급성 심근 경색 및 심혈 관 질환 MicroRNAs 순환 측정을 위한 디지털 PCR

요약

순환 microRNAs는 심혈 관 질환 및 급성 심근 경색에 대 한 생체로 약속을 보여주었다. 이 연구에서 우리는 미르 추출, 반전 녹음 방송 및 심혈 관 질환 환자의 혈 청에서 miRNAs의 절대 정량화에 대 한 디지털 PCR 프로토콜을 설명합니다.

초록

순환 혈 청 microRNAs (miRNAs) 순환으로 심장 혈관 세포에서 출시 되는 심혈 관 질환 및 급성 심근 경색 (AMI), 대 한 생체로 약속을 보여왔다. 순환 miRNAs 매우 안정 하 고 측정할 수 있습니다. 특정 한 miRNAs의 양적 표현 병 리, 그리고 일부 miRNAs 쇼 높은 조직 및 질병 특이성에 연결할 수 있습니다. 심혈 관 질환에 대 한 새로운 바이오 마커를 찾는 의료 연구에 대 한 중요성 이다. 아주 최근에, 디지털 연쇄 반응 (dPCR) 발명 되었습니다. dPCR, 형광 가수분해 프로브와 함께 특정 직접 절대 정량화를 수 있습니다. dPCR 낮은 다양성, 높은 선형성 및 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)에 비해 높은 감도 포함 하 여 우수한 기술적 특성을 전시 한다. 따라서, dPCR miRNAs, 특히 대형 멀티 센터 심장 혈관 임상에서 사용에 대 한 직접 측정 하는 더 정확 하 고 재현 가능한 방법 이다. 이 책에서 우리는 효과적으로 혈 청 샘플에 절대 복사 번호 평가 디지털 PCR을 수행 하는 방법을 설명 합니다.

서론

순환 miRNAs 질병, 심혈 관 질환¹등의 숫자에 대 한 유망 표식으로 확인 되었습니다. miRNAs는 작은, 비 코딩 단일 가닥 RNA 분자 (약 22 뉴클레오티드 긴) 관련은 post-transcriptional 레 귤 레이 션 을 통해 메신저 RNA 번역 및 영향을 미치는 유전자 식², 변경에 생리 적 및 병 적인 상태에 순환으로 해제 됩니다. 특정 miRNAs의 양적 표현, 병 리에 연결 될 수 있습니다 그리고 일부 miRNAs 보여 높은 조직과 질병 특이성¹. 심혈 관 질환, miRNAs 되고있다 매력적인 후보자로 소설 생체 PCR 방법론³의 도움으로 측정할 수 있기 때문에 그들은 혈 청에 있는 현저 하 게 안정 하 고 쉽게 할 수 있다. 작은 연구에서 심근 경색에 대 한 생체로 miRNAs의 잠재적인 가치를 평가 하지만 큰 동료에서 유효성 검사²부족 이다. 예를 들어 미르-499 이다 높은 심근 근육 표현 발견 하 고 아미^4,,56에 크게 증가를 보였다. 그것은 또한, 조절 프로그램 된 세포 죽음 (apoptosis)와 cardiomyocytes의 차별화 및 따라서 AMI⁷다음 몇 가지 메커니즘에 관련 된. 우월과 아미의 진단에 대 한 miRNAs의 증분 값을 보고 몇 가지 작은 연구를 제외 하 고 우월 또는 높은 감도 심장 troponins 평등 입증 되지 않은 아직 대규모 연구^{2,5 ,,68}. 큰 동료에서 더 많은 예비 연구는, 따라서, miRNAs의 잠재적인 진단 가치를 평가할 필요 합니다. 또한, miRNA 정량화의 방법을 최적화 하 고⁹프로토콜 표준화를 사용 하 여 비교. 표준화 된 분석 실험 일관성 없는 결과 줄일 수 있습니다 하 고 일상적인 임상 응용 프로그램에 대 한 잠재적인 생체 되 miRNAs biomarkers 그들의 임상 적용 되도록 재현 방법으로 양이 정해질 필요가 도움이 될 수 있습니다.

