇌관을 사용 하 여, 있는 적절 한 IGHV-IGHJ-또는 일정 지역 특정 뇌관을 사용 하 여 연속 진행. 이 이렇게 놓여있는지 다중화 레이블이 뇌관 사용 되 고 PCR 제품 조각 분석 (시퀀싱 뇌관 없습니다 표시 되어야 합니다)를 사용 하 여 평가 했다 경우에 또한 채택 수 있습니다.
    2. 멀티플렉스 뇌관 사용 되 고 clonality 젤에 평가 했다, 사용 다운스트림 뇌관 시퀀싱 예 IGHJ 뇌관 합의의 첫 번째 단계에서 순서 5'-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3 되와 함께 '. 또는, 채널 뇌관 cDNA 기판으로 사용 하는 경우 사용할 수 있습니다. 다음, 두 번째 연속 단계에 대 한 하위 그룹 전용 IGHV 지도자 또는 FR1 뇌관을 사용 합니다.
  2. 예를 들어 연속 프로토콜
    참고: 여러 시퀀싱 프로토콜 존재와 예제 프로토콜 아래 상세한.
    1. 33 희석 사용 하 여, 예를 들어, 메 마른 물 11.5 µ L의 전체 볼륨에 PCR 제품의 ng. PCR 제품을 5 분 동안 95 ° C에가 열에 의해 변성. 즉시 보조 구조의 형성을 방지 하기 위해 10 분 동안 얼음에 놓습니다.
    2. (해당 5 pmol 하) 하는 0.5 µ L 뇌관의 함께 각 튜브를 마스터 믹스의 8 µ L를 추가 합니다.
    3. 컨트롤, 마스터 믹스의 8 µ L, 0.5 µ L pUC18 컨트롤 템플릿, 2 µ L (-) 47 시퀀싱 뇌관 및 9.5 µ L 살 균 물 튜브 준비. 각 관에서 마지막 총 볼륨 20 µ L 이어야 한다.
    4. 연속 반응에 대 한 열 순환 조건을 사용 하 여 표 4에 설명으로.
    5. 나트륨 아세테이트 3 M (pH 5.2), 2 µ L의 2 µ L를 혼합 하 여 중지 솔루션 준비 EDTA 100 m m (pH 8.0) 및 글 리 코겐의 1 µ L (농도 20 mg/mL), 5 µ L 각 샘플에 추가. 새로운 microcentrifuge 튜브에 제품을 전송.
    6. 100% 에탄올 (-20 ° C)의 60 µ L을 추가 하 고 부드럽게 혼합. 15 분 (4 ° C)에 대 한 14000 rpm에서 원심. 폐기는 상쾌한.
    7. 70% 에탄올 (-20 ° C)의 100 µ L을 추가 하 고 부드럽게 혼합. 원심 14000 rpm에서 10 분 (4 ° C). 폐기는 상쾌한. 한 번 반복 합니다.
    8. 실 온에서 90 분 동안 펠 릿을 건조. 40 µ L의 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 솔루션 각 샘플을 추가 합니다.
    9. 시퀀싱 접시에 샘플을 전송, 스트립 모자 또는 테이프 물개 커버 고 컴퓨터에 로드 하 고, 수행 생어 시퀀싱. 시퀀싱 플레이트는 일반적으로 96-글쎄, v-하단, 풀 치마 PCR 판 시퀀서와 호환입니다. 플레이트 바코드 자체 수행 되어야 하는 시퀀싱 인지에 따라, 상업 회사에 또는 학술 시퀀싱 센터/플랫폼에 있을 수 있습니다.
  3. 시퀀싱, 후 ' 바느질 함께 '는 완전 한 IGHV 유전자 재배열 즉, 합의 시퀀스를 개별 시퀀싱 단계에서 생성 된 2 읽습니다.

6. 시퀀스 분석

참고: 다음 섹션 집중 분석할 때 IMGT/V-퀘스트 도구30 에서 얻은 출력 재배열 IG 시퀀스 및 IMGT/JunctionAnalysis31, 둘 다는 특히 임상 보고 및 연구 관련 연구입니다. IMGT/V-퀘스트는 사용자를 비교 하는 맞춤 도구 제출 IMGT 참조 디렉터리와 IG 시퀀스 설정30. 도구 출력 되는 사용자 특정 매개 변수를 정의할 수 있습니다 여러 섹션을 포함 합니다.

