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방법 논문

기본 교양된 Murine Enterochromaffin 셀의 전체 셀 전기 생리학

10.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58112

⸱

2018년 9월 26일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Enteric Neuroscience Program, Division of Gastroenterology & Hepatology,Department of Physiology & Biomedical Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Gastroenterology, Department of Medicine, University of Massachusetts Medical School

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

Enterochromaffin (EC) 셀 위장 상피 세포의 작은 하위 집합으로 구성 됩니다. EC 셀 전기 고르기가 고 아직 경작 하 고 EC 셀 식별 어려움 생리 연구 제한 세로토닌을 출시. 여기에 제시 된 방법 전기 생리학에 의해 의무가 단일 EC 셀의 기본 문화 모델을 설정 합니다.

초록

위장 (GI) 상피에 Enterochromaffin (EC) 세포 enteroendocrine 세포의 가장 큰 부분 모집단을 구성합니다. 특수 감각 세포로 EC 셀 luminal 자극을 감지 하 고 세로토닌 (5-hyroxytryptamine, 5-HT) 출시 이벤트로 그들을 변환. 그러나, 그들은 어려운 문화 하 고 식별 하는 때문에이 세포의 전기 생리학 이해 가난 하 게 된다. 이 종이 윤곽선 주 EC 세포 배양에 메서드 단일 셀 전기 생리학에 대 한 최적화. 이 프로토콜은 혼합된 기본 문화권에서는, 전압 및 전류 클램프 모드에서 전체 세포 생리학의 높은-품질 레코딩 취득에 접근을 전진 마우스 EC 셀을 식별 하기 위해 유전자 변형 시안색 형광 단백질 (CFP) 기자를 활용 합니다.

서론

위장 (GI) 상피는 여러 종류의 세포로 구성 된 다양 한 커뮤니티입니다. Enteroendocrine 셀 약 모든 상피 세포의 1%를 구성 하 고 enterochromaffin (EC) 세포가 가장 큰 enteroendocrine 셀 인구1. 최근 학문은 enteroendocrine2 와 EC3,4 셀 전기 고르기는 보여준다. 우리 주 EC 세포 생리학을 이해에 관심이 있습니다. 따라서,이 연구의 목적은 전체 세포 생리학에 대 한 최적화 된 기본 EC 셀 문화를 확립 했다.

생산 5-HT (예를 들어, QGP-15,6봉, KRJ-17) 분 비와 전기 생리학5,8 검사에 사용 되는 일반적으로에서 생성 된 기존 EC 셀 불후 종양 약 조직입니다. 이러한 셀 라인에서 획득 한 정보는 귀중 한5,8, 1 차 셀 전기 생리학의 연구 EC 세포 생리학을 제대로 이해 하는 데 필요한 있습니다. 기본 EC 셀의 전기 생리학 격리 상피 문화의 낮은 생존 능력에 의해 제한 된 단일 상피 세포의 문화 필요 합니다.

이 연구에서 제시 하는 문화 메서드 Tph1 CFP9,이 연구에 사용 된 같은 붙일 레이블된 EC 세포와 유전자 변형 쥐에 의존 합니다. 메서드를 사용 하면 최적화 혼합된 기본 상피 문화 개발 이전 단일 셀 전기 생리학32,10 . 이전 방법 효소 소화에 대 한 트립 신/EDTA 플러스 콜라 A 또는 EDTA와 DTT의 조합을 사용 하 고 특히 격리 하 고 기니 돼지11 와 쥐 EC 셀12문화 밀도 그라디언트를 사용. 더 최근에, 장 organoids는 생성 하 고 기계적 electrophysiological 녹음4에 대 한 중단 했다. 이러한 방법을 사용 하 여 문화는 세로토닌 실험, 실시간 정량 분석을 발표 하 고, 그들은 전기 생리학, 사용 될 수 있는 동안은 시간이 걸리는 organoid 세대, EC 셀을 식별 하기 위해 밀도 기울기의 성공에 의존 하 고는 트립 신, EDTA의 세포 파괴 효과입니다. 대조적으로, 여기에 설명 된 프로토콜 효소 및 기계적 치료, 자란 조건 최적화 향상과 전기 생리학에 필요한 높은 휴대 전화 표준에 대 한 적합 한 단일 하 고 건강 한 EC 전지를 생산 하는 절차를 간소화.