최근, dPCR 끝점 분석으로 도입 되었습니다. 그것은 약 20000 개별 반응¹⁰샘플 파티션을. DPCR 시스템은 다음 수학 포아송 통계 분석 형광 신호 (긍정적이 고 부정적인 반응)의 표준 곡선¹⁰없이 절대 정량화를 사용를 사용 합니다. 때 dPCR를 결합 하 여 형광 가수분해 프로브, miRNAs의 매우 구체적인 직접 절대 정량화 가능한 이루어집니다. 디지털 연쇄 반응으로 나타났습니다 미르 수준 측정에 대 한 (를 포함 하 여 감소 변화, 증가 일상적인 재현성, 선형성의 고차 및 높은 감도) 우량한 기술적인 질을 전시 하는 순환 양적 실시간 PCR^10,11에 비해. 이러한 우수한 기술적 특성 생체로 순환 miRNAs를 사용 하 여 현재 한계를 완화 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 및 biomarkers 대형 멀티 센터 심장 혈관 임상에서과에서 진단 방법으로 miRNAs의 설립으로 이어질 수 있습니다. 일반. 이전 연구에서 우리는 최근 miRNAs는 AMI 환자의 순환의 절대 정량화에 대 한 dPCR를 적용 하 고 정량¹²miRNAs의 정량화에 비해 우수한 진단 가능성을 입증 할 수 있었다.

이 출판물에는 dPCR를 사용 하 여 직접 심장 혈관 miRNAs 순환 측정에 대 한 정확 하 고 재현 방법 설명 하겠습니다. 혈 청, 디지털 PCR를 사용 하 여 미르 수준 절대 정량화 대형 멀티 센터 심장 혈관 임상 시험에 사용에 대 한 잠재적인 보여줍니다. 이 책에서 우리가 자세히 설명 효과적으로 디지털 PCR을 수행 하는 방법 및 혈 청에 절대 미르 복사본 수를 검출 하는 방법.

프로토콜

1. 혈장/혈 청에서 miRNA의 추출

참고: 계량 miRNAs 적절 하 게, 위하여 혈장/혈 청 으로부터 분리 하 여 정확한 예측에 관한 중요 한 단계입니다. 명심할 것, 특히 때문에 다른 프로토콜, 중요 한 건 샘플을 처리 하는 동안 동일한 워크플로를 준수 하는 것입니다. 이 프로토콜에서 miRNA는 혈 청의 50 µ L에서 추출 됩니다. 이 제한은 올바른 추출 과정으로 200 µ L를 사용 하지 마십시오.

