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방법 논문

급성 심근 경색 및 심혈 관 질환 MicroRNAs 순환 측정을 위한 디지털 PCR

8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57950

⸱

2018년 7월 3일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology and Angiology I, Heart Center Freiburg University, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Medicine, Monash University, 3Department of Medicine I, Lighthouse Core Facility, Medical Center, University of Freiburg, 4Department of Cardiology, Augustinerinnen Hospital, Academic Teaching Hospital, University of Cologne

이 논문에서

요약

순환 microRNAs는 심혈 관 질환 및 급성 심근 경색에 대 한 생체로 약속을 보여주었다. 이 연구에서 우리는 미르 추출, 반전 녹음 방송 및 심혈 관 질환 환자의 혈 청에서 miRNAs의 절대 정량화에 대 한 디지털 PCR 프로토콜을 설명합니다.

초록

순환 혈 청 microRNAs (miRNAs) 순환으로 심장 혈관 세포에서 출시 되는 심혈 관 질환 및 급성 심근 경색 (AMI), 대 한 생체로 약속을 보여왔다. 순환 miRNAs 매우 안정 하 고 측정할 수 있습니다. 특정 한 miRNAs의 양적 표현 병 리, 그리고 일부 miRNAs 쇼 높은 조직 및 질병 특이성에 연결할 수 있습니다. 심혈 관 질환에 대 한 새로운 바이오 마커를 찾는 의료 연구에 대 한 중요성 이다. 아주 최근에, 디지털 연쇄 반응 (dPCR) 발명 되었습니다. dPCR, 형광 가수분해 프로브와 함께 특정 직접 절대 정량화를 수 있습니다. dPCR 낮은 다양성, 높은 선형성 및 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)에 비해 높은 감도 포함 하 여 우수한 기술적 특성을 전시 한다. 따라서, dPCR miRNAs, 특히 대형 멀티 센터 심장 혈관 임상에서 사용에 대 한 직접 측정 하는 더 정확 하 고 재현 가능한 방법 이다. 이 책에서 우리는 효과적으로 혈 청 샘플에 절대 복사 번호 평가 디지털 PCR을 수행 하는 방법을 설명 합니다.

서론

순환 miRNAs 질병, 심혈 관 질환1등의 숫자에 대 한 유망 표식으로 확인 되었습니다. miRNAs는 작은, 비 코딩 단일 가닥 RNA 분자 (약 22 뉴클레오티드 긴) 관련은 post-transcriptional 레 귤 레이 션 을 통해 메신저 RNA 번역 및 영향을 미치는 유전자 식2, 변경에 생리 적 및 병 적인 상태에 순환으로 해제 됩니다. 특정 miRNAs의 양적 표현, 병 리에 연결 될 수 있습니다 그리고 일부 miRNAs 보여 높은 조직과 질병 특이성1. 심혈 관 질환, miRNAs 되고있다 매력적인 후보자로 소설 생체 PCR 방법론3의 도움으로 측정할 수 있기 때문에 그들은 혈 청에 있는 현저 하 게 안정 하 고 쉽게 할 수 있다. 작은 연구에서 심근 경색에 대 한 생체로 miRNAs의 잠재적인 가치를 평가 하지만 큰 동료에서 유효성 검사2부족 이다. 예를 들어 미르-499 이다 높은 심근 근육 표현 발견 하 고 아미4,,56에 크게 증가를 보였다. 그것은 또한, 조절 프로그램 된 세포 죽음 (apoptosis)와 cardiomyocytes의 차별화 및 따라서 AMI7다음 몇 가지 메커니즘에 관련 된. 우월과 아미의 진단에 대 한 miRNAs의 증분 값을 보고 몇 가지 작은 연구를 제외 하 고 우월 또는 높은 감도 심장 troponins 평등 입증 되지 않은 아직 대규모 연구2,5 ,,68. 큰 동료에서 더 많은 예비 연구는, 따라서, miRNAs의 잠재적인 진단 가치를 평가할 필요 합니다. 또한, miRNA 정량화의 방법을 최적화 하 고9프로토콜 표준화를 사용 하 여 비교. 표준화 된 분석 실험 일관성 없는 결과 줄일 수 있습니다 하 고 일상적인 임상 응용 프로그램에 대 한 잠재적인 생체 되 miRNAs biomarkers 그들의 임상 적용 되도록 재현 방법으로 양이 정해질 필요가 도움이 될 수 있습니다.

