마우스에 닫힌된 대 퇴 골절의 발생: 뼈 치유 연구 모델

요약

Murine 닫힌된 대 퇴 골절 모델 골절 치유를 공부 하는 강력한 플랫폼 이며 뼈 재생을 촉진 하는 새로운 치료 전략. 이 수술 프로토콜의 목표는 일방적인 폐쇄 대 퇴 골절 대 퇴 골을 안정화 하는 intramedullary 강철 막대를 사용 하 여 마우스에 생성.

초록

뼈 골절 환자, 그들의 삶의 질에 크게 영향을 미치는 이외에 엄청난 사회 경제적 부담 부과. 효율적인 뼈 치유를 촉진 하는 치료 전략-존재와 높은 수요에 있습니다. 골절 치유의 효과적이 고 재현 가능한 동물 모델 뼈 재생와 관련 된 복잡 한 생물 학적 과정을 이해 하는 것 필요 합니다. 골절 치유의 많은 동물 모델; 수 년에 걸쳐 생성 된 그러나, 골절 murine 모델 최근 뼈 치유 연구를 강력한 도구로 떠오르고 있다. 열리고 닫히는 모델의 다양 한 개발 되었습니다, 하지만 닫힌된 대 퇴 골절 모델 생리 적으로 관련 된 방식으로 신속 하 고 재현성 결과 생성 하기 위한 간단한 방법으로 밖으로 서. 이 수술 프로토콜의 목표는 쥐에 일방적인 폐쇄 대 퇴 골절을 생성 하는 intramedullary 강철 막대를 삽입 하 여 대 퇴 골의 골절 후 안정화를 촉진 것입니다. Intramedullary 막대를 사용 하 여 뼈 조직에 새로운 결함을 생산 또는 소프트 근처 손상 없이 일관 된 치료 결과 대 한 충분 한 안정화를 제공 못 또는 나사 장치 큰 축 및 회전 안정성을 제공, 조직입니다. 방사선 영상 굳은 살 형성, 뼈, 연합과 뼈 굳은 살의 개장 하는 다음의 진행을 모니터링 하는 데 사용 됩니다. 뼈 치료 결과 일반적으로 치유 뼈의 강도 연관 하 고 비틀림 테스트와 측정. 아직도, 골절 수리와 관련 된 초기 세포 및 분자 이벤트는 뼈 조직 재생 연구에 중요 한 이해. Intramedullary 고정 된 마우스에서 닫힌된 대 퇴 골절 모델 뼈 골절 치유를 연구 하 고 치유를 가속 치료 전략을 평가 하는 매력적인 플랫폼 역할을 합니다.

서론

골절 musculoskeletal 시스템에 발생 하는 가장 일반적인 부상 중 고 엄청난 사회경제적 부담, 매년 미국^{1에서 $25 십억을 능가 것으로 예상 되는 치료 비용을 포함 한 연관 2}. 비록 사고 없이 대부분 골절의 치료, 치유는 상당한 시간 및 생산성의 손실을 연결 됩니다. 모든 골절의 약 5-10% 지연 치유 또는 비-연합, 나이 또는 골다공증과 당뇨병 mellitus^3,,45같은 다른 기본적인 만성 건강 상태에 결과. 아니 FDA 승인 약리 치료 효율적인 뼈 치유를 촉진 하 고 복구 시간 단축을 현재 사용할 수 있습니다.

골절 치유와 관련 된 여러 종류의 세포 조정 복잡 하 고 매우 역동적인 과정 이다. 따라서, 뼈 재생와 관련 된 세포 및 분자 사건의 포괄적인 이해는이 과정을 촉진 하는 치료 대상의 식별에 중요 합니다. 으로 다른 인간의 질환과 매우 순종 하 고 재현할 수 동물 모델 설립은 뼈 치료의 연구에 중요 한. 양, 돼지 등 큰 동물 뼈 개장 속성 및 역학 인 간에 게 유사한 하지만 비싸다, 실질적인 치유 시간이 있고 쉽게 유전자 조작⁶의무가 없습니다. 다른 한편으로, 고양이 쥐, 작은 동물 모델, 처리, 유지 보수, 짧은 번 식 주기, 그리고 짧은 치료 시간⁷의 낮은 비용의 용이성을 포함 한 많은 장점을 제공 합니다. 또한, 마우스 게놈은 완전히 시퀀싱, 신속한 조작 및 유전 이체의 생성에 대 한 허용. 따라서, 마우스 인간의 질병, 부상, 공부 하 고⁸을 복구 하는 강력한 모델 시스템 이다. 인간에서는, 골다공증과 당뇨병 같은 comorbidities 지연 치유의 가능성을 증가. 기존 마우스 모델의 수가 있습니다 뼈 부상에 comorbidities 골다공증, 당뇨병 등의 효과 공부 하는 사용이 가능 하 고 치유. 골다공증으로 고통 받아 환자⁹치유는 골절의 나중 단계 동안 현저 하 게 감소 뼈 형성을 있다. Ovariectomized (OVX) 마우스 빠른 뼈 손실 및 폐 경 후 골다공증^10,11에서 관찰 된 저것과 유사한 치유 지연된 뼈 전시. 또한, 많은 마우스 모델 유형 I 및 유형 II 당뇨병 모방 낮은 뼈 질량 고기 및 장애인된 골절 치유 인간¹¹에서. 또한, 골절 murine 모델은 굳은 살에 발생 하는 복잡 한 생물 학적 과정을 공부 하는 다양 한 플랫폼으로 고 뼈 조직 재생을 촉진 하는 새로운 치료 전략.