1. 혈 청을 준비 하거나 냉동된 샘플을 동결 해제 합니다.
2. 혈 청의 50 µ L를 250 µ L (5 권) 상업 세포 시 약을 추가 합니다. Vortexing 여는 세포를 지원 합니다. 5 분 동안 실 온에서 벤치에는 lysate와 튜브를 놓습니다.
3. 스파이크에 컨트롤 (10⁷ 복사본 / µ L x 1.6)의 3.5 µ L로 lysate 스파이크와 vortexing에 의해 그들을 섞는다.
4. 단계 구분에 대 한 클로 프롬 (즉, 시작 혈 청 샘플으로 동일한 금액)의 50 µ L를 추가 합니다. 15 미 위 2-3 분 동안 실 온에서 벤치에 튜브 튜브를 적극적으로 악수.
5. 단계 구분에 대 일 분 동안 4 ° C에서 12000 x g에서 튜브 원심.
   참고: 샘플 이제 RNA, 흰색 interphase, 그리고 낮은, 핑크 유기 단계를 포함 하는 위 수성 단계로 구분 됩니다.
6. 위 수성 단계 (100 µ L) RNA를 포함 하는 새로운 관으로 이동. 이 올바른 RNA 수 위조로 흰색 interphase 자료를 전송 하지 않습니다.
7. µ 150 L (즉, 전송된 샘플의 볼륨 x 1.5) 100% 에탄올을 추가 합니다. 그들을 아래로 pipetting으로 재료를 믹스. 그들, 원심 고 신속 하 게 다음 단계로 이동 하지.
8. 2 mL 컬렉션 튜브에서 상업 회전 열에 샘플의 250 µ L 플라스틱 뚜껑을 닫습니다. 원심에서 열 > 흐름 통해 15 미 삭제에 대 한 실 온에서 8000 x g.
9. 스핀 열에 상업적인 세척 버퍼 번호 1의 700 µ L를 추가 합니다. 뚜껑을 닫고 원심에서 열 > 8000 x g 15 미 삭제 실행을 통해 세척 버퍼에 대 한 실내 온도에.
10. 스핀 열에 상업적인 세척 버퍼 번호 2의 500 µ L를 추가 합니다. 뚜껑을 닫고 원심에서 열 > 8, 000 15 미 삭제 실행을 통해 세척 버퍼에 대 한 실 온에서 g x.
11. 스핀 열 80% 에탄올 500 µ L 플라스틱 뚜껑을 닫고, 원심에서 열 > 8, 000 x g 2 분에 대 한 실 온에서 흐름 통해와 수집 튜브 삭제.
12. 새로운 2 mL 컬렉션 튜브를 회전 열을 전송 합니다. 열 건조는 막 열린된 뚜껑 최고 속도로 원심 플로우 스루와 수집 튜브를 삭제 합니다.
13. 새로운 1.5 mL 컬렉션 튜브로 스핀 열을 전송 합니다. 막의 센터에 직접 RNase 무료 물 30 µ L을 적용 하 여 RNA을 elute. 뚜껑을 닫습니다. 1 분에 대 한 최고 속도로 열 원심
14. -70 ° c.에 RNA를 저장
    참고: RNase 무료 물-70 ° C ~-20 ° C 사이에서 순화 된 RNA의 저장 하면 1 년에 대 한 RNA의 저하 없이. 제조 업체의 프로토콜에 따라 RNase 무료 물 희석 RNA의 최소 금액은입니다 10 µ L. 10 µ L 수 있습니다 충분히 수 화 막 그리고 총 RNA 수확량 감소를 사용 하 여.

2. 반전 녹음 방송

참고: 보완 DNA (cDNA) 다음 15 µ L 반전 녹음 방송 (RT) 프로토콜 (총 반응 볼륨)를 사용 하 여 합성 되었다.

1. RT 키트 얼음에 녹여 냉장고 만큼 저하에서 그들을 방지 하 고 사용 하기 전에 그들을 아래로 회전 수에 효소를 유지. 얼음에 RT 뇌관을 해 동 하 고 사용 하기 전에 그들을 아래로 회전.
2. 표 1에 설명 된 대로 마스터 믹스를 준비 합니다.
3. 믹스 마스터의 10 µ L 당 96 잘 접시에 잘 추출 된 RNA의 5 µ L을 결합.
4. 2 분 동안 4 ° C에서 2000 x g에 잘 접시 원심
5. 반전 녹음 방송에 대 한 표 2 에 설명 된 열 주기 프로토콜을 사용 합니다.
   참고: 아래 설명 된 대로 cDNA 직접 처리 될 수 있습니다 디지털 PCR 기계에 ( 재료의 표참조). 또는, 그것은-20 ° c.에 저장 될 수 있습니다.

3. 물방울 생성 및 디지털 PCR

참고: 디지털 PCR 다음 40 µ L 프로토콜을 사용 하 여 수행 되었다.

1. 해 동 상업 dPCR 믹스, 준비 된 cDNA 및 얼음에 PCR 뇌관. 사용 하기 전에 잠시 그들을 원심.
2. 에 설명 된 대로 마스터 믹스를 준비 표 3.
3. RT 제품의 1.33 μ/잘 추가 하 고 간단히 원심.
4. 8 잘 카세트 (중간 행)의 각 음에 샘플의 20 μ를 플라스틱.
   참고: 8 잘 카세트 완전 하 게 채워지지 경우 채울 cDNA (즉, 추출 된 RNA 대신 물으로 생산 하는 실시간 제품)을 생략 하는 템플릿이 아닌 컨트롤 (NTCs)와 나머지 우물 또는 dPCR 상업 버퍼. NTC는 오염 제어 역할을 합니다. 물 그 방울 형성의 품질에 악영향을 줄 것입니다 때문에 나머지 우물에서 사용할 수 없습니다.
5. 8 잘 카세트의 유 정 (아래쪽 행)으로 프로브에 대 한 작은 물방울 생성 기름의 70 μ를 플라스틱.
6. 8 잘 카세트 위에 가스 켓을 놓고 방울 생성기에서 카세트를 배치 합니다. 드롭릿 생성기를 닫습니다. 3 표시등은 녹색으로 고정 될 때까지 기다립니다.
   참고: 방울 지금 생성 되고있다.
7. 신중 하 고 천천히 pipetting으로 96 잘 접시의 별도 우물으로 물방울 형성 샘플 (맨 윗줄)의 40 μ를 전송.
8. 샘플에 작은 물방울 대형을 완료 한 후 인감 4 180 ° C에서 pierceable dPCR 호 PCR 플레이트 s.
9. 호 봉인 PCR-접시는 cycler 놓고 2.5의 경사로 속도로 표 4 에 설명 된 대로 주기 ° C/s.