  1. 종, 예를 들어, 호모 사피엔스 (인간), 그리고 수용 체 유형 또는 로커 스 (예: 고등학교, IGK 또는 IGL)를 지정 합니다.
  2. 시퀀스를 분석, FASTA 형식에서 및 헤더를 포함 하 여 (실행 당 최대 50 시퀀스의 배치)에서 텍스트 영역으로 붙여넣습니다. 또는, FASTA 시퀀스를 포함 하는 로컬 파일 경로 입력 하는 옵션이 제공 됩니다.
  3. 결과 대 한 다음 3 디스플레이 옵션 중 하나를 선택 합니다.
    1. 상세 보기: 개별적으로 각 시퀀스에 대 한 결과 얻기 위해이 옵션을 선택 하십시오.
    2. 보기 종합: IGHV 유전자와 대립 유전자 이름이 나 시퀀스 입력된 순서는 요약 테이블을 편집 하려면이 옵션을 선택 하십시오. 이 옵션은 또한, 어떤 전송된 일괄 처리에 할당 된 동일한 IGHV 유전자와 대립 유전자 시퀀스의 맞춤을 제공 합니다.
    3. Excel 파일: 모든 단일 파일에 통합 하는 스프레드시트 파일 출력 제공 하려면이 옵션을 선택 하십시오. 그러나 모든 보기 옵션 기본 및 고급 매개 변수에서 선택의 큰 선택이 있다 CLL IG 시퀀스 분석에 가장 관련 요인 ' 대표 결과 ' 섹션에서 아래에서 토론 된다.

7. 체포/AssignSubsets 도구

  1. BcR IG stereotypy CLL (자세한 내용은 아래 '대표 결과' 섹션에서 제공)에서 조사, 체포/AssignSubsets 도구32IGHV-IGHD-IGHJ FASTA 시퀀스를 제출. 도구 주요 CLL에 대 한 할당 진부 하위 집합을 보고 합니다. 자세한 내용은 하위 할당 도구는 체포/AssignSubset 웹사이트32 및 서비스 탭 아래 에릭 웹사이트에 사용할 수 있습니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

아래에 제공 된 예제는 IG 유전자 시퀀싱 분석 다음 단계는 위에서 자세히 설명에서 얻은 결과를 보여 줍니다. DNA / RNA 추출 대부분 임상/연구 실험실에 대 한 일상적인 절차는, 비록 중요 한 첫걸음 gDNA를 분 광 광도 계 또는 다른 적합 한 기술을 사용 하 여 높은 감도 가진 RNA의 품질/수량 체크를 포함 한다. 다음 중요 한 단계는 clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ 유전자 재배열의 PCR 증폭을 포함 한다. 위에서 설명 했 듯이, IGHV 지도자 뇌관의 사용만 가능 뜯어 IGHV 유전자 시퀀스, 따라서 허용 결정; 진정한 SHM 부하의 전체 길이의 증폭 따라서, IGHV 지도자 뇌관 뇌관 권장된 선택 (그림 2)입니다. 드문 경우에 IGHV 지도자 뇌관 clonotypic IG 재배열을 증폭 수 없습니다, IGHV FR1 뇌관을 사용할 수 있습니다. 그림 3에서 입증, 여러 PCR 제품/밴드 관찰 수 있습니다, 특히 때 gDNA 시작 물자; 이러한 밴드 excised 해야 하 고 별도로 시퀀스. IGHV 리더와 IGHV FR1 뇌관 결과 얻을 수 실패 분석 (가능 하면) 새로운 환자 샘플을 사용 하 여 반복 한다. 시퀀싱 하기 전에 마지막 검사점은 조각 분석 (그림 4)를 사용 하 여 샘플의 clonality를 결정 하 고 있다.

얻은 시퀀스 IMGT/V-퀘스트 도구30을 사용 하 여 분석 합니다. 사용자가 선택한 매개 변수 종, 수용 체 유형 또는 로커 스, 검색, 삽입 및 삭제 옵션, 등등 을 위한를 포함 하 고 분석 하는 시퀀스 번호와 함께 나열 됩니다. 각 FASTA 시퀀스 표시 되 고 V-도메인 IMGT/V-퀘스트 분석 녹색으로 강조 표시 됩니다. 또한, 입력된 시퀀스 반대 방향 (antisense)에 있었다면, 프로그램 자동으로 무료 역방향 시퀀스 하며 FASTA 시퀀스 위에이 상태.

요약 테이블 바로 FASTA 시퀀스 ' 상세 보기 '의 상단에서 아래 제공 됩니다 결과 결과 페이지, 그리고 CLL에 IG 유전자 순서 분석의 임상 보고에 대 한 중요 한 정보가 포함 되어 있습니다. 이 테이블의 각 행은 아래 설명.

결과 요약. 결과 테이블에 첫 번째 행 상태 입력된 시퀀스의 기능: 생산 또는 비생산적인 IG 재배열 시퀀스 수 있습니다 (그림 5A 및 5B). IG 유전자 재배열 codons는 지역 내에서 V-D-J-(VH)에 대 한 또는 V-J-(VL)에 대 한 지역 내에서 또는 경우는 재배치는 중지 하는 경우 비생산적인 아웃 프레임의 삽입/삭제 때문입니다. 세 번째 출력 기능을 확인할 수 없을 때 제공 됩니다 즉, IGHV-IGHD-IGHJ 접합부를 식별할 수 없습니다; 이 경우 결과 요약 '발견 다시 정리' 또는 '발견 정크 션'으로 읽을 것 이다. 생산성만 주의 하는 것이 중요 하다 고, 따라서, 기능적인 재배열 더 분석 되어야 합니다. 단독 증폭 서 재배치 하는 경우 작동 하지 않습니다 (비생산적인 또는 '발견 다시 정리'), PCR 증폭 과정을 반복 해야 합니다. 결과가 부정적인 경우 새로운 환자 샘플을 얻을 수 합니다.

