방법 논문

꼬마 선 충의 대규모 재배 플레이트 기반: 당뇨병에서 대사 변경의 연구에 대 한 샘플 준비

DOI:

10.3791/58117

⸱

2018년 8월 24일

 ,  ,  ,  ,  , 
15th Medical Department, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2Department of Internal Medicine, Heidelberg University, 3German Center for Diabetes Research (DZD), 4European Center for Angioscience, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에서는 고체 미디어 꼬마 선 충 의 대규모 재배 하는 방법을 설명합니다. 액체 문화 하는 대신,이 프로토콜 플레이트 기반 재배 아래 다른 비늘의 매개 변수를 얻기 수 있습니다. 액체와 고체 미디어 문화 형태학 및 대사 차이 생략 하 여 결과의 comparability를 늘어납니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

한 천 배지에서 대규모 방식으로 꼬마 선 충 (C. 선 충)을 배양 시간이 많이 걸리는 및 어려운 수 있습니다. 이 프로토콜에는 서쪽 오 점, 질량 분석, 또는 추가 proteomics 분석으로 진행 하는 단백질의 격리에 대 한 동물의 많은 수를 간단 하 고 저렴 한 방법을 설명 합니다. 또한, immunostainings에 대 한 선 충 수의 증가 동일한 자란 조건 하에서 여러 분석을 통합 하 여 쉽게 구현할 수 있습니다. 또한, 여러 가지 실험 상황 판 사이의 전송을 촉진 된다. 플레이트 문화에서 일반적인 기술 백 금 철사를 사용 하 여 단일 C. 선 충 의 전송을 포함 하 고 채워진된 agar의 전송 청크 메스를 사용 하 여. 그러나, 선 충 숫자 증가 함께 이러한 기술을 지나치게 많은 시간이 소요 된다. 이 프로토콜의 선 충 C. 수많은 단계를 포함 하 여 벌레의 생리학에 샘플 준비의 영향을 최소화 하기 위해 대규모 문화를 설명 합니다. 및 전단 응력의 수명 및 C. 선 충, 따라서 안정적이 고 재현 가능한 결과 검색 하기 위해 중요 한 단계에 대 한 자세한 설명을 요구에서 대사 과정을 변경할 수 있습니다. C. 선 충 은 모델 유기 체 최대 1/3, 신경 세포의 구성 가능성을 전적으로 신경 변경 혈관 컨트롤의 독립적인 조사를 제공 따라서 혈관 부족. 최근, 당뇨병 성 망막 증의 초기 neurodegeneration 혈관 변경 전에 발견 되었다. 따라서, 선 충 C. 공부 하는 당뇨병 합병증의 일반적인 메커니즘에 대 한 특별 한 관심의 이다. 예를 들어의 증가 형성 고급 glycation 엔드 제품 (세) 그리고 반응성 산소 종 (선생님) 관찰 reproducibly C. 선 충에서 발견 되는. 프로토콜 처리 조사의 폭넓은 스펙트럼에 대 한 적절 한 크기의 샘플을 여기, 당뇨병 유발 생 화 확 적인 변경의 연구에 의해 exemplified 표시 됩니다. 일반적으로,이 프로토콜 유용할 수 있습니다 큰 C. 선 충 을 요구 하는 연구에 대 한 숫자와 어떤 액체 문화는 적합 하지 않습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

서쪽 오 점 또는 질량 분석, 단백질 분석, 단백질의 밀리 그램을 해야합니다. 이 항복 C. 선 충, 달성 될 수 있다 액체 문화 또는 고체 미디어 전송 선 충에 세척 하 여는의 수백의 대규모 배양이 필요 합니다. 및 전단 응력 유도 상피 나트륨 채널 (ENaC), 나트륨, 잠재적으로 C. 선 충 의 수명을 변경 하 고 신진 대사 분석1에 영향을 미치는의 증가 된 통풍 관을 통해 삼 투 스트레스 증가 수의 표현 . 따라서, 플레이트-기반 접근 방식에 대 한이 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계 걸릴 계정에 실험적인 가변성에 영향을 미치는 스트레스의 감소. 액체 문화, 다른 한편으로, 선 충의 표현 형에 영향을 하 고 문화 및 nematodes2의 정확한 수의 컬렉션을 복잡 하 게. 또한, 반응 물질 미디어 구성 요소에 의해 변경 될 수 있습니다 그리고 선 충을 도달 하기 전에 하지 균등 하 게 배포할 수 있습니다. 액체 문화의 제한에 대해이 프로토콜 C. 선 충의 대규모 샘플을 경작 하는 양자 택일 접근을 제공 합니다.