이 메서드는 과학자 들을 불멸 하 게 문화 보다는 오히려 혼합된 문화 주 EC 셀에 작동 하 고 단일 셀의 전기 생리학을 조사를 위해 유용할 것 이다. 그러나, 그것은 덜 필요로 정렬 또는 장기 문화 생존 과거 72 h를 필요로 하는 세포 인구를 공부에 대 한 적절 한 증명할 수 있습니다.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 메이 요 클리닉에 의해 승인 되었습니다. 이 프로토콜의 기본 셀 문화 부분 이전에 게시 방법을 참조할 수 있는 추가 정보10을 기반으로 합니다. 모든 실험 절차 (IACUC)에 의해 찬성 되어야 한다 그리고 모든 실험 관련 지침 및 규정에 따라 수행 해야 합니다.

1. 문화 준비

  1. 미디어입니다.
    1. EC 셀 완전 한 문화 미디어 준비 높은 포도 당으로 [4500 mg/L] Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 보충 5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1 %L-글루타민, 1% 페니실린-스 (표 1).
      참고: 미디어 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 한 달 동안.
    2. EC 셀 완전 한 문화 미디어를 필터링 하 고 미디어의 25 mL 50 mL 튜브 37 ° c.에
    3. 높은 포도 [4, 500 mg/L] 0.1% 보충 DMEM 소화 미디어 준비 소 혈 청 알 부 민 (BSA) (표 1).
    4. 소화 미디어를 필터링 하 고 별도 50 mL 튜브 4 10 mL aliquots 미디어의 장소 37 ° C 물 욕조에 품 어.
      참고: 미디어 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 한 달 동안.
  2. 효소입니다.
    1. (공장)에 대 한 4 mg 또는 1.5 mL microcentrifuge 관에서 콜라 사이 [≥800 단위/m g]의 24 mg (결 장)에 대 한 무게.
      참고: 콜라는 최대 1 년 동안-20 ° C에서 안정적입니다.
    2. 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +얼음 차가운 PBS의 1 mL에 aliquot 콜라 resuspend 와 동을 철저 하 게 결합 하 여, 얼음에 솔루션.
  3. 코팅 문화 접시입니다.
    1. 얼음에 4 ˚C에서 하룻밤 세포 외 매트릭스의 150 µ L 해빙
    2. 얼음 처럼 차가운 높은 포도 당을 혈 청 무료 DMEM의 2 mL와 함께 해 동된 세포 외 매트릭스의 100 µ L를 혼합 하 여 5 %w / v 세포 외 매트릭스 솔루션을 확인 합니다.
      참고: 기질 실 온에서 고형화 하 고 코트 요리 준비까지 미리 냉장된 펫, 튜브, 및 미디어 처리 합니다.
    3. 즉시 5% 세포 외 매트릭스 솔루션의 250 µ L와 유리 하단 35 m m의 유리 내부 원 코트. 이 제조 법을 8 접시를 다룰 것입니다.
    4. 나머지 셀 문화 격리 단계 동안 37 ° C 배양 기에서 유리 하단 접시를 놓습니다. 세포 외 매트릭스 설정 1 h의 최소 소요 하지만 다른 격리 단계를 수행 하는 동안 최대 2.5 h에 대 한 알을 품을 수 있다.
      참고: 외피 3 h 기질 방해 수 있는 빌드를 만들 수 있습니다 이상 인감 전체 세포 생리학 동안 형성.