V 유전자와 대립 유전자. 'V-유전자와 대립 유전자' 행 가까운 생식 IGHV 유전자와 대립 유전자의 맞춤 점수와 백분율 id를 나타냅니다. 여러 gene(s)와 대립 유전자 동일한 높은 점수를 주고, 모두 나열 됩니다. SHM 상태 결정 이후 제출된 순서 및 가까운 IGHV 유전자 및 대립 유전자 사이 백분율 id 특정 중요성 이다. 이 값은 CDR3 제외 V 영역 3' 끝 V 영역의 첫 번째 뉴클레오티드에서 계산 됩니다. IGHV FR1 뇌관을 사용 하는 경우 뇌관의에 해당 하는 시퀀스는 항상 정확한 가능한 결과 보장 하기 위해 제거 한다. 주목 해야 한다 그 낮은 정체성 비율 (< 85%)는 삽입 또는 삭제 될 수 있습니다 (논의 더 아래)와,이 경우 있어야 '경고'의 노트 사용자 '결과 요약' 행에 표시 됩니다.

J 유전자와 대립 유전자. V 유전자와 위의 대립 유전자에 대 한 설명, 'J-유전자와 대립 유전자' 행 가까운 생식 IGHJ 유전자와 대립 유전자의 맞춤 점수와 백분율 id를 나타냅니다. 그러나,와 IGHJ 유전자는 오히려 짧은 exonuclease 활동으로 인해 그의 5' 끝 손질, 대안 선택은 또한 연속 동일한 뉴클레오티드의 최고 수에 따라 도구에 의해 검색 됩니다.

D 유전자와 대립 유전자 IMGT/JunctionAnalysis 여. 했다 유전자와 대립 유전자 IMGT/JunctionAnalysis '으로 사용자 시퀀스에 도구에 의해 식별 된 D-지역 독서 프레임 가까운 생식 IGHD 유전자와 대립 유전자를 나타냅니다. IMGT/JunctionAnalysis31 교차점의 상세 하 고 정확한 분석을 제공 하 고 IMGT/V-퀘스트 도구 인터페이스에 통합 되었습니다. 이 도구는 IGHD 유전자와 대립 유전자 식별 즉, (i) D-지역;의 짧은 길이에 연결 된 어려움의 모든 측면을 관리 하 (ii) 2 또는 심지어 3 프레임; 독서의 사용 (iii) exonuclease 트리밍 유전자;의 양쪽 끝에 그리고, (iv) 변이의 존재.

FR IMGT 길이, CDR IMGT 길이 AA 접합. 이 행 IGHV FRs 및 Cdr 대괄호로 표시 하 고 구분 점 들과 아미노산 (AA) 접합의 길이 제공 합니다. 교차점의 AA 시퀀스 설명 (i) 또는 아웃-의-프레임 재배치 (아웃-의-프레임 위치 '#' 기호로 표시 됩니다), (ii) 유무 정지 codons의 (정지 codon를 별표로 표시 됩니다 ' *'), 그리고 (iii)의 유무는 앵커 VH CDR3-IMGT의: C (2-CYS 104) 및 W (J TRP 118).

그러나 단일 뉴클레오티드 변화 체세포 hypermutations에 의하여 주로 이루어져,, 작은 삽입 및 삭제 V-지역 내에서 관찰 될 수 있다, 이기는 하지만는 훨씬 더 낮은 주파수33. 때 기본 IMGT/V-퀘스트 매개 변수, 삽입 및 삭제를 사용 하 여 자동으로 검색 되지; 그러나, 강한 표시 시퀀스 같은 변경, 즉, 낮은 백분율 신원 및 제출된 사용자 시퀀스와 가장 가까운 생식 유전자 및 대립 유전자, 사이 다른 IGHV CDR1 IMGT 및 CDR2 IMGT 길이가지고 있습니다에 의해 감지 되는 도구 및 경고 알림 결과 요약 테이블 (그림 5C) 아래에 나타납니다.