C. 선 충 의 3 분 1의 모든 셀3의 만드는 302 신경 세포의 고유한 네트워크 모델 생물 이다. 많은 동종 과학에 그것의 소개부터 orthologous 유전자 기술, 의료 연구를 위한 모형으로 그것의 가치를 증폭 되었습니다. 최근, 당뇨병 성 망막 증, 혈관 손상, 앞에서 신경 장애에 대 한 증거4를발표 되었습니다. C. 선 충 혈관, 부족 하지만 뚜렷한 신경 네트워크 포함 한다 혈관 그들 떨어져 신경 변경 조사를 적합 한 모델을 만드는. 따라서, 선 충 C. 공부 하는 당뇨병 합병증의 일반적인 메커니즘에 대 한 특별 한 관심의 이다. 당뇨병 합병증에 생 화 확 적인 변경 추가 혈당5응답에서 선생님의 형성에 영향을 미치는 나가의 형성을 포함 한다. 연령대와 신경 손상6을 C. 선 충 에서 발견 된다. 만성 질환은 당뇨병 합병증의 평가 함께 여기 exemplified 종종 그들의 근본적인 메커니즘의 평가 대 한 multiparametric 접근을 요구 하는 복잡 한, polygenic 프로세스 발생 합니다. 이 프로토콜 이후에 뿐만 아니라 동시에 여러 개의 매개 변수를 얻기 위해 사용 될 수 있습니다. 액체와 고체 미디어 문화 형태학 및 대사 차이 생략 하 여 증가 comparability 및 multiparametric 접근의 재현성을 얻을 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

참고:이 프로토콜 5 개의 섹션으로 나누어져 있습니다. 섹션 1-3, C. 선 충 에 대규모 문화 주요 프로토콜 제공 됩니다. 섹션 4와 5 exemplified metabolites 당뇨병 대사 산물에서 발생의 평가 대 한 추가 프로토콜을 제공 합니다. 자세히 섹션 1 접시에는 일반적인 대규모 문화를 설명합니다. 섹션 2 섹션 3 대규모 샘플의 수확을 설명 하는 반면 C. 선 충, 대용량의 전송에 중점을 둡니다. 제 4 샘플에서 단백질 격리를 설명 하 고 섹션 5 후속 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 분석을 위해 견본 준비에 설명 합니다.

