기본 교양된 Murine Enterochromaffin 셀의 전체 셀 전기 생리학

요약

Enterochromaffin (EC) 셀 위장 상피 세포의 작은 하위 집합으로 구성 됩니다. EC 셀 전기 고르기가 고 아직 경작 하 고 EC 셀 식별 어려움 생리 연구 제한 세로토닌을 출시. 여기에 제시 된 방법 전기 생리학에 의해 의무가 단일 EC 셀의 기본 문화 모델을 설정 합니다.

초록

위장 (GI) 상피에 Enterochromaffin (EC) 세포 enteroendocrine 세포의 가장 큰 부분 모집단을 구성합니다. 특수 감각 세포로 EC 셀 luminal 자극을 감지 하 고 세로토닌 (5-hyroxytryptamine, 5-HT) 출시 이벤트로 그들을 변환. 그러나, 그들은 어려운 문화 하 고 식별 하는 때문에이 세포의 전기 생리학 이해 가난 하 게 된다. 이 종이 윤곽선 주 EC 세포 배양에 메서드 단일 셀 전기 생리학에 대 한 최적화. 이 프로토콜은 혼합된 기본 문화권에서는, 전압 및 전류 클램프 모드에서 전체 세포 생리학의 높은-품질 레코딩 취득에 접근을 전진 마우스 EC 셀을 식별 하기 위해 유전자 변형 시안색 형광 단백질 (CFP) 기자를 활용 합니다.

서론

위장 (GI) 상피는 여러 종류의 세포로 구성 된 다양 한 커뮤니티입니다. Enteroendocrine 셀 약 모든 상피 세포의 1%를 구성 하 고 enterochromaffin (EC) 세포가 가장 큰 enteroendocrine 셀 인구¹. 최근 학문은 enteroendocrine² 와 EC^3,4 셀 전기 고르기는 보여준다. 우리 주 EC 세포 생리학을 이해에 관심이 있습니다. 따라서,이 연구의 목적은 전체 세포 생리학에 대 한 최적화 된 기본 EC 셀 문화를 확립 했다.

생산 5-HT (예를 들어, QGP-1⁵,⁶봉, KRJ-1⁷) 분 비와 전기 생리학^5,8 검사에 사용 되는 일반적으로에서 생성 된 기존 EC 셀 불후 종양 약 조직입니다. 이러한 셀 라인에서 획득 한 정보는 귀중 한

프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 메이 요 클리닉에 의해 승인 되었습니다. 이 프로토콜의 기본 셀 문화 부분 이전에 게시 방법을 참조할 수 있는 추가 정보¹⁰을 기반으로 합니다. 모든 실험 절차 (IACUC)에 의해 찬성 되어야 한다 그리고 모든 실험 관련 지침 및 규정에 따라 수행 해야 합니다.

1. 문화 준비

1. 미디어입니다.
   1. EC 셀 완전 한 문화 미디어 준비 높은 포도 당으로 [4500 mg/L] Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 보충 5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1 %L-글루타민, 1% 페니실린-스 (표 1).
      참고: 미디어 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 한 달 동안.
   2. EC 셀 완전 한 문화 미디어를 필터링 하 고 미디어의 25 mL 50 mL 튜브 37 ° c.에
   3. 높은 포도 [4, 500 mg/L] 0.1% 보충 DMEM 소화 미디어 준비 소 혈 청 알 부 민 (BSA) (표 1).
   4. 소화 미디어를 필터링 하 고 별도 50 mL ....

결과

문화:
기본 murine 상피 세포 유전자 변형 Tph1 CFP 모델에서 만든 4 시간 후 요리에 첨부 하 고 24 ~ 72 h 사이 생리 실험에 대 한 준비가 되어. 문화 조건 최적화 되지 했다 때 상피 세포 배양 세포 파편, 손상 된 세포 막, 및 약한 CFP 신호 EC 세포 (그림 1A)에 떠 있는 큰 덩어리의 구성 되어 있습니다. 전기 생리학에 대 한 최적화 된 문화는 단일 세포 및 작은 수 풀으로 이루어져 있다. 건강 한 EC 세포는 밝은 CFP 형광에 의해 쉽게 발견 했다 하 고 활발 한 세척 (그림 1B) 후 접시에 여전히 준수 했다.

.......

토론

EC 세포 기능을 완벽 하 게 이해 전체 세포 생리학에 대 한 셀을 생성 하는 높은-품질 주 문화 메서드를 필요 합니다. GI 상피의 기본 문화 어려운 낮은 생존 때문에 전통적으로 했다. 경감이 혼동 요인, 현재 메서드는 며칠 동안 살아남을 수 있는 작은 또는 큰 창 자에서 단 수 EC 세포의 문화를 생성 합니다.

우리는 다음 문화 전기 생리학에 적합 하도록 품질 향상을 위한 중요 한 발견: (1) 점 막 반전 보다는 그것, (2) 소화 미디어와 FBS BSA의 작은 금액을 추가 문화 미디어, (3) 낮추는 필 링은 콜라 사이 농도, (4) 조정 기간 및 수를 늘리기 위해 기계적 교 반 강도 및 바위 억제제와 경작과 낮은 농도, 그리고 (6)에 기질 도금 단일 셀, (5)의 건강.

마찬가지로, 다음 적응 패치 클램핑 하는 동안 전체 세포를 얻기 위한 중요 한 했다: 적어도 4 h, extracellular 솔루션에 서 서 셀 (1.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100 mm x 15 mm 배양 접시	Corning (Falcon)	351029
Transfer	Pipette Fisherbrand	13-711-7M
10 mL 혈청학적 피펫	Corning (Falcon)
50 mL 코니컬	코닝(팔콘)
15 mL 코니컬	코닝(팔콘)
1,000 mL 장벽 피펫 팁	Thermo Scientific (Art)	2079E	멸균 유지
MatTek 유리 바닥 접시	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	멸균 유지
마이크로 해부 겸자 - 매우 미세하고 긴 점	정밀 과학 도구	SB12630M
수술 가위-날카로운	Nasco	14002-14
마이크로-해부 가위	Nasco	SB46568M
Monoject 하이포 바늘, 21 G x 1" A, 100/BX	Covidien	8881250172
Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice	Jackson	Stock # 028366	4-7주 사이의 수컷 또는 암컷 마우스 사용
Microfil 비금속 주사기 바늘(34게이지, 67mm)	World Precision Instruments	MF34G-5
Parafilm "M" 실험실 필름	Pechiney 플라스틱 포장
R6101	Dow Corning
6mL 주사기(일반 루어 팁 포함)	Monoject
3 mL 주사기, 일반 루어 팁,	Monoject
Electrophysiology Equipment
Amplifier	Molecular Devices	Axopatch 200B
데이터 수집 시스템(daq)	Molecular Devices	Digidata 1440A
신호 컨디셔너	분자 장치	CyberAmp 320
소프트웨어	분자 장치	pClamp 10.6

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