2. 조직 분리

  1. 윤리 지침에 따라 희생 한 3to 6 주 된 남성 또는 여성 CFP Tph1 유전자 변형 마우스 (잭슨 실험실 주식: 028366)9 또는 다른 기자 스트레인.
    참고: 우리 죽음을 보장 하기 위해 보조 수단으로 이산화탄소와 자 궁 경부 전위의 상승 수준의 치명적인 복용량을 사용 합니다. 안락사에 AVAM 위원회 또한 자 궁 경부 전위 동물은 진정 처음 하는 경우 그것의 사용에서 훈련 하는 개인에 의해 허용 기본 안락사 방법을 고려 합니다.
  2. 21g 바늘을 사용 하 여 폴리스 티 렌 거품 해 부 무대에서 안락사 마우스를 밖으로 고정 합니다. 70% 에탄올과 마우스 복 오염을
  3. 마이크로 해 부 집게 (#5)를 사용 하 여 긴장 된 마우스 피부를 당겨 하 고 날카로운 수술가 위를 사용 하 여 마우스 복 부 복 구멍을 노출 하단에 가로 절 개를 만들기 위해. 흉 곽 노출 될 때까지 복 부를 수직으로 다른 절 개를 확인 합니다.
  4. 마이크로 해 부 집게를 사용 하 여 맹 콜론의 명확한 보기를 달성 하기 위해 마우스의 왼쪽으로 이동.
  5. 마이크로 해 부가 위를 사용 하 여 두 번째 원심 배를 잘라 (하지만 여전히 직장에 인접) 콜론의 가장 말 초 부분을 잘라 하. 100 x 15 m m2 페 트리 접시에 추출 된 창 가득 20 mL의 얼음 처럼 차가운 인산 염 장소 식 염 수 (PBS) 버퍼링.
  6. 작은 눈금자를 사용 하 여 측정 하 고 중간 콜론 또는 공장의 10cm를 잘라. 결 장의 proximally 항문 위에 찍은 첫 컷에 있는 10 cm 세그먼트 밖으로 측정 하 여 추출. 반 전체 소장으로 접는 하 고 중간 지점에서 첫 번째 절 개를 하 고 두 번째 절 개를 10cm 첫 근 잘라 하 여 공장을 식별 합니다.
    참고: 계속 얼음에 모든 후속 격리 단계를 수행 합니다.
  7. 얼음 차가운 PBS를 가진 6 mL 주사기를 추출된 장 세그먼트의 루멘에 주사기 바늘을 놓습니다. 마이크로 해 부 집게를 사용 하 여 클램프 주사기 바늘 주위 내장을 봉인 하 고 부드럽게 떨어져 대변 린스를 루멘을 통해 PBS의 10 mL를 플러시.
  8. 장 조직을 반전 하 여 부드럽게 루멘을 통해 마이크로 해 부 집게 직물, 창 자 벽을 곤란 하 게는 집게의 끝에 인접 조직 축소. 세그먼트 내부-아웃 될 때까지이 과정을 반복 바깥쪽에 직면 하는 루멘과.
  9. 마이크로 해 부가 위를 사용 하 여 조직 세그먼트 1cm 조각으로 잘라.
  10. 마이크로 해 부 집게를 사용 하 여 조직 세그먼트 5 mL 살 균 PBS 가득 50 mL 비 커에 전송. 마이크로 해 부가 위를 사용 하 여 조직 조각 가스용 용기 일관성을 말하다.
  11. 전송 피 펫, 깨끗 한 50 mL 튜브에 다진 조직과 얼음 차가운 PBS의 15 mL를 놓습니다. 전송 피 펫과 2 번 triturate, 정착, PBS 상쾌한의 15 mL 고 신선한 PBS와 조직에 대 한 대기. PBS는 분명 때까지 세 번이이 프로세스를 반복 합니다.
  12. 얼음에 씻어 조직 조각 50 mL 튜브를 놓고 조직 문화 후드에 얼음 양동이가지고.