뼈 구조와 물질 대사, 뼈 골절 남아 생쥐와 인간, 매우 비슷한 치유의 전반적인 과정에 차이도 불구 하 고 endochondral 및 intramembranous 나오고 뼈 뒤의 조합 참여. Endochondral 나오고 골절 간격, 그들은 비 대 하 고 부드러운 굳은 살을 생산 하는 연골을 형성할 chondrocytes로 차별화를 둘러싼 덜 기계적으로 안정 된 지역에 조상 세포의 채용을 포함 한다. 조상 세포의 두 번째 파도 굳은 살에 침투 하 고 성숙한 osteoblasts 새로운 뼈 매트릭스^12,13,,1415분 비로 차별화 합니다. Intramembranous 나오고, 동안 periosteal endosteal 표면에 창시자 직접 osteoblasts 은닉 매트릭스로 구분을 용이 하 게 골절 간격^{9,11,12의 브리지 ,13}. 함께, endochondral 및 intramembranous ossifications 결과 기계적 부하^{13,14 를 지원할 수 있는 강력한 보조 뼈 형성에 시간이 지남에 추가 개조 하드 굳은 살의 개발 15}. 건강 한 인간, 치유 과정이 마우스¹⁶35 일만에 비해 약 3 개월 걸립니다.

골절 치유는 일반적으로 연구 되었습니다 중 하나 열려 있거나 닫혀 외과 모델¹⁷를 사용 하 여. 비판적으로 크기의 결함의 생성 등의 수술 방법을 열기 또는 뼈를 완료, 부상 위치 및 鋭 골절에 의해 발생 하는 편차를 줄이기 위해 형상을 표준화. Osteotomies 종종 지연 치유 때문에 비-연합 뒤에 기본 장치를 공부 하는 우수한 모델 폐쇄 골절에 비해 제공 합니다. 또한, 엄격한 외부 고정은 재생 intramembranous 나오고에 주로 의존할 것 이다 의미 osteotomized 뼈를 안정화 하는 데 필요한. 오픈 수술 접근 잠금 손톱, 핀 클립, 그리고 잠금 플레이트와 같은 장치를 사용 하 여 골절된 다리;에 축과 회전 안정성을 제공 하 그러나, 이러한 장치는 비싼 고 크게 수술^18,19,,2021에 더 많은 시간을 필요로. 다른 한편으로, 닫힌된 모델 endochondral 치유를 자극 하기 충분 한 불안정성에 대 한 수 있도록 간단한 intramedullary 고정 장치, 안정 됩니다. 그 결과, 폐쇄 골절 모델 비 연합 조건을 쉽게 모방 하지 않습니다. 내부 고정 기법, intramedullary 핀, 손톱, 등 압축 나사는 그들은 저렴 한, 사용 하기 쉬운, 그리고 수술^21,,2223시간 최소화에 유리한 있습니다. 경우에 따라 intramedullary 핀은 골절 전에 삽입 하지만 angulation 또는 골절된 대 퇴 골, 가변 굳은 살의 크기에 기여 하 고 치유의 변위 이어질 수 intramedullary 핀의 굽 힘. 그들은 어떤 점에서 무게는 diaphysis에 삭제 됩니다 3-포인트 절곡 장치를 사용 하 여 생성 되는 골절 위치와 형상은 닫힌 모델, 표준화 하기 더 어렵습니다. 그러나, 적절 한 기법으로이 수술 방법은 신속 하 고 일관 된 결과 제공합니다. 또한, 폐쇄 골절 모델 높은 힘 영향 또는 기계적 스트레스²²에 의해 발생 하는 골절을 연구 하는 임상 관련 도구 역할을 합니다.