1. 대규모 문화 접시에

  1. 일반적으로, 메 마른 후드 또는 오염 방지 하려면 화로 옆 작동 합니다.
  2. 문화에 웜 젊은 성인 단계를 도달할 때까지 따라 다음 적응이 이전에 게시 프로토콜7 .
    1. 생활 OP50 대장균 박테리아를 사용 하 여 선 충을 먹이 400 µ M fluorodeoxyuridine agar (안 암 피 실린/FUdR) 실험에 대 한 준비.
    2. 동기 인구의 준비를 위해 unconcentrated OP50, 사용 하 고 성인과 실험 성공에 대 한 사용 하 여 3.3 집중된 OP50 x는 상쾌한의 70%를 제거 하 여.
    3. 매일 먹이 간격으로 것이 좋습니다. 산화 스트레스를 평가할 때는 다른 간격 및 먹이 대 한 볼륨 방해할 수 있습니다 결과.
    4. 접종, 여러 선 충과 접시를 받아 고 약 0.5 x 1 cm2 메스의 조각으로 잘라. 전송 unconcentrated OP50를 포함 하는 직경이 60 mm의 선 충 성장 미디어 (NGM) 접시에 2 ~ 3 조각.
    5. (야생-타입 N2 20 ° C에서 경작 한다) 변형에 대 한 적당 한 온도에 번호판을 품 어 계란은 접시에 표시 될 때까지.
    6. M9 버퍼의 2 mL와 함께 계란과 성인 동물의 대부분 떨어져 세척 하 고 15 mL 튜브에 수집. 2 분 동안 800 x g 에서 정지 원심 한편, 표백 솔루션을 준비 시작 합니다.
    7. Centrifuged 튜브를 꺼내와 10ml 피펫으로와 M9 버퍼를 제거. 성인 nematodes lysed 때까지 소용돌이에 표백 솔루션 및 믹스의 10 mL를 추가 합니다. 이 일반적으로 약 5-7 분, 하지만 15 분 이상 걸리지 않을 또는 계란 실험에 나중에 완벽 하 게 개발 하지 않습니다.
    8. 800 x g 2 분 세척 표백 솔루션에서 계란을 취소 10 mL M9 버퍼와 3 번에서 정지 원심
    9. 이제 OP50 접시에 달걀 서 스 펜 션의 150 µ L를 추가 합니다. 각 접시에 200-300 계란의 밀도 도달 한다. 선 충에 성숙한 단계를 도달할 때까지 기다립니다.
      참고: M9 버퍼 (pH 7.0) 묘사 된 실험에 사용 되는 다음 물질의 구성: 22 mM KH2포4, 42 m m 나2HPO4, 86 mM NaCl. 압력가 마로 소독 혼합물, 1mm MgSO4 추가 합니다. 표백 솔루션 0.5 M NaOH, 2.3 m m NaOCl 증류수에 해결을 포함 합니다.
    10. 준비 살 균 M9 버퍼, 상처로 살 균 피 펫 팁 팁 15 mL 튜브에 그들을 수집 하 고 웜, 씻어.
    11. 접시에 약 1 mL의 M9 버퍼를 적용, 부드럽게 버퍼 nematodes 접시에서 스윙 하 고 부드럽게 피펫으로 여 배포.
    12. 이제, 튜브에서 선 충을 수집 합니다. 잘라 피 펫 팁, (OP50와 시드) 접시에 직접 현 탁 액의 150 µ L을 적용 하 고 현미경으로 선 충의 밀도 평가 (권장: 60 m m 당 50-100 nematodes).
    13. 그들은 너무 조밀한 경우에, M9 버퍼와 현 탁 액을 희석 하 고 원하는 밀도이 때까지 현미경 평가. 수확량은 너무 작은 경우에, 정착 또는 액체를 제거 하려면 800 x g 에서 서 스 펜 션 10 s 원심 벌레를 하자.
      참고: 충분 한 밀도의 예 (거시적인) 그림 1A 및 1B (현미경) 20 X 확대에에서 주어진 다. 경험적으로 설명 된 대로 진행 합니다.
    14. 벌레는 신속 하 게 정착 하는 유의 하십시오. 판 사이 동등 하 게 분배 되도록 튜브 번호판 (번호판 4-5)의 모든 스택 후 반전.
      참고: 컷 뿐 아니라 부드러운 스윙 팁, 플라스틱 및 전단 응력을 감소, 플레이트의 세척.

2. 전송의 대용량의 꼬마 선 충

  1. M9 버퍼, 나이 및 플레이트의 건조에 따라의 약 500 µ L와 선 충을 씻어. 동일한 버퍼를 사용 하 여 선 충을 분리 하는 동물의 대부분은에 수집 될 때까지 반복 합니다.
  2. 천천히 잘라 피 펫 팁 nematodes을 차지 하 고 OP50와 함께 준비 된 접시에 그들을 전송. 접시 건조 하자.
    참고: 수 권장된 볼륨 보다는 훨씬 더 적용 하지 않도록 주의 하십시오. 특히 장기 실험 판 그것을 용납 하지 않을 수 있습니다 고 균열에 크롤 링 하는 선 충 수는 agar 끊을 수 있다.