IMGT '디스플레이 결과' 섹션 아래에 있는 '고급 매개 변수' 섹션에서 '삽입 및 삭제에 대 한 검색' 이라는 옵션을 제공 합니다. 관련 경고 표시의 경우, 그것은이 기능을 사용 하는 것이 좋습니다. 삽입 및 삭제 감지 될 때 포괄적인 발견의 자세한 사항은 제공 어디 (i)을 포함 하 여 '결과 요약' 섹션에서 삽입 또는 삭제 위치 즉, VH FR-IMGT 또는 CDR-IMGT; (ii) 삽입/삭제 뉴클레오티드; 수 (iii) 시퀀스 (만 삽입); (iv)는 frameshift 발생 했습니다; (v) V 지역 codon는 삽입 또는 삭제 시작; 그리고 (vi)는 제출에서 영향을 받는 뉴클레오티드 위치 순서 (그림 5D). 삽입에 대 한 도구는 insertion(s) 제출된 사용자 시퀀스에서 제거 되 고 다시 표준 IMGT/V-퀘스트 매개 변수를 사용 하 여 시퀀스 분석. 삭제 검색 되 면 도구 점, 분석을 반복 하기 전에 삭제 된 뉴클레오티드를 대체 하기 위하여 나타내는 간격을 추가 합니다.

모든 진단 또는 전조 테스트 임상 실험실에서 수행에 관해서는 엄격한 표준 및 재현성의 높은 수준의 매우 중요 있습니다. IMGT/V-퀘스트 출력 CLL, 즉, (i)는 IGHV, IGHD 및 IGHJ 유전자와 대립 유전자 활용;에 IG 유전자 순서 분석의 결과 보고에 필요한 정보 제공 (ii) IGHV-IGHD-IGHJ 유전자 재배열 , 즉 clonotypic의 기능 인지 다시 정리 생산성 또는 비생산적인; (iii)는 재배열의 백분율 id IGHV 유전자 그리고 그것의 가장 가까운 생식 IGHV 유전자와 대립 유전자에 비해 대립 유전자. CLL, 해석의 문제 또는 기술적으로 도전적인 케이스 및 IGHV 유전자 SHM 상태의 CLL에 정확 하 고 강력한 결정에 대 한 권장 사항에 IG 유전자의 임상 보고에 관한 포괄적인 정보에 대 한 독자 감독 최근 업데이트 에릭 지침과 보고서27,34.

마지막으로, BcR IG stereotypy CLL에 관한 우리의 성장 지식 때문 CLL에 IG 유전자 재배열의 임상 보고에 대 한 추가 권장된 요구의 경우 진부 주요 하위 할당에 관한. 분석 된 생산적인 IGHV 유전자 재배열 진부한 주요 하위 집합, 즉 하위 집합 #1, #2, #4 또는 #812,27중 하나에 할당 될 수 있는지 여부 그것은 지금 상태로 임상 보고서에 권장. 주요 CLL 진부 하위 할당 체포/AssignSubsets 도구 (그림 6)32사용 하 여 수행 되어야 합니다.

5 ' IGHV FR1 뇌관뇌관 순서뇌관 믹스의 60 μ에 대 한 수량
IGHV1CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG10
IGHV2CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG10
IGHV3GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG10
IGHV4CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG10
IGHV5GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC10
IGHV6CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG10
5' IGHV 지도자 뇌관
IGHV1LAAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGG5
IGHV1bLAAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAG(C/A)5
IGHV2aLAAATCGATACCACCATGGACACACTTTGCT (에어콘) AC5
IGHV2bLAAATCGATACCACCATGGACATACTTTGTTCCAC5
IGHV3aLAAATCGATACCACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC5
IGHV3bLAAATCGATACCACCACCATGGA(A/G)(C/T)T(G/T)(G/T)G(G/A)CT(G/C/T) (A/C/T) GC5
IGHV4LAAATCGATACCACCATGAAACACCTGTGGTTCTT10
IGHV5LAAATCGATACCACCATGGGGTCAACCGCCATC10
IGHV6LAAATCGATACCACCATGTCTGTCTCCTTCCTC10
3' IGHJ 뇌관
IGHJ1-2TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC20
IGHJ3TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC10
IGHJ4-5TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC20
IGHJ6TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC10

표 1입니다. 뇌관 순서 고 clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ 유전자 재배열의 PCR 증폭에 대 한 수량.

시 약볼륨 (μ)
RB 10 버퍼 x5
MgCl2 (50mm)3
dNTPs (10 mΜ)2
뇌관 IGHV 지도자/FR1 믹스 (10 μ M)3
뇌관 IGHJ 혼합 (10 μ M)3
H2O31.5
총 볼륨47.5

표 2입니다. Clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ 유전자 재배열의 PCR 증폭에 대 한 시 약.

온도기간주기 수설명
94 ° C5 분1중 합 효소 활성화
94 ° C1 분39변성
59 ° C1 분어 닐 링
72 ° C1.5 분확장
72 ° C10 분1마지막 확장
18 ° C∞1보존

표 3입니다. Clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ 유전자 재배열의 PCR 증폭에 대 한 열 순환 조건.

