교정 및 DNA 복구 분석 결과 단일 뉴클레오티드 확장 및 TOF MALDI 질량 분석 분석을 사용 하 여

Kang-Yi Su; Steven D. Goodman; Hung-Ming Lai; Rong-Syuan Yen; Wei-Yao Hu; Wern-Cherng Cheng; Liang-In Lin; Ya-Chien Yang; Woei-Horng Fang

doi:10.3791/57862

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방법 논문

교정 및 DNA 복구 분석 결과 단일 뉴클레오티드 확장 및 TOF MALDI 질량 분석 분석을 사용 하 여

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DOI:

10.3791/57862

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2018년 6월 19일

Kang-Yi Su^*¹^,² , Steven D. Goodman^*³ , Hung-Ming Lai¹ , Rong-Syuan Yen¹ , Wei-Yao Hu¹ , Wern-Cherng Cheng² , Liang-In Lin¹^,² , Ya-Chien Yang¹^,² , Woei-Horng Fang¹^,²

¹Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine, National Taiwan University, ²Department of Laboratory Medicine, National Taiwan University Hospital, ³Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children's Hospital and the Department of Pediatrics, The Ohio State University

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

교정 하는 DNA 중 합 효소와 DNA 수리 분석 결과 대 한 비 표시, 라디오 동위-방법 고해상도 TOF MALDI 질량 분석 및 단일 뉴클레오티드 확장 전략을 사용 하 여 개발 되었다. 분석 결과 매우 특정, 간단 하, 빠른, 고 교정에 대 한 수행 하 여 복구 패치 9-뉴클레오티드 보다 짧은 입증 했다.

초록

게놈의 충실 한 복제의 유지 보존 유전 정보에 대 한 최고 이다. 높은 충실도 복제, 평가 비 라는 간단한 개발 했습니다 하 고 매트릭스 보조 레이저 탈 착 이온화 시간의 비행 (TOF MALDI)와 함께 사용 하 여 라디오 동위-방법 질량 분석 (MS) 교정 연구에 대 한 분석. 여기, DNA 중 합 효소 [예를 들면, 대장균 DNA 중 합 효소의 Klenow 파편 (KF) 나 (폴 나)이 연구에서] 모든 4 개의 dideoxyribonucleotide 된 존재 일치 뇌관-템플릿 이중 처리 하는 데 사용 됩니다. 일치 하지 않는 입문서 다음 교정/확장 하 고 MALDI TOF MS를 받게. 제품은 단일 염기 변이 내려 뇌관의 질량 변화에 의해 구별 된다. 중요 한 것은, 한 교정 또한 확인할 수 있습니다 내부 단일 불일치에 대 한 다른 효율성에도 불구 하 고. 3' 끝에서 2-4-뉴클레오티드 (nt)에 있는 불일치 효율적으로 했다, 폴에 의해 교정 그리고 5에서 불일치 뇌관 종점에서 nt만 부분 수정. 아니 교정 뇌관 3' 끝에서 6-9 nt에 있는 내부 불일치에 대 한 발생 했습니다. 이 메서드는 또한 DNA 수리 분석 실험 (예를 들어, 엔 V 복구 경로 대 한 기판의 기본 병 변 수리 평가)에 적용할 수 있습니다. 뇌관 어 deoxyinosine (디) 병 변 3'를 포함 하는 폴에 의해 해결 될 수 나. 실제로, penultimate T-I, G-나, 그리고 A-나 기판 했다 그들의 마지막 2 디 포함 된 뉴클레오티드 excised 폴에 의해 나는 올바른 ddN 5'-monophosphate (ddNMP)를 추가 하기 전에 어 C 동안-나 불일치는 폴에 의해 용납 했다 나 뇌관 없이 확장 될 수 있도록 수리, 감도 및 해상도 MS의 DNA 복구를 측정 하는 분석 결과 보여주는.

서론

DNA 복제 시 DNA polymerases의 교정 기능 자손¹^,²^,³^,⁴,^{로 전송 하는 유전 정보의 높은 충실도 보장 하기 위해 필수적입니다.} ⁵^,^,⁶⁷. 중 합 효소 exonucleases 교정의 기여를 평가 하기 위해 수 있는 유전적 안정성을 보호 하는 메커니즘을 명확히 것.

방사성 표지와 젤 기반 분석 autoradiograms 또는 형광 이미징⁸^,^,⁹¹⁰ 의 densitometric 분석을 함께 전통적으로 DNA의 교정 활동을 탐지 하는 데 사용 되었습니다. polymerases입니다. 기능을 하는 동안 이러한 분석 실험, 비싼, 힘들고 높은 처리량 포맷 ....