3. 수확 한 대형의 꼬마 선 충 샘플

  1. 선택한 방법에 따라 C. 선 충의 충분 한 양의 실험을 시작 합니다. LC-MS/MS 분석에 대 한 샘플 당 단백질의 적어도 200 µ g의 수익률을 보장 하기 위해 접시 당 약 100 nematodes 그룹 당 20 접시 (60 m m x 15 m m)를 준비 합니다.
    참고: 프로토콜의이 부분은 요구 하지 않습니다 작업 무 균 조건 하에서 더 이상, 선 충을 수집 하 고 고정 됩니다.
  2. 샘플 컬렉션의 날, 스냅-동결 수집한 샘플을 액체 질소를 준비 합니다. 선 충 류의 신진 대사를 느리게 얼음에 비 살 균 M9 버퍼를 유지 합니다.
  3. M9 버퍼의 1 mL를 적용 하 고 부드럽게 판 소용돌이 격판덮개에서 C. 선 충 을 씻어. 이 고 인된 선 충 및 대부분의 계란을 수집 하는 경우 어떤 존재, 그들은 박테리아와 agar에 충실 하기 때문에 피 한다.
  4. 볼륨을 고 15 mL 튜브에 그것을 전송.
  5. 전체 샘플 수집 후 정착 또는 800 x g 에서 짧게 튜브 원심 M9 버퍼의 대부분을 제거 하는 선 충에 대 한 기다립니다. 워시 샘플 3 m 9의 약 10 mL x (샘플 볼륨 x 10) 모든 박테리아를 제거 하.
    참고: 모든 고 인된 선 충 제거는 되도록 자당 부양 다른 옵션입니다. 그러나, 이것은 표시 된 실험15적합 이었다. 자당은 포도 당 및과 당을 분해. 묘사 실험에서 포도의 역할 만성 당뇨병에 생 화 확 적인 변화를 촉진에 평가 했다. 따라서, 자당 부양 잠재적으로 결과 혼동 수 있습니다.
  6. 모든 샘플에 대 한 M9 버퍼의 1 mL와 함께 한 1.5 mL 튜브와 하나의 빈 1.5 mL 튜브를 준비 합니다. 15 mL 튜브에서 빈 1.5 mL 튜브 유리 피펫으로와 펠 릿을 전송. 이 단계는 양적 전송을 보장 하기 위해 중요 한.
    참고: 달리 이전 단계, 여기는 선 충은 더 집중. 플라스틱 피펫으로 팁을 가능한 준수 때문에 샘플의 큰 부분의 손실 예상 된다. 따라서 유리 펫 대신 사용 합니다.
  7. 송금 후 유리 피 펫을 사용 하 여 두 번째 1.5 mL 튜브에서 M9 버퍼의 1 mL를 피펫으로 벽에서 선 충을 씻어 하 려. 또한, 15 mL 튜브에서 나머지 nematodes을 세척 하 고 샘플 튜브를 그들을 전송.
  8. 1 분 동안 19000 x g 에서 샘플 튜브를 원심 하 고 가능한 많은 상쾌한 제거.
  9. 튜브 Parafilm으로 밀봉 하 고 즉시 스냅-동결 그것은 액체 질소. Lysate 준비까지-80 ° C에서 튜브를 저장 합니다.

4. 단백질 질량 분석에 대 한 절연

참고: 여기에 설명 된 단백질 격리 또한 다른 분석 실험 (예를 들면, 서쪽 오 점)에 대 한 사용할 수 있습니다.