최근, dPCR 끝점 분석으로 도입 되었습니다. 그것은 약 20000 개별 반응10샘플 파티션을. DPCR 시스템은 다음 수학 포아송 통계 분석 형광 신호 (긍정적이 고 부정적인 반응)의 표준 곡선10없이 절대 정량화를 사용를 사용 합니다. 때 dPCR를 결합 하 여 형광 가수분해 프로브, miRNAs의 매우 구체적인 직접 절대 정량화 가능한 이루어집니다. 디지털 연쇄 반응으로 나타났습니다 미르 수준 측정에 대 한 (를 포함 하 여 감소 변화, 증가 일상적인 재현성, 선형성의 고차 및 높은 감도) 우량한 기술적인 질을 전시 하는 순환 양적 실시간 PCR10,11에 비해. 이러한 우수한 기술적 특성 생체로 순환 miRNAs를 사용 하 여 현재 한계를 완화 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 및 biomarkers 대형 멀티 센터 심장 혈관 임상에서과에서 진단 방법으로 miRNAs의 설립으로 이어질 수 있습니다. 일반. 이전 연구에서 우리는 최근 miRNAs는 AMI 환자의 순환의 절대 정량화에 대 한 dPCR를 적용 하 고 정량12miRNAs의 정량화에 비해 우수한 진단 가능성을 입증 할 수 있었다.

이 출판물에는 dPCR를 사용 하 여 직접 심장 혈관 miRNAs 순환 측정에 대 한 정확 하 고 재현 방법 설명 하겠습니다. 혈 청, 디지털 PCR를 사용 하 여 미르 수준 절대 정량화 대형 멀티 센터 심장 혈관 임상 시험에 사용에 대 한 잠재적인 보여줍니다. 이 책에서 우리가 자세히 설명 효과적으로 디지털 PCR을 수행 하는 방법 및 혈 청에 절대 미르 복사본 수를 검출 하는 방법.

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프로토콜

1. 혈장/혈 청에서 miRNA의 추출

참고: 계량 miRNAs 적절 하 게, 위하여 혈장/혈 청 으로부터 분리 하 여 정확한 예측에 관한 중요 한 단계입니다. 명심할 것, 특히 때문에 다른 프로토콜, 중요 한 건 샘플을 처리 하는 동안 동일한 워크플로를 준수 하는 것입니다. 이 프로토콜에서 miRNA는 혈 청의 50 µ L에서 추출 됩니다. 이 제한은 올바른 추출 과정으로 200 µ L를 사용 하지 마십시오.

