급성 심근 경색 및 심혈 관 질환 MicroRNAs 순환 측정을 위한 디지털 PCR

Summary

순환 microRNAs는 심혈 관 질환 및 급성 심근 경색에 대 한 생체로 약속을 보여주었다. 이 연구에서 우리는 미르 추출, 반전 녹음 방송 및 심혈 관 질환 환자의 혈 청에서 miRNAs의 절대 정량화에 대 한 디지털 PCR 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

순환 혈 청 microRNAs (miRNAs) 순환으로 심장 혈관 세포에서 출시 되는 심혈 관 질환 및 급성 심근 경색 (AMI), 대 한 생체로 약속을 보여왔다. 순환 miRNAs 매우 안정 하 고 측정할 수 있습니다. 특정 한 miRNAs의 양적 표현 병 리, 그리고 일부 miRNAs 쇼 높은 조직 및 질병 특이성에 연결할 수 있습니다. 심혈 관 질환에 대 한 새로운 바이오 마커를 찾는 의료 연구에 대 한 중요성 이다. 아주 최근에, 디지털 연쇄 반응 (dPCR) 발명 되었습니다. dPCR, 형광 가수분해 프로브와 함께 특정 직접 절대 정량화를 수 있습니다. dPCR 낮은 다양성, 높은 선형성 및 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)에 비해 높은 감도 포함 하 여 우수한 기술적 특성을 전시 한다. 따라서, dPCR miRNAs, 특히 대형 멀티 센터 심장 혈관 임상에서 사용에 대 한 직접 측정 하는 더 정확 하 고 재현 가능한 방법 이다. 이 책에서 우리는 효과적으로 혈 청 샘플에 절대 복사 번호 평가 디지털 PCR을 수행 하는 방법을 설명 합니다.

Introduction

순환 miRNAs 질병, 심혈 관 질환¹등의 숫자에 대 한 유망 표식으로 확인 되었습니다. miRNAs는 작은, 비 코딩 단일 가닥 RNA 분자 (약 22 뉴클레오티드 긴) 관련은 post-transcriptional 레 귤 레이 션 을 통해 메신저 RNA 번역 및 영향을 미치는 유전자 식², 변경에 생리 적 및 병 적인 상태에 순환으로 해제 됩니다. 특정 miRNAs의 양적 표현, 병 리에 연결 될 수 있습니다 그리고 일부 miRNAs 보여 높은 조직과 질병 특이성¹. 심혈 관 질환, miRNAs 되고있다 매력적인 후보자로 소설 생체 PCR 방법론³의 도움으로 측정할 수 있기 때문에 그들은 혈 청에 있는 현저 하 게 안정 하 고 쉽게 할 수 있다. 작은 연구에서 심근 경색에 대 한 생체로 miRNAs의 잠재적인 가치를 평가 하지만 큰 동료에서 유효성 검사²부족 이다. 예를 들어 미르-499 이다 높은 심근 근육 표현 발견 하 고 아미^4,,5....

Protocol

1. 혈장/혈 청에서 miRNA의 추출

참고: 계량 miRNAs 적절 하 게, 위하여 혈장/혈 청 으로부터 분리 하 여 정확한 예측에 관한 중요 한 단계입니다. 명심할 것, 특히 때문에 다른 프로토콜, 중요 한 건 샘플을 처리 하는 동안 동일한 워크플로를 준수 하는 것입니다. 이 프로토콜에서 miRNA는 혈 청의 50 µ L에서 추출 됩니다. 이 제한은 올바른 추출 과정으로 200 µ L를 사용 하지 마십시오.

1. 혈 청을 준비 하거나 냉동된 샘플을 동결 해제 합니다.
2. 혈 청의 50 µ L를 250 µ L (5 권) 상업 세포 시 약을 추가 합니다. Vortexing 여는 세포를 지원 합니다. 5 분 동안 실 온에서 벤치에는 lysate와 튜브를 놓습니다.
3. 스파이크에 컨트롤 (10⁷ 복사본 / µ L x 1.6)의 3.5 µ L로 lysate 스파이크와 vortexing에 의해 그들을 섞는다.
4. 단계 구분에 대 한 클로 프롬 (즉, 시작 혈 청 샘플으로 동일한 금액)의 50 µ L를 추가 합니다. 15 미 위 2-3 분 동안 실 온에서 벤치에 튜브 튜브를 적극적으로 악수.
5. 단계 구분에 대 일 분 동안 4 ° C에서 12000....