온도기간주기 수설명
94 ° C5 분1중 합 효소 활성화
96 ° C20 초30변성
50 ° C20 초어 닐 링
60 ° C4 분확장
4 ° C∞1보존

표 4입니다. IG 유전자 시퀀싱 반응에 대 한 열 순환 조건.

figure-results-1
그림 1입니다. 다양 한 뇌관 어 닐 링 위치 표시는 IGHV-IGHD-IGHJ 유전자 재배열의 도식 대표. 5' IGHV 뇌관 anneal IGHV 코딩 순서의 상류 있는 지도자 시퀀스. 5' IGHV 프레임 워크 (FR) 뇌관 anneal은 뜯어 IGHV 유전자 재배열된 IGHJ 유전자의 끝에 3' IGHJ 뇌관 anneal 반면 FR1 영역의 시작 부분에. UTR: 번역 되지 않은 영역입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-2
그림 2입니다. 5' IGHV 지도자 뇌관을 사용 하 여 7 환자 샘플에서 IGHV-IGHD-IGHJ 유전자 재배열의 PCR 증폭. 8 레인 9 차선으로 PCR에 대 한 부정적인 컨트롤 로드 된 반면 긍정적인 컨트롤을 나타냅니다. IGHV 리더 뇌관을 사용 하 여 때 예상된 PCR 제품 약 500 기본적인 쌍 크기에서입니다. 젤의 마지막 열에 별표 100 bp DNA 사다리를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-3
그림 3입니다. IGHV FR1 뇌관을 사용 하 여 13 환자 샘플에서 IGHV-IGHD-IGHJ 유전자 재배열의 PCR 증폭. 14 레인 부정적인 제어 15 레인에 로드 하는 동안 긍정적인 컨트롤을 포함 합니다. 레인 2, 어떤 DNA가 시작 물자에 입증 여러 PCR 악대는 관찰, excised 해야 하 고 별도로 시퀀스. 샘플 레인 5, 7, 및 13에 굴복 polyclonal 결과 (젤에 얼룩에 의해 입증 되는) 그리고, 따라서, PCR 단계를 반복 해야 합니다. 두 번째 PCR 증폭 뜯어 서 실패 하는 경우 gene(s) 분석 새로운 샘플에 수행 합니다 (가능한 경우) 또는 다른 뇌관을 사용 하 여 설정. IGHV FR1 뇌관 믹스를 사용 하 여 때 예상된 PCR 제품 크기에 약 350 기본 쌍입니다. 젤의 마지막 열에 별표 100 bp DNA 사다리를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-4
그림 4입니다. Genescan 분석을 사용 하 여 clonality의 평가. Genescan 분석에서 단일 클로 널 PCR 제품을 야기할 동일한 크기 (위 패널)의 형광 제품의 지배적인 피크 polyclonal PCR 제품 제품 크기 (하단 패널)의 더 많은 정규 분포에서 발생 하는 반면. 붉은 흔적은 분석 되 고 샘플으로 같은 모 세관 주입 로드 붙일 표시 된 DNA 사다리에서 봉우리. 크기 표준 조각 샘플으로 동일한 전기 이동 힘을 복종 되 고 따라서 동일한 주입 조건에 노출 되는. 균일 한 간격 크기 표준 조각의 정확한 크기 전화를 확인합니다. 단일 클로 널 (맨 위 패널)를 대표 하는 블루 트레이스 또는 polyclonal 샘플 (하단 패널) 자연. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-5
그림 5입니다. 제공한 IMGT/V-탐구 결과 요약 테이블의 예. (A) 생산 IGHV-IGHD-IGHJ 유전자 재배열 (아니 중지 codon(s) 및 프레임에 시퀀스 접합) 결과 요약 테이블. V-유전자 및 대립 유전자 J 유전자 및 대립 유전자 IMGT/V-퀘스트 사용자 순서로 구분이 경우에 IGHV4-34 * 01과 IGHJ6 * 02 (높은 맞춤 점수 평가)에 근거 하 여. 백분율 정체성은 99.65% 단일 체세포 돌연변이 때문입니다. D 유전자와 대립 유전자 IMGT/JunctionAnalysis로 식별 되는 독서 프레임 1에 IGHD3-3 * 01입니다. 4 프레임 워크 영역 (FRs) 3 complementarity 결정 영역 (Cdr)의 길이 괄호 안에 표시 됩니다. IGHV-D-J 접합의 아미노산 (AA) 시퀀스 제공 됩니다. 이 예제는 접합 구성 22 AAs. (B) 결과 요약 테이블 IGHV-IGHD-IGHJ 유전자 재배열 시퀀스를 프레임의 밖으로 교차점 때문에 비 생산적 이다. CDR3 IMGT 길이 대 한 X 나타냅니다는이 순서에 대 한 길이 확인할 수 없습니다. AA 접합 시퀀스에서 '#' 표시는 frameshift을 나타냅니다. (C) 결과 요약 테이블 낮은 V 지역 정체성 (60.94%)의 경고와 '고급 매개 변수' 섹션에서 '삽입 및 삭제' 옵션을 사용 해야 함을 나타내는. (D) 결과 생식 낮은 백분율 정체성 '삽입 및 삭제에 대 한 검색' 옵션을 사용 하 여 시퀀스 분석을 반복 후 (C)에 나와 있는 경우에 대 한 요약 테이블. 올바른 id %는 괄호 안에 표시 되 고 단일 mutational 이벤트로 삽입을 고려 하는 것을 계산 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-6
그림 6입니다. 체포/AssignSubsets 도구에서 생성 하는 하위 집합 할당 보고서 테이블. FASTA IG 시퀀스 10 CLL 환자 (A1-A10)에서 체포/AssignSubsets 도구에 제출 했다. 케이스 A4 높은 자신감과 CLL 진부 하위 집합 #2 (이 그룹 내에서 환자 SHM 부하에 관계 없이 빈약한 예 지를가지고 알려져 있다)에 할당 했다. 7 다른 경우/시퀀스의 주요 진부한 하위 집합에 할당 하지 되었고 따라서 할당으로 분류. (A 7과 A8) 제출된 시퀀스의 두 하위 할당에 사용 될 수 고 대신 시퀀스, 즉, 프레임의 밖으로 접합 또는 정지 codons의 존재와 생략/건강에 해로운 문제 때문으로 분류 했다. 표 머리글에 대 한 포괄적인 설명을 도구는 체포/AssignSubsets 웹사이트32에 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CLL에 IG 유전자의 연구는 질병 pathobiology로 더 나은 이해를 제공 뿐만 아니라 환자 위험 계층을 개선 하기 위한 중요 한 되었습니다. 그것은 그러므로 파라마운트 IG 유전자 순서 분석의 다단계 절차 및 후속 해석 순서 데이터의 표준화 된 방식으로 수행 됩니다. 적합 하 고 충분 한 환자 자료의 가용성 및 샘플링의 타이밍 하지 PB와 높은 CLL 종양 세포 수와 어떤 샘플 테스트를 수행할 수 있습니다 이후 IG 유전자 mutational 분석을 수행 하는 기능에 영향을 한다. 그라데이션 분리 방법을 사용 하 여 단 혈의 분리는 정기적으로 진단 실험실에서 수행 하 고 항상 주의 해야 그라데이션; 포함 된 튜브에 혈액/RPMI 솔루션을 추가할 때 이 작업에서 그라디언트를 방해 하지 않도록 하 고 세포의 손실을 방지 하는 느린, 부드러운 방식으로 수행 되어야 한다.