이 수술 프로토콜 안정 골절된 화관 쥐 및 쥐^22,,2425intramedullary 핀을 사용 하 여 앞에서 설명한 방법에서 적응 했다. 첫째, 작은 직경의 intramedullary 바늘 항목의 지점을 설립 intracondylar 노치를 통해 삽입 되 고는 guidewire은 중력 의존 3-포인트를 사용 하 여 대 퇴 midshaft에 가로 골절을 생성 하기 전에 도입 벤딩 장치입니다. 닫힌된 대 퇴 골절의 성공적인 세대에 따라 더 큰 직경의 intramedullary 로드 가이드 와이어 안정 골절된 대 퇴 골을 통해 통합 됩니다. 이 방법은 지연 치유의 골절 중 intramedullary 핀의 angulation 기인한 로드 후 골절의 배치 허용 부상된 대 퇴 골의 조정 및 최적화 된 안정화에 대 한 위험을 방지 합니다.

프로토콜

다음 절차는 인디애나 대학 학교의 약 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에서 승인 된 수행 되었다. NIH 지침에 의해 설명 된 대로 모든 생존 수술은 무 균 조건 하에서 수행 했다. 통증과 감염의 위험에 적절 한 진통제와 항생제 성공적인 결과를 관리 했다.

1. 마 취와 준비

1. 그리고 마우스 무게 복 (I.P.) 경로를 관리 하는 케 타 민 (100mg/kg) 및 xylazine (10 mg/kg)의 혼합 을 통해 와 anesthetize. 빈 감 금 소에 마우스를 놓고 완전히 진정 될 때까지 그것을 모니터링 합니다.
2. 마우스 발가락 핀치 반사를 사용 하 여 진정은 확인 하십시오. 밖으로 건조에서 그들을 보호 하기 위해 눈에 안과 연 고를 적용 됩니다.
3. 오른쪽 다리에서 모피를 제거 합니다. 요오드 기반 스크럽과 70% 에탄올과 외과 사이트 아래로 닦으십시오. 무릎의 센터에서 시작 하 고 바깥쪽 원형 청소를 만드는 수술 사이트 스크럽. 신선한 스크럽, 70% 에탄올으로 끝나는이 3 x를 반복 합니다.
4. 피하 즉시 수술 후 통증 관리에 대 한 buprenorphine 염 진통 (0.03 mg/kg)의 수술 전 복용량을 관리 합니다.
5. 메 마른 외과 패드 적용 생리대에 마우스를 놓습니다.

2. 수술 접근법

참고: 골절, 이전 무게와 드롭 높이 결정 되어야 합니다 경험적으로 특정 스트레인, 나이, 그리고 수술 전에 생쥐의 섹스에 대 한. 이 수술 C57BJ6 남성 쥐 나이의 10 주에 최적화 되어 있습니다.

1. 그것의 뒤에 마우스를 놓고 요원 다리의 무릎을 플렉스 합니다. 메스 블레이드를 사용 하 여 가운데 무릎 관절에 1.5 c m 절 개를 확인 합니다.
2. 옆으로 노출 대 퇴 골의 원심 끝에 집게를 사용 하 여 슬 개 골 치환. 골 수 운하 역행 방식에서 및 대 퇴 골의 근 위 끝의 길이 아래로 trochlear 홈의 센터에서 1.5-긴 25 게이지 스테인레스 스틸 피하 주사 바늘을 삽입 합니다. 핀의 적절 한 배치를 위해 x-레이 가져가 라.
   참고: 바늘 종료는 guidewire에 대 한 경로 만들 마우스의 등 쪽 쪽.
3. 한 4-긴 36 게이지 텅스텐 guidewire 바늘, 원심 대 퇴 골에서 허브를 통해 입력 하 고 마우스의 등 쪽 측에 경사를 종료의 샤프트를 통해 전달 합니다.
4. guidewire의 성공적인 배치에 따라 신중 하 게 장소에 나가서는 guidewire를 들고 하는 동안 허브를 살짝 당겨 25 게이지 바늘을 제거 합니다. X-레이로 guidewire의 배치를 확인 합니다.
5. 위에 영향 디스크 (그림 1A) 34.6 c m의 높이에서 391 g 무게를 잡아. 대 퇴 골의 intertrochanteric 및 supracondylar 지역 지원 모 (그림 1B)에 휴식 하 고 다리의 측면 사이드 로드 포인트 (그림 1C 직면 하 고 그런 위치는 대 퇴 골 두에 걸쳐 가로로 포인트 지원 ). 무게를 삭제 하 고 조심 스럽게 골절 직후 장치에서 마우스를 제거.
6. X-레이로 골절 위치를 확인 합니다.
7. 안정 골절된 대 퇴 골 guidewire 통해 24 게이지 스테인레스 스틸 피하 튜브를 삽입 합니다.
   참고:이 응용 프로그램 항목의 포인트는 작은 직경의 바늘을 사용 하 여 생성 되었습니다 강제로 필요할 수 있습니다. 직경에서이 차이 효과적으로 대 퇴 골의 근 위 끝 통해 24 게이지 막대의 잠재적인 마이그레이션을 방지합니다. 삽입의 깊이 무딘 튜브 충족 큰 trochanter의 외피 뼈로 직접 느낄 수 있습니다.
8. 강철 막대의 위치와 x-레이로 골절된 대 퇴 골의 안정화는 guidewire를 제거 하기 전에 확인 합니다.
9. 철사 절단기를 사용 하 여 대 퇴 골의 원심 끝에 초과 튜브를 잘라. 집게를 사용 하 여 무릎 관절 탈 구 주의 부드러운 하향 힘 condyles의 표면 아래에 노출된 튜브를 묻어.
10. 슬 개 골 집게를 사용 하 여 위치를 변경할. 5-0 흡수 봉합 절 개 사이트를 닫습니다.