3. 효소 및 기계적 소화

  1. 첫 번째 소화
    1. 물 목욕에서 미리 데워 진된 소화 미디어의 10 mL를 포함 하는 50 mL 튜브 중 하나를 검색 합니다. 50 mL 튜브에 PBS 콜라 솔루션의 다진된 장 조직 조각 250 µ L를 추가 합니다.
      참고: 이전 세척 단계에서 어떤 PBS를 포함 하지 않도록 주의 하십시오.
    2. 37 ° c.에서 5 분 (콜론 또는 공장) 50 mL 튜브 물 욕조에 배치 2 튜브를 흔들어 당 분 x.
      참고: 최적의 타이밍 및 기계적 소화의 강도 다를 수 있습니다 및 사용자에 의해 결정 될 필요가 있을 것 이다. 최적의 소화 상태를 확인 하려면 각 소화 후 셀의 10 µ L 약 수를 볼 수 있습니다. 소화 1 년 동안은 상쾌한 셀의 덩어리로 이루어져 있어야 한다.
    3. 천천히 10 mL 혈 청 학적인 피 펫과 한 번 조직 triturate. 짧게 조각 정착, 조직 하자 다음 전송 피 펫을 사용 하 여 상쾌한의 전체 10 mL을 제거 합니다.
  2. 2 소화: 3.1.1 3.1.3 단계를 반복 하십시오. 콜론을 소화 하는 경우 보육 시간 10 분을 증가 하 고 공장에 대 일 분에 보육 시간을 유지.
    참고: 관찰, 시는 상쾌한 이루어져 있어야 한다 여전히 셀의 큰 덩어리.
  3. 3 소화
    1. 3.1.1 단계 반복
    2. 50 mL 튜브 (콜론 또는 작은 공장) 10 분 동안 37 ˚C 물 욕조에 배치 합니다. 흔들어 튜브 소화 1과 2 보다 더 높은 강도로 분 당 2-3 배.
    3. 천천히 위아래로 10 mL 혈 청 학적인 피 펫과 조직 플라스틱. 짧은 시간에 대 한 정착 조직 조각 허용.
      참고:는 상쾌한 단일 세포 및 작은 덩어리의 조합을 이루어져 있어야 한다.
    4. 전송 피 펫을 사용 하 여 새로운 15 mL 튜브에는 상쾌한의 10 mL를 배치, EC의 데워 세포 완전 한 문화 미디어의 2 개 mL를 추가 및 혼합 한 번 반전.
    5. 실 온에서 5 분 동안 100 x g 에서 회전 시키십시오 다음 전송 피 펫을 사용 하 여 제거는 상쾌한. 전송 피 펫을 사용 하 여 따뜻하게 EC 셀 완전 한 문화 미디어의 2.5 ml에서 나머지 펠 릿 resuspend.
  4. 4 소화: 3.3.1 3.3.5 단계를 반복 하십시오. 콜론에 대 한 보육 시간 15 분을 증가 하 고 공장에 대 일 분 유지.
    참고:는 상쾌한 이제 단일 셀로 이루어져야 합니다.

4. 세포 배양

  1. 전송 피 펫을 사용 하 여 새로운 15 mL 튜브 (5 mL 전체 볼륨)에 소화 3 및 4에서 수집 셀 정지를 결합.
  2. 계산 하는 hemocytometer와 고 회전 실 온에서 5 분 동안 100 x g 에서 나머지 세포 현 탁 액 셀의 10 µ L 약 수를 제거 합니다.
    참고: 마지막 셀 서 스 펜 션은 작은 덩어리와 단일 세포의 구성 됩니다.
  3. 전송 피 펫과 상쾌한을 제거 하 고 mL 당 1000000 세포의 밀도에 EC 셀 완전 한 문화 미디어에 펠 릿을 resuspend.
    참고: 마지막 볼륨 세포 현 탁 액의 최종 세포 수에 따라 달라 집니다. 전형적인 세포 에서부터 2000000 4000000 계산합니다.
  4. 인큐베이터에서 코팅된 유리 하단 문화 요리를 제거 합니다. P1000 피 펫을 사용 하 여 최종 세포 현 탁 액의 250 µ L 각 문화 접시에서 세포 외 기질을 바꿉니다.
    참고: 기질 코팅 유리 하단 접시의 가장자리에 충실 하는 경향이. 특별 해야 합니다 주의 젤 형성을 방지 하기 위해 가장자리에서 코팅을 제거 하.
  5. 1mm에서 바위 억제제 Y-27632의 재고 솔루션을 확인 합니다. 각 접시에 10 µ M 바위 억제제의 작업 농도 달성 하기 위해 각 유리 하단 접시 재고 솔루션의 2.5 µ L를 추가 합니다.
    참고:이 단계 공장 문화의 생존을 위해 중요 하지만 콜론에 대 한 선택 사항입니다.
  6. 24 ~ 72 h (그림 1)에 대 한 37 ° C, 5% CO2 인큐베이터에 각 문화 접시를 놓습니다.