다음 셀 분리, 핵 산 추출 됩니다. 그러나 모두 cDNA 및 gDNA SHM clonotypic 고등학교 재배치의 분석을 위해 적당 하다,, 어느 자료의 사용에 대 한 장단점이 있다. 실험실 워크플로 진행 빨리 때 gDNA를 사용 하 여 이후 아무 반전 녹음 방송 PCR 확대 이전에 수행할 수 있다. 즉, 차례로, 추가 실습 실험실 작업, 즉, 정화 또는 다중 PCR 제품의 젤 절단으로 이어질 수 있는 생산적이 고 비생산적인 재배열의 증폭 PCR 위한 기판 발생할 수 있으므로 gDNA를 사용 하 여 그리고 모든 재배열의 개별 연속입니다. 비교할 때 gDNA cDNA 접근, 후자에 대 한 반전 녹음 방송 단계 수행 되어야 합니다 PCR 확대와 함께 진행 하기 전에. 그러나, 대부분의 경우,이 경우에서 생산성 IG 재배열 될 증폭 되며 이후 시퀀스. 따라서만 단일 PCR 제품 정화 됩니다 고 시퀀싱, 해석 결과 더 간단 하지만.

증폭의 효율은 크게 gDNA/cDNA, 민감한 정량화 방법 및 활용 하는 뇌관을 사용 하 여 평가 한다의 품질에 따라 달라 집니다. 사용 하는 뇌관은 SHM 수준의 정확한 결정만 뜯어 IGHV 유전자의 전체 순서를 증폭 하 여 달성 될 수 있다 때문에 전체 분석 절차에 중요 한. 전체 길이 재배치 지도자 뇌관27의 사용에 대 한 에릭에 의해 최근 권고를 정당화 하는 그로 인하여 5' IGHV 지도자 프라이 머 사용 하는 경우에 평가 수 있습니다. 불완전 한 IGHV-IGHD-IGHJ 유전자 재배열의 확대로 이어지는 다른 프라이 머를 사용 하 여 IGHV 유전자 mutational 분석에 적합 하지 않습니다 그리고 그러므로 대하여 강하게 조언. 유일한 예외는 IGHV 지도자 뇌관을 사용 하는 경우 반복적으로 부정적인 결과 생산 하는 경우에 관련 된 및 새로운 환자 자료의 분석은 하지 가능한 또는 또한 않는 결과 생성 하지. 다른 환자 샘플 및 자료 (gDNA/cDNA) 및 다양 한 프라이 머의 사용 설정 PCR 제품을 생산 하기 위해 여전히 실패, 때문일 수 종양 세포 부담 너무 낮게 또는 그 lymphocytosis CLL 클론 때문만 아니다 (어떤 경우에 immunophenotype 이어야 한다 다시 평가)입니다. 분석에 사용 되는 뇌관 항상 임상 보고서에 언급 해야 합니다.