  1. 냉동된 샘플에 0.5 m m 지르코늄 구슬과 lysate 버퍼를 포함 하는 성분을 억제 물 칵테일의 볼륨 x 적어도 2의 동일한 볼륨을 추가 합니다.
    참고: 선 충-단백질에 대 한 상관 관계를 묘사 분석 버퍼의 100 µ L를 사용 하 여 수행 했다. LC-MS/MS 샘플 버퍼의 200 µ L로 lysed 했다.
  2. 속도 9에 1 분 동안 균질 화기를 시작 합니다. 샘플은 완전히 lysed 확인 합니다. 완전히 lysed 하지 경우이 단계를 반복 합니다.
  3. 19000 x g에서 4 ° C에서 30 분 동안 샘플 원심 얼음에는 상쾌한 새로운 튜브를 전송 고 추가 측정 이동 하려고 때까지-80 ° C에서 그것을 저장 합니다.
    참고: 묘사 실험을 위해 사용 하는 비 변성 시키기 버퍼 다음 물질의 구성: 20 mM Tris HCl (pH 8), 137 mM NaCl, 1% 트라이 톤-X와 2 mM EDTA.
    참고:이 프로토콜을 제안된 규모를 적용 하는 데의 단계를 따라는 데, 약 1, 000 선 충에서 단백질 펠 릿의 수익률 약 500 µ g 이어야 한다. 더 많은 비교, 그림 2 및 대표 결과참조 하십시오.

5. 샘플 준비 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 측정

참고: 관심의 매개 변수에 따라 샘플 준비 달라질 것 이다. 이 프로토콜은 methylglyoxal 및 나이 결정에 초점을 맞추고.

  1. 앞에서 설명한9로 1, 2-diaminobenzene (DB)와 derivatization에 의해 세포내 methylglyoxal를 측정 합니다.
    1. 얼음 처럼 차가운 20% (wt/vol) trichloroacetic 산 염화 나트륨 0.9% (wt/집)에서 20 µ L와 1.5 mL 튜브에 물 80 µ L 샘플 균질
    2. 내부 표준 5 µ L의 샘플을 스파이크 (13C3MG, 400 nM), vortexing에 의해 그들을 혼합 하 고 다음 4 ° c.에서 5 분에 대 한 21000 x g 에서 원심
    3. HPLC 샘플 유리병 200 µ L 유리 삽입을 포함 하는 상쾌한의 35 µ L를 전송 합니다.
    4. 각 샘플 뒤에 0.5 m m 200 m m HCl 포함 된 0.5 m m diethylenetriaminepentaacetic (DETAPAC) 물에 있는 산에서에서 DB의 10 µ L를 3% 나트륨 아 지 드 (wt/vol)의 5 µ L를 추가 합니다.
    5. 빛 으로부터 보호, 실내 온도에 4 h에 대 한 샘플을 품 어.
    6. 앞에서 설명한9LC-MS/MS에 의해 샘플을 분석 합니다.
      참고: 나가의 측정을 위해 분리 단백질 프로토콜의 섹션 4에에서 설명 된 대로.
  2. Bradford 분석 결과10를 사용 하 여 (해 동된) lysates의 단백질 농도 측정 합니다.
    1. 30 µ L의 aliquots 표준 곡선 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 다음과 같은 농도의 인산 염 버퍼 염 (PBS)에서 해결 된 아군에 대 한 준비: 0; 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.6. 0.8; 그리고 1.0 mg/dL입니다.