5. 전체 셀 전기 생리학에 대 한 EC 셀의 준비

  1. 라인 두 5 x 0.5 cm 스트립 왁 스 영화는 오 링을 만들 현미경 스테이지의 내경. O-링 (그림 2A-B) 내에서 35 mm 셀 문화 접시를 탑재 합니다.
  2. 첨부 되지 않은 기질 또는 죽은 세포, 그리고 문화 미디어 혈 청에서 방해를 방지 하기 위해 EC 셀에서 완전히 봉인 EC 셀과 전극 사이의 형성 같은 두 부동 파편을 씻어. 철저 한 셀 전기 생리학에 대 한 충분 한 세척을 달성 하기 위해 다음 세가지의 사용:
    1. 옵션 1: 솔루션 exchange은 더 효율적인 긴 챔버에는 원형 보다 챔버. 때문에 EC 셀 라운드 35mm 요리에 교양 있었다, 요리에 대 한 플라스틱 타원형 삽입을 만듭니다.
      1. 3D 인쇄 또는 전통적인 밀링 방법으로 삽입을 만듭니다. 우리가 사용 하는 삽입 (mm)에 다음 크기와 아크릴 플라스틱에서 가공 했다: 외부 직경, 34.5; 안쪽 타원, 20 x 9; 외부 높이, 10; 내부 높이, 1.5; 다리 경 간, 3 x 3; 브릿지 클리어런스, 1.5; 입구와 출구, 4 x 4 각
      2. 삽입 (그림 2A-B) 문화 접시에 낮은 고 1.2 0.1 c m 사각형 (그림 2A-C) x 0.3 x에 클레이 모델링의 두 0.15 0.2 g 가지 현미경 스테이지의 상단에 그것을 확보.
      3. 플라스틱 전송 피 펫, 천천히 추가할 extracellular 해결책 접시 (입구)의 1 개의 측에 다른 쪽 (콘센트)에서 발음 하는 동안.
    2. 옵션 2: 엔지니어링된 플라스틱 삽입 하지 않고 추가 extracellular 솔루션 전송 피 펫에 의해 접시 (입구)의 한쪽에서 반대편 (출구)에서 발음 하는 동안. 천천히 (예를 들어, S w n) 반대편에 포부 바늘의 위치를 미러링 하는 동안 전송 피 펫 (예를 들어, N e s)의 위치를 회전 합니다.
    3. 옵션 3: 1.3.3 단계에서 사각형 coverslips에 외 투 기질., 4.4 단계에서 이러한 coverslips에 세포 현 탁 액 문화. 이 coverslip extracellular 솔루션, 5.1 단계를 생략 하 고 단계 5.3 건너뛰는 가득 직사각형 약 실에 전송 합니다. 옵션 1 (5.2.1.3)에 설명 된 대로 플라스틱 전송 피 펫에서 세포 외 솔루션 챔버를 씻어.
  3. 다시 연결 하는 거꾸로 한 현미경 (그림 2D) 위에 세포 배양 무대. 실 온에서 세포 외 혈 청 무료 솔루션의 EC 세포 배양 품 어.
  4. 4 시간 후, 위에서 설명한 대로 extracellular 해결책으로 다시 문화를 씻어. 전체 셀 전기 생리학 진행.