CLL 같은 IGHV-IGHD-IGHJ 유전자 재배열을 베어링 단일 클론 B 세포의 축적에서 결과로 경우 clonality의 대부분에 대 한 평가 공개 한다 독특한 단일 클로 널 피크, 즉, 단일 클론. 드문 경우에, 이중 재배열 또는 심지어 oligoclonal 패턴 수 있습니다 관찰35. 이러한 경우에 젤 전기 이동 법 clonality 평가 위한 기본 기법 이며 조각 분석 같은 더 민감한 방법을 적용 한다. Clonality 확인 되었습니다 시퀀싱 전에 마지막 단계는 시퀀스의 높은 품질을 얻을 수 있습니다 있도록 PCR 제품의 정화에 관한. 마지막으로, IMGT/V-퀘스트 도구 에릭에 의해 IG 시퀀스 분석에 대 한 권장 리소스입니다. IMGT 데이터베이스는 지속적으로 업데이 트 하 고 일관성 및 잘 주석된 방식으로 결과 보고,이 도구는 표준화 된 분석을 보장 하 고 다른 임상 이나 교육 시설 사이 비교 분석을 용이 하 게.

CLL에 immunogenetic 분석은 예견 하 고, 특히, 예측 의미, 주요 CLL에 대 한 할당을 포함 하 여 IGHV-IGHD-IGHJ 유전자 재배열의 강력한 분석 하위 집합 진부, 이상입니다만 바람직한 하지만 주요 중요성의. 이것은 새로운 치료제와 IG 유전자 분석 치료 결정5,,2122,23,36,37 안내 하는 잠재력의이 시대에 특히 분명 하다 ,38로 공식적으로 CLL24국제 워크숍에서 NCI 후원 지침의 최근 업데이트로 표시. SHM 상태는 clonotypic의의 결정 CLL 환자에서 IGHV 유전자 재배열로 특히, 엄격한 표준 보증은 사소한 문제 이며 여러 단계 프로세스를 포함 한다. 중요 한 것은, 특정 실험 단계 뇌관, 수확량 뛰어난 결과 특정 옵션 및 접근의 가장 주목할 만한 선택 준수 하, 다른 기술적인 측면은 어느 정도 유연성, 소재 선택 등의 의무가 또는 사실은 그들은 미묘한 차이가 있으면, 최종 결과 관해서는 이어질 clonality, 평가 하기 위한 방법입니다.

지난 10 년간, 에릭 CLL 진단 및 prognostication에 관련 된 다양 한 방법의 통일 및 표준화 노력 했다. 이것은 게시 된 권장 사항 및 immunogenetic 분석27,34, 수많은 조직된 교육 워크샵 및 이벤트, IG 네트워크에 전문적인 온라인 포럼의 설립에 대 한 지침에 반영 토론 하 고 CLL에 IG 유전자 시퀀스 해석에 지침을 제공 합니다. 이러한 작업을 통해 에릭의 전반적인 목표는 최적의 임상 관리 및 환자 치료입니다. 강렬한 노력에도 불구 하 고이 작업까지 완료, 그리고 실제로 면역 프로 파일링 겨냥 소설 높은 처리량 시퀀싱의 발전 때문에 더 복잡 한 되고있다. 그럼에도 불구 하 고, 과제 지속, 비록 CLL에 IG 유전자 분석의 강력한 표준화에 대 한 집중적인 노력 계속 되며 현재 에릭 내에서 지속적인 활동의 초점.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 관련 충돌의 관심 있다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 그들의 헌신과 열정 CLL에 immunogenetics 공부에 대 한 우리의 연구 그룹, IgCLL 그룹, 에릭의 현재와 과거 회원을 감사 합니다. 우리 또한 모든 멤버 IMGT/CLL-DB 이니셔티브의 및, 특히, 마리-Paule Lefranc 교수와 박사 베로 Giudicelli, 응용 d'Immunogenetique Moleculaire, LIGM, 대학의 믿을 협업을 인정 하 고 싶습니다. 몽펠리에 II, 몽펠리에, 프랑스, 및 IMGT, 국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템, 그들의 거 대 한에 대 한 지원과 도움이 IG 유전자 순서 분석. 이 작품은 TRANSCAN-179 소설 JTC 2016;에서 교부 금에 의해 부분적으로 지원 라 검색 술 Cancro AIRC (탐정 부여 #20246 및 특별 한 프로그램 분자 임상 종양학-5 밀레 #9965 당) 당 예술 슈퍼컵, 밀라노, 이탈리아; Progetti 디 Rilevante 가끔 나 (인화) # 2015ZMRFEA, MIUR, 로마, 이탈리아; 스웨덴 암 협회, 스웨덴 연구 위원회, 크누트와 앨리스 발 렌 버그, 카롤 린스 카 Institutet, 웁살라 대학, 웁살라 대학 병원 재단과 라이온의 암 연구 재단, 웁살라; 오 디 세우 스 프로그램, "작업에 대 한는 전략 개발에는 연구 및 기술 분야", "경쟁력, 기업가 정신 및 혁신" 운영 프로그램에 의해 자금에서 구현 (NSRF 2014-2020) 및 그리스에 의해 공동 자금 그리고 유럽 연합 (유럽 지역 개발 기금)