  1. 혈 청을 준비 하거나 냉동된 샘플을 동결 해제 합니다.
  2. 혈 청의 50 µ L를 250 µ L (5 권) 상업 세포 시 약을 추가 합니다. Vortexing 여는 세포를 지원 합니다. 5 분 동안 실 온에서 벤치에는 lysate와 튜브를 놓습니다.
  3. 스파이크에 컨트롤 (107 복사본 / µ L x 1.6)의 3.5 µ L로 lysate 스파이크와 vortexing에 의해 그들을 섞는다.
  4. 단계 구분에 대 한 클로 프롬 (즉, 시작 혈 청 샘플으로 동일한 금액)의 50 µ L를 추가 합니다. 15 미 위 2-3 분 동안 실 온에서 벤치에 튜브 튜브를 적극적으로 악수.
  5. 단계 구분에 대 일 분 동안 4 ° C에서 12000 x g에서 튜브 원심.
    참고: 샘플 이제 RNA, 흰색 interphase, 그리고 낮은, 핑크 유기 단계를 포함 하는 위 수성 단계로 구분 됩니다.
  6. 위 수성 단계 (100 µ L) RNA를 포함 하는 새로운 관으로 이동. 이 올바른 RNA 수 위조로 흰색 interphase 자료를 전송 하지 않습니다.
  7. µ 150 L (즉, 전송된 샘플의 볼륨 x 1.5) 100% 에탄올을 추가 합니다. 그들을 아래로 pipetting으로 재료를 믹스. 그들, 원심 고 신속 하 게 다음 단계로 이동 하지.
  8. 2 mL 컬렉션 튜브에서 상업 회전 열에 샘플의 250 µ L 플라스틱 뚜껑을 닫습니다. 원심에서 열 > 흐름 통해 15 미 삭제에 대 한 실 온에서 8000 x g.
  9. 스핀 열에 상업적인 세척 버퍼 번호 1의 700 µ L를 추가 합니다. 뚜껑을 닫고 원심에서 열 > 8000 x g 15 미 삭제 실행을 통해 세척 버퍼에 대 한 실내 온도에.
  10. 스핀 열에 상업적인 세척 버퍼 번호 2의 500 µ L를 추가 합니다. 뚜껑을 닫고 원심에서 열 > 8, 000 15 미 삭제 실행을 통해 세척 버퍼에 대 한 실 온에서 g x.
  11. 스핀 열 80% 에탄올 500 µ L 플라스틱 뚜껑을 닫고, 원심에서 열 > 8, 000 x g 2 분에 대 한 실 온에서 흐름 통해와 수집 튜브 삭제.
  12. 새로운 2 mL 컬렉션 튜브를 회전 열을 전송 합니다. 열 건조는 막 열린된 뚜껑 최고 속도로 원심 플로우 스루와 수집 튜브를 삭제 합니다.
  13. 새로운 1.5 mL 컬렉션 튜브로 스핀 열을 전송 합니다. 막의 센터에 직접 RNase 무료 물 30 µ L을 적용 하 여 RNA을 elute. 뚜껑을 닫습니다. 1 분에 대 한 최고 속도로 열 원심
  14. -70 ° c.에 RNA를 저장
    참고: RNase 무료 물-70 ° C ~-20 ° C 사이에서 순화 된 RNA의 저장 하면 1 년에 대 한 RNA의 저하 없이. 제조 업체의 프로토콜에 따라 RNase 무료 물 희석 RNA의 최소 금액은입니다 10 µ L. 10 µ L 수 있습니다 충분히 수 화 막 그리고 총 RNA 수확량 감소를 사용 하 여.

2. 반전 녹음 방송

참고: 보완 DNA (cDNA) 다음 15 µ L 반전 녹음 방송 (RT) 프로토콜 (총 반응 볼륨)를 사용 하 여 합성 되었다.

  1. RT 키트 얼음에 녹여 냉장고 만큼 저하에서 그들을 방지 하 고 사용 하기 전에 그들을 아래로 회전 수에 효소를 유지. 얼음에 RT 뇌관을 해 동 하 고 사용 하기 전에 그들을 아래로 회전.
  2. 표 1에 설명 된 대로 마스터 믹스를 준비 합니다.
  3. 믹스 마스터의 10 µ L 당 96 잘 접시에 잘 추출 된 RNA의 5 µ L을 결합.
  4. 2 분 동안 4 ° C에서 2000 x g에 잘 접시 원심
  5. 반전 녹음 방송에 대 한 표 2 에 설명 된 열 주기 프로토콜을 사용 합니다.
    참고: 아래 설명 된 대로 cDNA 직접 처리 될 수 있습니다 디지털 PCR 기계에 ( 재료의 표참조). 또는, 그것은-20 ° c.에 저장 될 수 있습니다.

3. 물방울 생성 및 디지털 PCR

참고: 디지털 PCR 다음 40 µ L 프로토콜을 사용 하 여 수행 되었다.

