꼬마 선 충의 대규모 재배 플레이트 기반: 당뇨병에서 대사 변경의 연구에 대 한 샘플 준비

요약

이 프로토콜에서는 고체 미디어 꼬마 선 충 의 대규모 재배 하는 방법을 설명합니다. 액체 문화 하는 대신,이 프로토콜 플레이트 기반 재배 아래 다른 비늘의 매개 변수를 얻기 수 있습니다. 액체와 고체 미디어 문화 형태학 및 대사 차이 생략 하 여 결과의 comparability를 늘어납니다.

초록

한 천 배지에서 대규모 방식으로 꼬마 선 충 (C. 선 충)을 배양 시간이 많이 걸리는 및 어려운 수 있습니다. 이 프로토콜에는 서쪽 오 점, 질량 분석, 또는 추가 proteomics 분석으로 진행 하는 단백질의 격리에 대 한 동물의 많은 수를 간단 하 고 저렴 한 방법을 설명 합니다. 또한, immunostainings에 대 한 선 충 수의 증가 동일한 자란 조건 하에서 여러 분석을 통합 하 여 쉽게 구현할 수 있습니다. 또한, 여러 가지 실험 상황 판 사이의 전송을 촉진 된다. 플레이트 문화에서 일반적인 기술 백 금 철사를 사용 하 여 단일 C. 선 충 의 전송을 포함 하 고 채워진된 agar의 전송 청크 메스를 사용 하 여. 그러나, 선 충 숫자 증가 함께 이러한 기술을 지나치게 많은 시간이 소요 된다. 이 프로토콜의 선 충 C. 수많은 단계를 포함 하 여 벌레의 생리학에 샘플 준비의 영향을 최소화 하기 위해 대규모 문화를 설명 합니다. 및 전단 응력의 수명 및 C. 선 충, 따라서 안정적이 고 재현 가능한 결과 검색 하기 위해 중요 한 단계에 대 한 자세한 설명을 요구에서 대사 과정을 변경할 수 있습니다. C. 선 충 은 모델 유기 체 최대 1/3, 신경 세포의 구성 가능성을 전적으로 신경 변경 혈관 컨트롤의 독립적인 조사를 제공 따라서 혈관 부족. 최근, 당뇨병 성 망막 증의 초기 neurodegeneration 혈관 변경 전에 발견 되었다. 따라서, 선 충 C. 공부 하는 당뇨병 합병증의 일반적인 메커니즘에 대 한 특별 한 관심의 이다. 예를 들어의 증가 형성 고급 glycation 엔드 제품 (세) 그리고 반응성 산소 종 (선생님) 관찰 reproducibly C. 선 충에서 발견 되는. 프로토콜 처리 조사의 폭넓은 스펙트럼에 대 한 적절 한 크기의 샘플을 여기, 당뇨병 유발 생 화 확 적인 변경의 연구에 의해 exemplified 표시 됩니다. 일반적으로,이 프로토콜 유용할 수 있습니다 큰 C. 선 충 을 요구 하는 연구에 대 한 숫자와 어떤 액체 문화는 적합 하지 않습니다.

서론

서쪽 오 점 또는 질량 분석, 단백질 분석, 단백질의 밀리 그램을 해야합니다. 이 항복 C. 선 충, 달성 될 수 있다 액체 문화 또는 고체 미디어 전송 선 충에 세척 하 여는의 수백의 대규모 배양이 필요 합니다. 및 전단 응력 유도 상피 나트륨 채널 (ENaC), 나트륨, 잠재적으로 C. 선 충 의 수명을 변경 하 고 신진 대사 분석^{1에 영향을 미치는의 증가 된 통풍 관을 통해 삼 투 스트레스 증가 수의 표현} . 따라서, 플레이트-기반 접근 방식에 대 한이 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계 걸릴 계정에 실험적인 가변성에 영향을 미치는 스트레스의 감소. 액체 문화, 다른 한편으로, 선 충의 표현 형에 영향을 하 고 문화 및 nematodes²의 정확한 수의 컬렉션을 복잡 하 게. 또한, 반응 물질 미디어 구성 요소에 의해 변경 될 수 있습니다 그리고 선 충을 도달 하기 전에 하지 균등 하 게 배포할 수 있습니다. 액체 문화의 제한에 대해이 프로토콜 C. 선 충의 대규모 샘플을 경작 하는 양자 택일 접근을 제공 합니다.