Results

디지털 PCR 형광 가수분해 프로브와 함께 연구를를 직접 복사본 / µ L에서 특정 miRNAs의 절대 금액을 정할 수 있습니다. DPCR에서 샘플 dPCR 기술 하지 않아도 약 20000 개별 PCR 반응에서 분할로¹⁰을 복제 합니다. DPCR 시스템 활용 통계 분석 형광 신호 (긍정적이 고 부정적인 반응 사이 다른)의 푸아송의 수학 곡선¹⁰의 표준에 대 한 필요 없이 절대 정량화를 사용. 허용 물방울 수 농도 제대로 계산 하기 위해 필요 (> 15000). 아니 템플릿 컨트롤 상당한 일반적인 증폭의 제외를 확인합니다. 분석에 포함 된 모든 샘플 같은 볼륨, 방법, 및 PCR 프로토콜을 사용 하 여 얻은 결과의 유효성을 강화 하기 위해 처리 됩니다. DPCR에서 얻은 농도 아군에 합성으로 분석 하는 모든 샘플에서 중간 정상화 절차를 사용 하 여 정규화는 선 충 C.

Discussion

디지털 PCR PCR는 샘플 내에서 핵 산의 직접 절대 정량화를 허용 하는 상대적으로 새로운 끝점 방법입니다. 메서드를 사용 하면 감소 변화, 증가 일상적인 재현성 및 우수한 감도^11,12를 포함 하 여 특정 장점을 있습니다. 또한, 분할 샘플의 약 20000 단일 반응 및 끝점 분석으로, 때문에 dPCR는에 더 강력한 PCR 양적 RT-PCR¹⁶에 비해 간섭 물질. DPCR에서 이러한 자질 정량화에 대 한 진단 도구로 서 양적 RT-PCR에 매력적인 대안 만들. MiRNAs 순환으로 종종 낮은 혈 청 농도 지금까지 과학자 도전을 받고 적절 하 게 PCR⁹miRNAs 계량입니다. 다른 한편으로, dPCR는 낮은 수 미르 정량화¹⁷에서 관찰 하는 문제를 완화 하는 혈 청에도 낮은 미르 식을 계량 적절.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA-Extraction
miRNeasy 혈청/플라즈마 키트 (50)	Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland 217184		microRNA 추출을 위한 키트. 키트에는 상업용 버퍼 RWT(원고에서 1번이라고 함)가 포함되어 있습니다  및 RPE(필사본에서 2번이라고 함).
miRNeasy 혈청/혈장 스파이크 제어; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol	Qiagen 표본 & Assay Technologies, Hilden, Deutschland	219610	정상화를 위한 스파이크인, 서열: 5'-UCACCGGGUAAAUCAGCUUG-3'
Reverse Transcription
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4366597	microRNA 역전사용 키트
TaqMan MicroRNA Assays M	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assays used in reverse transcription
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	어세이 번호 001352
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	어세이 번호 000200
PCR 플레이트, 96-well, Thermo	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	AB0900	96 웰 플레이트 for reverse transcription
Microseal ' B’ seal Seals	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	MSB1001	적절한 보관을 위한 호일
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1851196	역전사에 사용되는 Cycler
Droplet Digital PCR
100 nmole RNA oligo has-miR-499-5p	Integrated DNA Technologies	Custom	서열: 프로브용 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'ddPCR
슈퍼믹스(dUTP 없음)	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863024	액적 생성에 사용되는 슈퍼믹스
TaqMan MicroRNA Assays	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assays used in digital PCR(fluorescent hydrolysis probe)
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	분석 번호 001352, 상용 프라이머
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	분석 번호 000200, 상업용 프라이머
DG8 카트리지 및 개스킷	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1864007	카트리지는 액적 생성을 위해 최대 8개의 샘플을 사용합니다
DG8 카트리지 홀더	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863051	액적 생성 시 카트리지 보유
프로브용 액적 생성 오일	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863005	액적 생성에 사용되는 오일
ddPCR 96-웰 플레이트	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	12001925	96 웰 플레이트 ddPCR
PCR 플레이트 열 밀봉, 호일, 피어싱 가능	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1814040	피어싱 가능한 호일, 액적 리더
ddPCR 액적 리더 오일	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863004	액적 판독에 사용되는 오일
QX100 또는 QX200 액적 발생기	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863002	액적 발생기는 샘플/오일 에멀젼
PX1 PCR에서 액적을 생성합니다. Plate Sealer	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1814000	PCR
C1000 터치 열 순환기	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1851196	에 사용되는
	Cycler Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863003	광학 검출기
로 PCR 양성 및 PCR 음성 액적 판독프로브용 ddPCR 버퍼 제어	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863052	블랭크 컨트롤  8-well cassette
Software
QuantaSof Software	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1864011	액적 판독 프로그램
Prism Windows 5	GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA		통계 분석 프로그램