  1. 해 동 상업 dPCR 믹스, 준비 된 cDNA 및 얼음에 PCR 뇌관. 사용 하기 전에 잠시 그들을 원심.
  2. 에 설명 된 대로 마스터 믹스를 준비 표 3.
  3. RT 제품의 1.33 μ/잘 추가 하 고 간단히 원심.
  4. 8 잘 카세트 (중간 행)의 각 음에 샘플의 20 μ를 플라스틱.
    참고: 8 잘 카세트 완전 하 게 채워지지 경우 채울 cDNA (즉, 추출 된 RNA 대신 물으로 생산 하는 실시간 제품)을 생략 하는 템플릿이 아닌 컨트롤 (NTCs)와 나머지 우물 또는 dPCR 상업 버퍼. NTC는 오염 제어 역할을 합니다. 물 그 방울 형성의 품질에 악영향을 줄 것입니다 때문에 나머지 우물에서 사용할 수 없습니다.
  5. 8 잘 카세트의 유 정 (아래쪽 행)으로 프로브에 대 한 작은 물방울 생성 기름의 70 μ를 플라스틱.
  6. 8 잘 카세트 위에 가스 켓을 놓고 방울 생성기에서 카세트를 배치 합니다. 드롭릿 생성기를 닫습니다. 3 표시등은 녹색으로 고정 될 때까지 기다립니다.
    참고: 방울 지금 생성 되고있다.
  7. 신중 하 고 천천히 pipetting으로 96 잘 접시의 별도 우물으로 물방울 형성 샘플 (맨 윗줄)의 40 μ를 전송.
  8. 샘플에 작은 물방울 대형을 완료 한 후 인감 4 180 ° C에서 pierceable dPCR 호 PCR 플레이트 s.
  9. 호 봉인 PCR-접시는 cycler 놓고 2.5의 경사로 속도로 표 4 에 설명 된 대로 주기 ° C/s.

4. 물방울 읽기 및 분석

  1. 플레이트 홀더 베이스에 열 cycler에서 접시를 전송. 상단의 PCR 플레이트에 플레이트 홀더를 배치 하 여 PCR 접시를 조입니다.
  2. 상업적인 dPCR 소프트웨어를 시작 합니다.
  3. 설정에서 샘플 이름, 실험, 그리고 대상의 이름을 입력 합니다. 절대 정량화를 선택 합니다.
  4. 실행을 클릭 하 여 읽기 방울을 시작 합니다. 가수분해 프로브를 작업할 때 탐지 화학으로 팸/HEX 또는 팸/빅 을 선택 합니다.
    참고: 상업 dPCR 소프트웨어 다음 자동-분석 데이터.
  5. 올바른 물방울 생성 되도록 결과 테이블에 물방울 번호를 확인 하십시오.
  6. 같은 정량된 miRNA와 모든 우물을 선택 하 고 분석을 클릭 합니다. 2D 오를 사용 하 여 긍정적인 물방울 표시 하 고 수동으로 수정 자동 분석 데이터 (그림 1).

5. 올바른 샘플 계산

  1. 샘플 샘플 정규화 인자 (NF)를 곱하여 정규화.
    NF = 중간 [C. 선 충 미르-39 측정]모든 샘플/ [선 충 C. 미르-39]주어진된 샘플
  2. 마지막 미르 혈 청 농도, 희석 요인 (DF)에 대 한 조정 계산 합니다.
    [미르] 마지막 = [미르]원시 값 DFRT DFdPCR DFEx x x x
    장소:
    [미르] 원시 값 = 상업 dPCR 소프트웨어에 의해 계량 미르
    DFRT 반전 녹음 방송;에 서식 파일의 희석 비율 =
    DFdPCR = dPCR;에 서식 파일의 희석 비율
    Ex DF = 희석 요인 추출에서.

6. 합성 Oligonucleotide 희석 시리즈

  1. 동결 건조 된 합성 oligonucleotide 얼음에 녹여 짧게 원심 그것.
  2. 동결 건조 된 합성 oligonucleotide nuclease 무료 물 10 pmol의 최종 농도에 희석 / µ L. 간단히 원심 그것.
  3. 표 5에 설명 된 대로 nuclease 무료 물에 희석. 8000 x g 10에 각 희석 단계 사이 짧게 희석 원심 s.
  4. 2 단계에서 설명한 대로 반전 녹음 방송으로 계속 하 고 3 단계와 4 단계에서 설명한 대로 디지털 PCR와 샘플을 분석.

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결과

디지털 PCR 형광 가수분해 프로브와 함께 연구를를 직접 복사본 / µ L에서 특정 miRNAs의 절대 금액을 정할 수 있습니다. DPCR에서 샘플 dPCR 기술 하지 않아도 약 20000 개별 PCR 반응에서 분할로10을 복제 합니다. DPCR 시스템 활용 통계 분석 형광 신호 (긍정적이 고 부정적인 반응 사이 다른)의 푸아송의 수학 곡선10의 표준에 대 한 필요 없이 절대 정량화를 사용. 허용 물방울 수 농도 제대로 계산 하기 위해 필요 (> 15000). 아니 템플릿 컨트롤 상당한 일반적인 증폭의 제외를 확인합니다. 분석에 포함 된 모든 샘플 같은 볼륨, 방법, 및 PCR 프로토콜을 사용 하 여 얻은 결과의 유효성을 강화 하기 위해 처리 됩니다. DPCR에서 얻은 농도 아군에 합성으로 분석 하는 모든 샘플에서 중간 정상화 절차를 사용 하 여 정규화는 선 충 C.