6. 전체 셀 주 문화에서 EC 셀의 전기 생리학

  1. 전체 셀 기가 물개를 달성
    1. 1-5 m ω의 저항을 한 다스 전극을 당겨.
      참고: 10-100 GΩ 물개를 생성 하는 1-2 m ω 저항의 펫 잘 수행 합니다. 화재 전극 팁 연마 GΩ 물개를 달성 하기 위해 필요 하지 않습니다.
    2. 균등 하 게 코트 폴리머와 모든 펫의 원뿔. 잡아 땅에 피 펫 수평 및 수직 열 총의 앞에. 천천히 돌려 피펫으로 폴리머 견고.
    3. 15 mL 원뿔 튜브에 세포내 솔루션의 약 수를 부 어. 1 mL 주사기를 통해이 솔루션의 1.2 mL 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 전송. 세포내 솔루션의 또 다른 0.7 mL 주사기로 철회 한다. 주사기의 끝에서 공기를 해소. 유연한 34g, 67 m m 바늘, 주사기를 연결 하 고이 바늘에서 남아 있는 어떤 공기를 밖으로 플러시.
    4. Tph1 식별-CFP + 셀을 다른 셀 또는 파편 접촉 하지 않습니다.
    5. 세포내 솔루션에 전극 팁을 채우십시오. 백필 주사기로 피 펫입니다. 신중 하 게 공기 거품 인터페이스를 쫓아 손톱으로 피 펫을 터치 합니다.
    6. 공기의 0.3 mL와 함께 그려진 플런저와 함께 6 mL 주사기 튜브 홀더의 콘센트에 연결 합니다. 전극 홀더에 탑재 합니다.
      참고: 전극 밀봉 전에 세포내 솔루션 내에서 중립적인 또는 긍정적인 압력을 유지 하기 위해 목욕 솔루션을 입력 하기 전에 튜브에 주사기를 연결 합니다.
    7. 첫 번째 단계에 전압 사다리 정상 활성화 전류를 기록 하 고 두 번째 단계에서 단일 전압으로 사용할 수 있는 전류를 기록 하는 2 단계 전압 클램프 프로토콜을 로드 합니다. 열 인감 테스트 (5 mV에 50 kHz).
    8. 목욕 솔루션으로 전극을 낮춥니다. Micromanipulators와 전극 팁에서-비행기와 직접 가로 셀에서 기동. 0.3 mL 주사기에서 공기의 추방.
    9. 부드럽게 전극 셀을 터치를 x 축 따라 수평으로 이동 합니다. 인감 테스트에 막 저항에 EC 셀 증가에 나타나는 보조 개에 대 한 감시. 필요한 경우, 또는 가로 셀의 중간 선 과거 이동 하지, x 축을 따라 z 축을 따라 아래로 전극 재조정.
    10. 0.1-0.2를 적용 6 mL 주사기에 mL 흡입. 100 m ω를 얻을 때까지 플런저를 꾸준히 잡고 플런저에서 그립을 놓습니다. 기가 물개를 기다립니다. 부드럽게 unscrewing 모션으로 주사기를 분리 합니다.
      참고: 경우 EC 셀 처음 봉인 하지 않습니다, 그것 수 있습니다 다시 후속 시도 그것을 밀봉 하기 위하여. 이렇게 부드럽게 당겨 전극으로 EC 셀에서 < 20 m ω 인감 저항. micromanipulators로 보낸된 전극 스티어링, EC 대상된 셀 수동으로 분명 멀리 매트릭스 또는 파편 일주. 그런 다음, 신선한 전극으로 EC 셀을 봉인 하려고 합니다.
  2. 레코드 전체 셀 전압-문이 나+ 현재.
