녹색 형광 단백질 태그와 4', 6-Diamidino-2-phenylindole 꼬마 선 충 에 얼룩이 단백질 Subcellular 지 방화를 감지

요약

이 프로토콜 열 스트레스 단백질 핵 전 좌는 녹색 형광 단백질 (GFP) 퓨전 단백질 마커로 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)를 사용 하 여 추적 하는 방법을 보여 줍니다 얼룩. 프로토콜을 얼룩이 DAPI 빨리 고 GFP 단백질 subcellular 지 방화 신호 유지.

초록

이 프로토콜, 녹색 형광 단백질 (GFP) 융합 단백질 및 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 단백질 subcellular 지 방화 변화;을 추적 하는 데는 얼룩 특히, 아래는 열 핵 전 스트레스 조건. 단백질 반응 대응에 외부 및 내부 신호. 공통 메커니즘의 subcellular 지 방화를 변경 하는. 이 문서는 항 체, 방사성 라벨 또는 confocal 현미경 요구 하지 않는 단백질 지 방화를 추적 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 문서에서는, GFP 포유류 CLIC4를 포함 하 여 염화 세포내 채널 단백질 (CLICs) 가족의 C. 선 충, 구성원에에서 대상 단백질 EXL-1 태그 데 사용 됩니다. (모터와 전체 유전자 시퀀스) 통합된 변환 exl 1::gfp 유전자 변형 라인 변환 및 γ 방사선에 의해 창조 되 고 안정적으로 유전자와 gfp를 표현 한다. 최근 연구는 열 스트레스, 아니라 산화 스트레스, 따라 EXL 1::GFP 핵에서 축적 했다. 핵 구조와는 DAPI GFP 신호 겹치는 신호 스트레스 EXL 1 subcellular 지 방화 변경 확인 합니다. 이 프로토콜 선물 DAPI 얼룩에 대 한 두 가지 다른 고정 방법: 고정은 에탄올과 아세톤 고정. 이 문서에 제공 된 DAPI 얼룩 프로토콜 신속 하 고 효율적 이며 GFP 신호 및 단백질 subcellular 지 방화 변경. 이 메서드는만 Nomarski, FITC 필터와 DAPI 필터 형광 현미경을 요구 한다. 그것은 작은 실험실 설정, 학부 학생 연구, 고 등 학생 연구 및 생명 공학 교실에 적합 합니다.

서론

단백질 subcellular 지 방화의 변화는 열 스트레스, 기아, 산화 스트레스, apoptosis, 단백질 인 산화 등 내부 또는 외부 신호에 응답에서 일반적인 메커니즘입니다. 예를 들어 열 스트레스는 FOXO 회원 DAF 16 핵 전 좌^1,2, 및^3,4신호 수신 죽음 미토 콘 드리 아에 입찰 translocates 프로 apoptotic BCL-2 단백질을 유도 합니다. 다양 한 기술을 이러한 변화를 감지할 수 있습니다. 서 부 럽 고 화학적 분리 subcellular 구조 (예, 미토 콘 드리 아 또는 핵)의 조합을 잘³목표 달성할 수 있었다. 그러나, 그것은 관심사의 단백질에 대하여 특정 항 체를 요구 한다. 따라서, 잘 설립 된 항 체는 성공에 열쇠 된다. 다른 접근은 다른 subcellular 구조 또는 세포 녹색 형광 단백질 (GFP), 빨간 형광 단백질 (RFP), 노란색 형광 단백질 (YFP), mCherry, 등 다양 한 마커 라벨 한편 라벨의 단백질을 다른 표시와 관심입니다. 그런 다음 대상

프로토콜

1입니다. 솔루션

1. NGM 플레이트
   1. 2l 삼각 플라스 크에 NaCl의 3 세대, 한 천의 17 g, 펩의 2.5 g와 dH₂오 커버 알루미늄 호 일로 플라스 크의 입의 975 mL를 추가 합니다. 압력솥 50 분에 대 한 플라스 크 20-30 분 동안 그것을 멋진.
   2. 멸 균된 솔루션 추가: 1 mL의 1 M CaCl₂, 에탄올에 5 mg/mL 콜레스테롤의 1 mL, 1 mL의 1 M MgSO₄, 및 1 M KPO₄ (pH 6.0) 버퍼의 25 mL. 그들을 잘 혼합 솔루션을 소용돌이 친다.
   3. 액체 디스펜서를 사용 하 여, 60 mm 페 트리 접시에 NGM 솔루션 분배. 한 천의 격판덮개 2/3 전체 채우기. 나중에 사용할 4 ° C에서 밀폐 용기에 그들을 저장 합니다.
2. 1 M KPO₄ 버퍼 (pH 6.0)
   1. KH₂포₄ 10.83 g와 dH₂O, K₂HPO₄ 의 3.56 g 녹 이십시오 다음 100 ml 전체 볼....

결과

염화 물 채널 세포내 단백질 (클릭)는 높은 종¹²에 걸쳐 보존 다기능 단백질. 많은 연구가 보여줍니다 CLICs 세포, autophagy, apoptosis, 발암, 신생, 긴장과는 포유류 시스템^{13,,1415,16 대 식 세포 타고 난 면역 반응 조절 ,17}. C. 선 충에 있는 두 개의 클릭 homologs: exl 1 과 실-4. 우리의 최근 연구가 보여주었다 exl 1 조절 동물 스트레스 관리⁸. 우리는 변환 exl .......

토론

이 기사는 핵을 세포질 로부터 단백질 subcellular 변경 사항을 확인 하는 신속 하 고 효율적인 방법을 제시. 핵 구조 DAPI 얼룩 (그림 3)에 의해 확인 하는 동안 단백질 식 GFP 융해에 의하여 표시 했다. Immunostaining C. 선 충 단백질 도전 이기 때문에, 대부분 선 충 C. 단백질 subcellular 지 방화 마커 단백질 GFP, 나사로, mCherry, 등 그들을 태그 특징으로하는^{18,19 , 20 , 21}.이 기사에서 gfp 의 단백질 세포질 지 방화를 보여 주기 위해 대상 유전자 exl-1 태그를 사용 되었다. 확인 하려면 핵 지역화, DAPI 얼.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DAPI	Biotium	40043	Hoechst 33258 및 Hoechst 33342도 잘 작동합니다
OP50	CGC	OP50	https://cgc.umn.edu/
Caenorhabditis Genetics Center (CGC)			https://cgc.umn.edu/
Kim Wipe	Kimberly-Clark Corporation		soft
tissue Zeiss  AX10	Zeiss		형광 현미경
Axiovision Rel 4.8	Zeiss		현미경 소프트웨어
AxioCam MR Rev3	Zeiss		디지털 카메라
인큐베이터
마이크로 원심분리기
투명 네일 폴리쉬 젤
60mm 페트리 접시
유리 슬라이드
유리 커버슬립
1-20 &마이크로; L 피펫터
20-200 µ L 피펫터
200-1000 µ L 피펫터
1-200 &마이크로; L 피펫 팁
200-1000 &마이크로; L 피펫 팁
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브
플래티넘 와이어 웜 픽