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토론

디지털 PCR PCR는 샘플 내에서 핵 산의 직접 절대 정량화를 허용 하는 상대적으로 새로운 끝점 방법입니다. 메서드를 사용 하면 감소 변화, 증가 일상적인 재현성 및 우수한 감도11,12를 포함 하 여 특정 장점을 있습니다. 또한, 분할 샘플의 약 20000 단일 반응 및 끝점 분석으로, 때문에 dPCR는에 더 강력한 PCR 양적 RT-PCR16에 비해 간섭 물질. DPCR에서 이러한 자질 정량화에 대 한 진단 도구로 서 양적 RT-PCR에 매력적인 대안 만들. MiRNAs 순환으로 종종 낮은 혈 청 농도 지금까지 과학자 도전을 받고 적절 하 게 PCR9miRNAs 계량입니다. 다른 한편으로, dPCR는 낮은 수 미르 정량화17에서 관찰 하는 문제를 완화 하는 혈 청에도 낮은 미르 식을 계량 적절...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
RNA-Extraction
miRNeasy 혈청/플라즈마 키트 (50)Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland 217184microRNA 추출을 위한 키트. 키트에는 상업용 버퍼 RWT(원고에서 1번이라고 함)가 포함되어 있습니다  및 RPE(필사본에서 2번이라고 함).
miRNeasy 혈청/혈장 스파이크 제어; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmolQiagen 표본 & Assay Technologies, Hilden, Deutschland219610정상화를 위한 스파이크인, 서열: 5'-UCACCGGGUAAAUCAGCUUG-3'
Reverse Transcription
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA4366597microRNA 역전사용 키트
TaqMan MicroRNA Assays MApplied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA4440887Assays used in reverse transcription
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA4440887어세이 번호 001352
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA4440887어세이 번호 000200
PCR 플레이트, 96-well, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USAAB090096 웰 플레이트 for reverse transcription
Microseal ' B’ seal SealsBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USAMSB1001적절한 보관을 위한 호일
C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1851196역전사에 사용되는 Cycler
Droplet Digital PCR
100 nmole RNA oligo has-miR-499-5pIntegrated DNA TechnologiesCustom서열: 프로브용 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'ddPCR
슈퍼믹스(dUTP 없음)Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1863024액적 생성에 사용되는 슈퍼믹스
TaqMan MicroRNA AssaysApplied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA4440887Assays used in digital PCR(fluorescent hydrolysis probe)
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA4440887분석 번호 001352, 상용 프라이머
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA4440887분석 번호 000200, 상업용 프라이머
DG8 카트리지 및 개스킷Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1864007카트리지는 액적 생성을 위해 최대 8개의 샘플을 사용합니다
DG8 카트리지 홀더Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1863051액적 생성 시 카트리지 보유
프로브용 액적 생성 오일Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1863005액적 생성에 사용되는 오일
ddPCR 96-웰 플레이트Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1200192596 웰 플레이트 ddPCR
PCR 플레이트 열 밀봉, 호일, 피어싱 가능Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1814040피어싱 가능한 호일, 액적 리더
ddPCR 액적 리더 오일Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1863004액적 판독에 사용되는 오일
QX100 또는 QX200 액적 발생기Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1863002액적 발생기는 샘플/오일 에멀젼
PX1 PCR에서 액적을 생성합니다. Plate SealerBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1814000PCR
C1000 터치 열 순환기Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1851196에 사용되는
Cycler Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1863003광학 검출기
로 PCR 양성 및 PCR 음성 액적 판독프로브용 ddPCR 버퍼 제어Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1863052블랭크 컨트롤  8-well cassette
Software
QuantaSof SoftwareBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1864011액적 판독 프로그램
Prism Windows 5GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA통계 분석 프로그램
. 전에 플레이트 밀봉 ddPCR QX100 또는 QX200 액적 판독기의 나머지 웰을 채우기 위해

참고문헌

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