4. 물방울 읽기 및 분석

1. 플레이트 홀더 베이스에 열 cycler에서 접시를 전송. 상단의 PCR 플레이트에 플레이트 홀더를 배치 하 여 PCR 접시를 조입니다.
2. 상업적인 dPCR 소프트웨어를 시작 합니다.
3. 설정에서 샘플 이름, 실험, 그리고 대상의 이름을 입력 합니다. 절대 정량화를 선택 합니다.
4. 실행을 클릭 하 여 읽기 방울을 시작 합니다. 가수분해 프로브를 작업할 때 탐지 화학으로 팸/HEX 또는 팸/빅 을 선택 합니다.
   참고: 상업 dPCR 소프트웨어 다음 자동-분석 데이터.
5. 올바른 물방울 생성 되도록 결과 테이블에 물방울 번호를 확인 하십시오.
6. 같은 정량된 miRNA와 모든 우물을 선택 하 고 분석을 클릭 합니다. 2D 오를 사용 하 여 긍정적인 물방울 표시 하 고 수동으로 수정 자동 분석 데이터 (그림 1).

5. 올바른 샘플 계산

1. 샘플 샘플 정규화 인자 (NF)를 곱하여 정규화.
   NF = 중간 [C. 선 충 미르-39 측정]_{모든 샘플}/ [선 충 C. 미르-39]_{주어진된 샘플}
2. 마지막 미르 혈 청 농도, 희석 요인 (DF)에 대 한 조정 계산 합니다.
   [미르] _마지막 = [미르]_{원시 값} DF_RT DF_dPCR DF_Ex x x x
   장소:
   [미르] _{원시 값} = 상업 dPCR 소프트웨어에 의해 계량 미르
   DF_RT 반전 녹음 방송;에 서식 파일의 희석 비율 =
   DF_dPCR = dPCR;에 서식 파일의 희석 비율
   _Ex DF = 희석 요인 추출에서.

6. 합성 Oligonucleotide 희석 시리즈

1. 동결 건조 된 합성 oligonucleotide 얼음에 녹여 짧게 원심 그것.
2. 동결 건조 된 합성 oligonucleotide nuclease 무료 물 10 pmol의 최종 농도에 희석 / µ L. 간단히 원심 그것.
3. 표 5에 설명 된 대로 nuclease 무료 물에 희석. 8000 x g 10에 각 희석 단계 사이 짧게 희석 원심 s.
4. 2 단계에서 설명한 대로 반전 녹음 방송으로 계속 하 고 3 단계와 4 단계에서 설명한 대로 디지털 PCR와 샘플을 분석.

결과

디지털 PCR 형광 가수분해 프로브와 함께 연구를를 직접 복사본 / µ L에서 특정 miRNAs의 절대 금액을 정할 수 있습니다. DPCR에서 샘플 dPCR 기술 하지 않아도 약 20000 개별 PCR 반응에서 분할로¹⁰을 복제 합니다. DPCR 시스템 활용 통계 분석 형광 신호 (긍정적이 고 부정적인 반응 사이 다른)의 푸아송의 수학 곡선¹⁰의 표준에 대 한 필요 없이 절대 정량화를 사용. 허용 물방울 수 농도 제대로 계산 하기 위해 필요 (> 15000). 아니 템플릿 컨트롤 상당한 일반적인 증폭의 제외를 확인합니다. 분석에 포함 된 모든 샘플 같은 볼륨, 방법, 및 PCR 프로토콜을 사용 하 여 얻은 결과의 유효성을 강화 하기 위해 처리 됩니다. DPCR에서 얻은 농도 아군에 합성으로 분석 하는 모든 샘플에서 중간 정상화 절차를 사용 하 여 정규화는 선 충 C.