    1. 0.5-1.0으로 그려진 3 mL 주사기를 연결 mL 공기. 흡입의 빠른 탭 적용 (0.1-0.5 mL) 3 mL 주사기에. 전체 셀 액세스를 얻을 때까지 반복 다음 주사기를 조심 스럽게 분리 합니다.
      참고: 주사기의 성능을 처음 다를 수 있으며 점차 시간과 사용 (밀봉 집게 손가락 끝) 3 mL 주사기와 미리 연습 플런저 0.1-0.2에서 반동은 되도록 변경으로 mL의 시작의 위치. 그렇지 않은 경우에 다음 새로운 한 주사기를 교환.
    2. 전체 셀 커패시턴스 보상을 켭니다. 커패시턴스와 직렬 저항을 조정 합니다. 시리즈 저항 보상을 켭니다. 60 ms에서 설정 하는 지연, 예측 후 수정 된 시리즈 저항 보상을 조정 합니다. 인감 테스트를 닫습니다.
    3. 전체 셀 전압-문이 나+ 전류(그림 3)의 5 실행의 평균을 기록 합니다.
    4. 나+ 전류 전압 개폐의 두 개의 매개 변수를 신속 하 게 숙지: 현재 창 (그림 3B, 빨간색 기호, 교차 정상 상태 활성화 및 비활성화 곡선의)와 피크 나+ 전류 전압 밀도입니다.
      참고: EC 셀 피크 나+ 전류 전압 클램프 모드 일반적으로-50 pA 이끌려 잠재력 전류 클램프 모드에서를 갈 것입니다 보다 더 많은 함께. 또한, 전류 전압 클램프(그림 3)에서 다음 보통-200 pA 보다 큰 화재 막 잠재력 (빨간 선, 그림 3D) 근처의 전압에서에서 전류 클램프에 자발적으로 활동 전위는 창 현재 (빨간색 기호, 그림 3B).
  3. 기록 활동 전위 elicited.
    1. 시리즈 저항 보상을 해제 합니다. 외부 명령을 해제 합니다. 클램프를 V-클램프에서 모드를 전환 합니다. 이득을 조정 합니다. 에피소드 현재 클램프 프로토콜을 로드 합니다. 양을 조절 하 여 전류를 0의 아빠 외부 명령 설정.
      주의: 할 하지에서 전환 V-클램프-클램프 (또는 반대로) 첫 번째 외부 명령 해제 하지 않고.
    2. 휴식 막 잠재력 note 그렇게 막 잠재력 현재 창 아래 읽습니다 입력 현재 지주를 조정 (예를 들어, -100-80 mV). 전류 입력의 단계 간격 (그림 3C 삽입, 현재 보유-3 pA + 2 pA 단계) 개최 현재 값 보다 작으면 에피소드 현재 클램프 프로토콜을 조정 한다.
    3. 기록 활동 전위 elicited. 전류 주입을 활동 전위의 최소 금액을 참고 (그림 3C, 청소 5, 들고-3 pA에서 + 4 pA 단계 3 + 1 pA =).
  4. 기록 자발적인 활동 전위입니다.
    1. 외부 명령을 해제 합니다. 전류 클램프 간격 무료 (비 에피소드) 프로토콜을 로드 합니다.
      참고: 현재 간격 없는 클램프 프로토콜에서 전류를 들고 양의 셀에 적합 하도록 확인 되었습니다 때까지 다시 외부 명령을 설정 하지 마십시오.
    2. 전류는 활동 전위를 발생 하지 않았다 이끌려 프로토콜에서 마지막 청소에 주입 액 현재 보유 변경 (두 번째 스윕 동안그림 3D, 전류 입력, 들고-3 pA에서 + 2 pA 단계-1 pA =).
    3. 외부 명령 설정. 이중 확인 현재 예측된 지주 막 잠재력 활동 전위를 임계값을 제공 합니다. 필요한 경우 현재 지주를 조정 합니다. 자연 스러운 활동을 기록 합니다.