      참고: 샘플은 제안 된 크기에서 준비 하는 경우 (버퍼의 200 µ L lysate의 준비에 대 한 단계 4.1 참조), 예상된 농도 약 2-7 mg/mL의 범위에 있어야 한다. 이 경우에 샘플 1: 10와 함께 PBS는 측정 전에 희석.
      참고:이 메서드를 사용 하 여 첫 번째 실험에 대 한 것이 좋습니다 다른 희석에 샘플을 측정 (1, 1:10, 그리고 1: 100). 선 충의 수의 아무 정확한 결심으로 수익률은 개별 연구자 사이 달라질 수 있습니다.
    2. 투명 한 96 잘 접시 (폴리스 티 렌)를 사용 하 고 각 표준 농도 우물에 중복에 선택한 희석에 샘플 10 µ L 플라스틱.
    3. 단백질 분석 결과 염료 시 약 집중 1:5 (aq증류수로 희석. dest.) 그리고 접시에 모든 샘플을 희석의 200 µ L를 추가. 실 온에서 10 분 동안 접시를 품 어.
    4. 595에서 30 분 이내 흡 광도 측정 플레이트 리더 nm. 예제 계산 된 표준 곡선에서 보간됩니다 될 수 있습니다. 방법의 자세한 내용은 문학10에 광범위 하 게 설명 했습니다.
  3. 앞에서 설명한11,12세포내 연령대를 측정 합니다.
    1. 총 단백질 추출 물 (약 200 µ g)을 씻어 10 kDa 원심 필터 단위에 ultracentrifugation에 의해 물으로 3 배.
    2. 복구 된 단백질 (약 100 µ L) 100 mM HCl의 10 µ L, 10 µ L의 펩 신 (2 mg/mL 20 m m HCl에에서), 그리고 티 (20 m m HCl 2 mg/mL)의 10 µ L을 추가 하 고 24 h에 대 한 37 ° C에서 샘플을 품 어.
    3. 중화 하 고 pH 7.4에 0.5 M 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.4)의 12.5 µ L을 추가 하 여 버퍼링 하는 샘플 및 5 µ L 260 m m 코의.
    4. 나 전자 [2 mg/mL 10 mM 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.4)]의 10 µ L을 추가 및 페니실린 스 솔루션의 10 µ L 24 h에 대 한 37 ° C에서 샘플을 품 어 고.
    5. Aminopeptidase [2 mg/mL 10 mM 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.4)]의 10 µ L을 추가 및 10 µ L의 prolidase [2 mg/mL 10 mM 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.4)에], 및 48 h 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어.
    6. 앞에서 설명한12LC-MS/MS에 의해 결과 분석.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기 대규모 C. 선 충 을 만드는 예제 문화 대 당뇨병 연구에 응용 되 게 됩니다. 그것은 관심 총 단백질 농도를 정상화 하기 보다 단일 동물 매개 변수 관련 된 될 수 있습니다. 선 충 수가 적은 요구 분석 결과에이 수행할 수 있습니다 쉽게 선 충을 계산 하 여. 대규모 C. 선 충 에 대 한 문화 관련 된 수백 개의 실험적인 그룹 당 선 충,이 방식은 편리. 그림 2, C. 선 충 의 양과 단백질 콘텐츠 사이 상관 관계가 표시 됩니다. 여기 바와 같이 재현 양적 단백질 격리가이 프로토콜을 사용 하 여 얻을 수 있습니다.