C. 선 충 의 3 분 1의 모든 셀³

프로토콜

참고:이 프로토콜 5 개의 섹션으로 나누어져 있습니다. 섹션 1-3, C. 선 충 에 대규모 문화 주요 프로토콜 제공 됩니다. 섹션 4와 5 exemplified metabolites 당뇨병 대사 산물에서 발생의 평가 대 한 추가 프로토콜을 제공 합니다. 자세히 섹션 1 접시에는 일반적인 대규모 문화를 설명합니다. 섹션 2 섹션 3 대규모 샘플의 수확을 설명 하는 반면 C. 선 충, 대용량의 전송에 중점을 둡니다. 제 4 샘플에서 단백질 격리를 설명 하 고 섹션 5 후속 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 분석을 위해 견본 준비에 설명 합니다.

1. 대규모 문화 접시에

1. 일반적으로, 메 마른 후드 또는 오염 방지 하려면 화로 옆 작동 합니다.
2. 문화에 웜 젊은 성인 단계를 도달할 때까지 따라 다음 적응이 이전에 게시 프로토콜⁷ .
   1. 생활 OP50 대장균 박테리아를 사용 하 여 선 충을 먹이 400 µ M fluorodeoxyuridine agar (안 암 피 실린/FUdR) 실험에 대 한 준비.
   2. 동기 인구의 준비를 위해 unconcen....

결과

여기 대규모 C. 선 충 을 만드는 예제 문화 대 당뇨병 연구에 응용 되 게 됩니다. 그것은 관심 총 단백질 농도를 정상화 하기 보다 단일 동물 매개 변수 관련 된 될 수 있습니다. 선 충 수가 적은 요구 분석 결과에이 수행할 수 있습니다 쉽게 선 충을 계산 하 여. 대규모 C. 선 충 에 대 한 문화 관련 된 수백 개의 실험적인 그룹 당 선 충,이 방식은 편리. 그림 2, C. 선 충 의 양과 단백질 콘텐츠 사이 상관 관계가 표시 됩니다. 여기 바와 같이 재현 양적 단백질 격리가이 프로토콜을 사용 하 여 얻을 수 있습니다.

그들 fructosyl lysine adduct 동안 여러 시대 선구자 중 하나는 실험 동물에 있는 당뇨병 모델

토론

이 프로토콜 양적 결과 얻기 위해 C. 선 충 의 대규모 경작에 대 한 신뢰할 수 있는 방법을 제공 합니다. 문학에서 발견 대표 결과같이 복제 될 수 있습니다. C. 선 충 의 대규모 샘플의 컬렉션에 대 한이 정서의 똑 바른 앞으로 방법 같이 보인다, 비록 특정 함정을 계정에 걸릴 있다. 선 충 인구의 동기화에 대해이 프로토콜 선 충을 파괴 하 고 전적으로 계란을 수확 하는 염소와 수산화 나트륨 인구가 표백 여 접근을 설명 합니다. 그것은 고려이 접근은 모든 실험에 대 한 적합 하지 않을 수도 있다. 표백 솔루션의 볼륨에 인구 크기의 비율에 따라 표백 솔루션의 손상 효과¹⁵태아 개발에 영향을. 발달 과정을 공부 하는 경우에 특히 중요 한 단계 수 있습니다. 선 충의 처리에 관한 프로토콜에 걸쳐 가능한 작은 전단 세력으로 적용할 결정적 이다. 신중 하 게 처리 하지, 선 충의 많은 멸망 합니다. 그 문제에 대 한 회전 시간과 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
E. coli OP50	CGC	n/a
C. elegans N2	CGC	n/a
C. elegans CL2166	CGC	n/a
페트리 접시, 60 mm x 15 mm	Greiner One	628161
부피 피펫, glas, 10 mL	Neolab	E-0413
Proteinase 억제제 칵테일 정제	Roche	04693124001
Non-denaturing lysate buffer:
Tris-HCl, pH 8	Sigma	T3253
염화나트륨(NaCl)	Sigma	S7653
Triton X-100	Sigma	X-100
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)	Sigma	E5391
96웰 플레이트, 투명 바닥	브랜드	781611
인피니트 M200, 플레이트 리더	테칸	30017581
지르코늄 옥사이드 비드, 0.5mm	넥스트 어드밴스	ZROB05-RNA
총알 블렌더, 균질화기	넥스트 어드밴스	BBX24
펩신 돼지 위 점막	Sigma	P6887
Thymol	Sigma	T0501
Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus	Sigma	P6911
페니실린-스트렙토마이신 용액	Sigma	P43339
Prolidase from Porcine Kidney	Sigma	P6675
Aminopeptidase from proteolytica	Sigma	A8200
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merckmillipore	UFC501096
플레이트 배양을 위한 기본 재료는 Reference 6에 설명되어 있습니다.