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결과

문화:
기본 murine 상피 세포 유전자 변형 Tph1 CFP 모델에서 만든 4 시간 후 요리에 첨부 하 고 24 ~ 72 h 사이 생리 실험에 대 한 준비가 되어. 문화 조건 최적화 되지 했다 때 상피 세포 배양 세포 파편, 손상 된 세포 막, 및 약한 CFP 신호 EC 세포 (그림 1A)에 떠 있는 큰 덩어리의 구성 되어 있습니다. 전기 생리학에 대 한 최적화 된 문화는 단일 세포 및 작은 수 풀으로 이루어져 있다. 건강 한 EC 세포는 밝은 CFP 형광에 의해 쉽게 발견 했다 하 고 활발 한 세척 (그림 1B) 후 접시에 여전히 준수 했다.

...

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토론

EC 세포 기능을 완벽 하 게 이해 전체 세포 생리학에 대 한 셀을 생성 하는 높은-품질 주 문화 메서드를 필요 합니다. GI 상피의 기본 문화 어려운 낮은 생존 때문에 전통적으로 했다. 경감이 혼동 요인, 현재 메서드는 며칠 동안 살아남을 수 있는 작은 또는 큰 창 자에서 단 수 EC 세포의 문화를 생성 합니다.

우리는 다음 문화 전기 생리학에 적합 하도록 품질 향상을 위한 중요 한 발견: (1) 점 막 반전 보다는 그것, (2) 소화 미디어와 FBS BSA의 작은 금액을 추가 문화 미디어, (3) 낮추는 필 링은 콜라 사이 농도, (4) 조정 기간 및 수를 늘리기 위해 기계적 교 반 강도 및 바위 억제제와 경작과 낮은 농도, 그리고 (6)에 기질 도금 단일 셀, (5)의 건강.

마찬가지로, 다음 적응 패치 클램핑 하는 동안 전체 세포를 얻기 위한 중요 한 했다: 적어도 4 h, extracellular 솔루션에 서 서 셀 (1...

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감사의 글

저자는 관리 지원에 대 한 부인을 Lyndsay 버스 비와 씨 로버트 Highet 메이 요 클리닉 부문 엔지니어링 설계 및 3D 인쇄 문화 접시 삽입의에서 감사합니다. 이 작품 AB와 NIH에 셀 위장 (NIH P30DK084567)와 2015 미국 Gastroenterological 협회 연구 학술 상 (AGA RSA) 신호에 대 한 NIH K08 AB (DK106456), 조종사와 메이 요 클리닉 센터에서 ab 타당성 부여에 의해 지원 되었다 GF (DK52766)을 R01입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
100 mm x 15 mm 배양 접시Corning (Falcon)351029
TransferPipette Fisherbrand13-711-7M
10 mL 혈청학적 피펫Corning (Falcon) 
50 mL 코니컬코닝(팔콘) 
15 mL 코니컬코닝(팔콘) 
1,000 mL 장벽 피펫 팁Thermo Scientific (Art)2079E멸균 유지
MatTek 유리 바닥 접시MatTek CorporationP35G-1.5-14-C멸균 유지
마이크로 해부 겸자 - 매우 미세하고 긴 점정밀 과학 도구SB12630M
수술 가위-날카로운Nasco14002-14
마이크로-해부 가위NascoSB46568M
Monoject 하이포 바늘, 21 G x 1" A, 100/BXCovidien8881250172
  Tg(Tph1-CFP)1Able/J MiceJacksonStock # 0283664-7주 사이의 수컷 또는 암컷 마우스 사용
Microfil 비금속 주사기 바늘(34게이지, 67mm)World Precision InstrumentsMF34G-5
Parafilm "M" 실험실 필름Pechiney 플라스틱 포장
R6101Dow Corning
6mL 주사기(일반 루어 팁 포함)Monoject
3 mL 주사기, 일반 루어 팁,Monoject
Electrophysiology Equipment
AmplifierMolecular DevicesAxopatch 200B
데이터 수집 시스템(daq)Molecular DevicesDigidata 1440A
신호 컨디셔너분자 장치CyberAmp 320
소프트웨어분자 장치pClamp 10.6
357551352098352097

참고문헌

  1. Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
  2. Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of Physiology. 589, Pt 5 1081-1093 (2011).
  3. Strege, P. R., et al. Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release. Scientific Reports. 7 (15650), (2017).
  4. Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198 (2017).
  5. Alcaino, C., Knutson, K., Gottlieb, P. A., Farrugia, G., Beyder, A. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is inhibited by D-GsMTx4. Channels. 11 (3), 245-253 (2017).
  6. Kim, M., Javed, N. H., Yu, J. G., Christofi, F., Cooke, H. J. Mechanical stimulation activates Galphaq signaling pathways and 5-hydroxytryptamine release from human carcinoid BON cells. Journal of Clinical Investigation. 108 (7), 1051-1059 (2001).
  7. Modlin, I. M., Kidd, M., Pfragner, R., Eick, G. N., Champaneria, M. C. The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (6), 2340-2348 (2006).
  8. Wang, F., et al. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is important for enterochromaffin cell response to mechanical forces. The Journal of Physiology. 595 (1), 79-91 (2017).
  9. Li, H. J., et al. Distinct cellular origins for serotonin-expressing and enterochromaffin-like cells in the gastric corpus. Gastroenterology. 146 (3), 754-764 (2014).
  10. Psichas, A., Tolhurst, G., Brighton, C. A., Gribble, F. M., Reimann, F. Mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells. Journal of Visualized Experiments. (122), 55687(2017).
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  13. Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, Pt 1 161-175 (2005).

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