재료

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BD Vacutainer 플라스틱 혈액 수집 튜브 K2EDTA : 튜브 스토퍼ThermoFisher scientific02-689-4재료 저장
BD Vacutainer CPT 단핵 세포 준비 튜브 - 나트륨 헤파린Becton Dickinson362753재료 저장
BD Vacutainer Heparin 혈액 수집 튜브 FAQDaigger Scientific366480재료 저장
UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0Invitrogen15575038세포 처리
원심분리기 튜브 15 mL CS500Corning352096세포 처리
원심분리기 튜브 PP 50 mL CS500Corning352070세포 처리
RPMI Medium 1640 (1X) 액체Invitrogen21875-091세포 처리
Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mLSTEMCELL Technologies17-1440-02세포 처리
혈청학적 피펫 5 mLSarstedt861,253,001세포 처리
혈청학적 피펫 10 mLSarstedt861,254,001세포 처리
혈청학적 피펫 25 mLSarstedt861,685,001세포 처리
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(D-PBS) (1X)Invitrogen14190250세포 처리
Neubauer 플레이트Marienfeld-Superior640010세포 처리
Tuerk 용액Sigma-Aldrich93770세포 처리
PureLink 게놈 DNA 미니 키트InvitrogenK1820-01DNA 추출
QIAamp RNA 혈액 미니 키트Qiagen52304RNA 추출
AllPrep DNA/RNA 미니 키트Qiagen80204DNA/RNA 추출
5X 첫 번째 가닥 완충액InvitrogenP/N Y02321cDNA 합성
무작위 프라이머, 20 &마이크로; gPromegaC1181cDNA 합성
RNaseOUT& 무역; 재조합 리보뉴클레아제 억제제Invitrogen10777019cDNA 합성
DTTInvitrogenP/N Y00147cDNA 합성
SuperScript II 역전사효소Invitrogen18064-014cDNA 합성
10 mM dNTP MixInvitrogen18427013cDNA 합성, PCR
PCR 완충액InvitrogenO00065PCR
MgCl2 (염화마그네슘) (25 mM)ThermoFisher scientificAB0359PCR
Taq DNA 중합효소, 재조합Invitrogen10342-020PCR
Applied Biosystems 5′ 라벨링된 프라이머ThermoFisherscientific-PCR/Clonality assessment
Agilent High Sensitivity DNA KitAgilent Technologies5067-4626PCR product quantification
UltraPure TBE Buffer, 10XThermoFisher scientific15581044gel 전기영동
UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mLThermoFisher scientific15585011gel 전기영동
SYBR Safe DNA Gel StainThermoFisher scientificS33102gel 전기영동
10X BlueJuice Gel 로딩 버퍼Invitrogen16500100gel 전기영동
DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-useGeneon305-105gel 전기영동
UltraPure AgaroseThermoFisher scientific16500500gel 전기영동
아가로스 저겔화 온도Sigma-AldrichA9414-250G겔 전기영동
Novex TBE Gels, 10%, 10웰ThermoFisher scientificEC6275BOXgel 전기영동
ExoSAP-IT PCR 제품 클린업 시약ThermoFisher scientific78201.1.mLPCR 제품 클린업
QIAquick Gel Extraction Kit (50)Qiagen28704PCR 제품 세척
GenomeLab DTCS 퀵 스타트 키트Beckman Coulter608120Sanger 염기서열
아세트산나트륨 용액(3M), pH 5.2ThermoFisher scientificR1181Sanger 염기서열분석
글리코겐, 분자생물학 등급ThermoFisher scientificR0561Sanger 염기서열
에탄올 절대EMD Millipore1024282500Sanger 염기서열분석
SafeSeal 튜브 1.5 mLSarstedt72,706범용
Multiply-Pro 컵 0.2 mL, PPSarstedt72,737,002범용
원심분리기장비
PCR 기계장비
BioanalyzerAgilent Technologies장비
분석 분석

참고문헌

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