토론

디지털 PCR PCR는 샘플 내에서 핵 산의 직접 절대 정량화를 허용 하는 상대적으로 새로운 끝점 방법입니다. 메서드를 사용 하면 감소 변화, 증가 일상적인 재현성 및 우수한 감도^11,12를 포함 하 여 특정 장점을 있습니다. 또한, 분할 샘플의 약 20000 단일 반응 및 끝점 분석으로, 때문에 dPCR는에 더 강력한 PCR 양적 RT-PCR¹⁶에 비해 간섭 물질. DPCR에서 이러한 자질 정량화에 대 한 진단 도구로 서 양적 RT-PCR에 매력적인 대안 만들. MiRNAs 순환으로 종종 낮은 혈 청 농도 지금까지 과학자 도전을 받고 적절 하 게 PCR⁹miRNAs 계량입니다. 다른 한편으로, dPCR는 낮은 수 미르 정량화¹⁷에서 관찰 하는 문제를 완화 하는 혈 청에도 낮은 미르 식을 계량 적절...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RNA-Extraction
miRNeasy 혈청/플라즈마 키트 (50)	Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland 217184		microRNA 추출을 위한 키트. 키트에는 상업용 버퍼 RWT(원고에서 1번이라고 함)가 포함되어 있습니다  및 RPE(필사본에서 2번이라고 함).
miRNeasy 혈청/혈장 스파이크 제어; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol	Qiagen 표본 & Assay Technologies, Hilden, Deutschland	219610	정상화를 위한 스파이크인, 서열: 5'-UCACCGGGUAAAUCAGCUUG-3'
Reverse Transcription
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4366597	microRNA 역전사용 키트
TaqMan MicroRNA Assays M	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assays used in reverse transcription
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	어세이 번호 001352
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	어세이 번호 000200
PCR 플레이트, 96-well, Thermo	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	AB0900	96 웰 플레이트 for reverse transcription
Microseal ' B’ seal Seals	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	MSB1001	적절한 보관을 위한 호일
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1851196	역전사에 사용되는 Cycler
Droplet Digital PCR
100 nmole RNA oligo has-miR-499-5p	Integrated DNA Technologies	Custom	서열: 프로브용 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'ddPCR
슈퍼믹스(dUTP 없음)	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863024	액적 생성에 사용되는 슈퍼믹스
TaqMan MicroRNA Assays	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assays used in digital PCR(fluorescent hydrolysis probe)
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	분석 번호 001352, 상용 프라이머
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	분석 번호 000200, 상업용 프라이머
DG8 카트리지 및 개스킷	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1864007	카트리지는 액적 생성을 위해 최대 8개의 샘플을 사용합니다
DG8 카트리지 홀더	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863051	액적 생성 시 카트리지 보유
프로브용 액적 생성 오일	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863005	액적 생성에 사용되는 오일
ddPCR 96-웰 플레이트	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	12001925	96 웰 플레이트 ddPCR
PCR 플레이트 열 밀봉, 호일, 피어싱 가능	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1814040	피어싱 가능한 호일, 액적 리더
ddPCR 액적 리더 오일	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863004	액적 판독에 사용되는 오일
QX100 또는 QX200 액적 발생기	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863002	액적 발생기는 샘플/오일 에멀젼
PX1 PCR에서 액적을 생성합니다. Plate Sealer	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1814000	PCR
C1000 터치 열 순환기	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1851196	에 사용되는
	Cycler Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863003	광학 검출기
로 PCR 양성 및 PCR 음성 액적 판독프로브용 ddPCR 버퍼 제어	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863052	블랭크 컨트롤  8-well cassette
Software
QuantaSof Software	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1864011	액적 판독 프로그램
Prism Windows 5	GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA		통계 분석 프로그램