그들 fructosyl lysine adduct 동안 여러 시대 선구자 중 하나는 실험 동물에 있는 당뇨병 모델

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜 양적 결과 얻기 위해 C. 선 충 의 대규모 경작에 대 한 신뢰할 수 있는 방법을 제공 합니다. 문학에서 발견 대표 결과같이 복제 될 수 있습니다. C. 선 충 의 대규모 샘플의 컬렉션에 대 한이 정서의 똑 바른 앞으로 방법 같이 보인다, 비록 특정 함정을 계정에 걸릴 있다. 선 충 인구의 동기화에 대해이 프로토콜 선 충을 파괴 하 고 전적으로 계란을 수확 하는 염소와 수산화 나트륨 인구가 표백 여 접근을 설명 합니다. 그것은 고려이 접근은 모든 실험에 대 한 적합 하지 않을 수도 있다. 표백 솔루션의 볼륨에 인구 크기의 비율에 따라 표백 솔루션의 손상 효과15태아 개발에 영향을. 발달 과정을 공부 하는 경우에 특히 중요 한 단계 수 있습니다. 선 충의 처리에 관한 프로토콜에 걸쳐 가능한 작은 전단 세력으로 적용할 결정적 이다. 신중 하 게 처리 하지, 선 충의 많은 멸망 합니다. 그 문제에 대 한 회전 시간과 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 도이치 가운데 (DFG) IRTG 1874 "당뇨병 microvascular 합병증" 내에서 CRC 1118 "후반 당뇨 합병증에 대 한 원인으로 반응성 대사 산물"에 의해 지원 되었다. C. 선 충 종자 N2 및 CL2166 CGC, 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 NIH 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
E. coli OP50CGCn/a
C. elegans N2CGCn/a
C. elegans CL2166CGCn/a
페트리 접시, 60 mm x 15 mmGreiner One628161
부피 피펫, glas, 10 mLNeolabE-0413
Proteinase 억제제 칵테일 정제Roche04693124001
Non-denaturing lysate buffer:
Tris-HCl, pH 8SigmaT3253
염화나트륨(NaCl)SigmaS7653
Triton X-100SigmaX-100
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)SigmaE5391
96웰 플레이트, 투명 바닥브랜드781611
인피니트 M200, 플레이트 리더테칸30017581
지르코늄 옥사이드 비드, 0.5mm넥스트 어드밴스ZROB05-RNA
총알 블렌더, 균질화기넥스트 어드밴스BBX24
펩신 돼지 위 점막SigmaP6887
ThymolSigmaT0501
Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus SigmaP6911
페니실린-스트렙토마이신 용액SigmaP43339
Prolidase from Porcine KidneySigmaP6675
Aminopeptidase from proteolyticaSigmaA8200
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter UnitMerckmilliporeUFC501096
플레이트 배양을 위한 기본 재료는 Reference 6에 설명되어 있습니다.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fronius, M., Clauss, W. G. Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you. Pflügers Archiv. 455 (5), 775-785 (2008).
  2. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html (2006).
  3. Altun, Z. F., Hall, D. H. Nervous system, general description. WormAtlas. , Available from: http://www.wormatlas.org/hermaphrodite/nervous/Neuroframeset.html (2011).
  4. Sohn, E. H., et al. Retinal neurodegeneration may precede microvascular changes characteristic of diabetic retinopathy in diabetes mellitus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (19), E2655-E2664 (2016).
  5. Chilelli, N. C., Burlina, S., Lapolla, A. AGEs, rather than hyperglycemia, are responsible for microvascular complications in diabetes: a "glycoxidation-centric" point of view. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases. 23 (10), 913-919 (2013).
  6. Schlotterer, A., et al. C. elegans as model for the study of high glucose- mediated life span reduction. Diabetes. 58 (11), 2450-2456 (2009).
  7. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152(2009).
  8. Leiers, B., et al. A stress-responsive glutathione S-transferase confers resistance to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 34 (11), 1405-1415 (2003).
  9. Rabbani, N., Thornalley, P. J. Measurement of methylglyoxal by stable isotopic dilution analysis LC-MS/MS with corroborative prediction in physiological samples. Nature Protocols. 9 (8), 1969-1979 (2014).
  10. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 7 (72), 248-254 (1976).
  11. Ahmed, N., Argirov, O. K., Minhas, H. S., Cordeiro, C. A., Thornalley, P. J. Assay of advanced glycation endproducts (AGEs): surveying AGEs by chromatographic assay with derivatization by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate and application to Nepsilon-carboxymethyl-lysine- and Nepsilon-(1-carboxyethyl)lysine-modified albumin. Biochemical Journal. 364 (Pt 1), 1-14 (2002).
  12. Thornalley, P. J., et al. Quantitative screening of advanced glycation endproducts in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry. Biochemical Journal. 375 (Pt 3), 581-592 (2003).
  13. Karachalias, N., Babaei-Jadidi, R., Ahmed, N., Thornalley, P. Accumulation of fructosyllysine and advanced glycation end products in the kidney, retina and peripheral nerve of streptozotocin-induced diabetic rats. Biochemical Society Transactions. 31, 1423-1425 (2003).
  14. Morcos, M., et al. Glyoxalase-1 prevents mitochondrial protein modification and enhances lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 7 (2), 260-269 (2008).
  15. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).
  16. Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. A. A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (105), e53083(2015).
  17. Takamiya, S., Mita, T. Large-scale purification of active liquid-cultured Caenorhabditis elegans using a modified Baermann apparatus. Parasitology International. 65 (5 Pt B), 580-583 (2016).
  18. Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic systems for high-throughput and high-content screening using the nematode Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 17 (22), 3736-3759 (2017).
  19. Zhu, G., Yin, F., Wang, L., Wei, W., Jiang, L., Qin, J. Modeling type 2 diabetes-like hyperglycemia in C. elegans on a microdevice. Integrative Biology. 8 (1), 30-38 (2016).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

C elegans

관련 논문