3. 수술 후 관리

1. 수술, 다음 쥐 수 주입의 멸 균 식 염 수를 통해 최대 500 µ L로 그들의 수술 후 복구에서 그들을 원조 하는 I.P. 경로.
2. 그들은 수술에서 각 성 때까지 온수 복구 침대에 동물을 모니터링 합니다. 일단 외래, 그들의 감 금 소에 그들을 반환 합니다.
3. 그들은 제대로 치유 하 고 이동성을 회복 하는 수술 후 몇 일 동안 생쥐를 밀접 하 게 모니터를 계속. 관리 buprenorphine 염 진통 (0.03 mg/kg) 피하 모든 6 h 3 일 수술, 그리고 필요한 이후. 그들은 뼈 수술 후 치유 손상 표시 되었습니다로 비 스테로이드 성 항 염증 약물 (Nsaid)의 사용을 하지 않습니다.

결과

수술의 성공적인 구현은 방사선 영상으로 모니터링 했다. 주요 단계는 intramedullary 바늘, 가이드 와이어의 배치, 대 퇴 midshaft 그리고 intramedullary 막대 (그림 2A나 - 2Aiv)와 적절 한 안정화에 가로 골절의 유도의 삽입을 포함합니다. 골절 굳은 살의 치료 진행 (그림 2B) 수술 후 28 일 최대 주간 방사선 이미지 모니터링 했다. 10 월 16 일 후 골절는 chondrocytes 비 수술 하 고 눈에 띄는 부드러운 굳은 살을 형성 하기 위하여 광물 화 된 연골을 생산.

뼈 골절 치유 공부를 할 때 endochondral와 intramembranous os...

토론

이 수술의 목표는 쥐에 표준화 된 닫힌된 대 퇴 골절을 생성. 이 모델의 주요 장점은 내부 고정 함으로써 피하는 angulation intramedullary 막대의 골절의 발생 후 일어난입니다. 아마도이 프로토콜의 가장 중요 한 측면으로 골절 기하학 적용된 벤딩 힘 및 뒷 다리의 위치에 따라 달라 집니다 대 퇴 midshaft에서 표준화 된 가로 골절의 세대입니다. 벤딩 순간 동안 대 퇴 골의 잘못 된 위치 경사 또는 鋭 골절 될 수 있습니다. 그들은 나이, 성별, 그리고 쥐의 긴장에 무게와 드롭 높이 경험적으로 미리 결정 되어야 합니다. 적용 된 힘은 자료 삭제 무게²⁴대신 3-포인트 절곡 장치 장착 테스트 기계를 사용 하 여 추가 제어 수 있습니다. 그러나, 높은-영향 또는 압박 하 관련 된 상해의 임상 관련 모델입니다 손실 된 무게와 골절을 생성.

또한, 합병증 수술 동안 개발할 수 있습니다. guidewire intramedul...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Oster Minimax Trimmer	Animal World Network	78049-100
POVIDONE-IODINE	Thermo Fisher Scientific 395516
OPHTHALMIC OINTMENT	Thermo Fisher Scientific	NC0490117
Styker T/Pump 온수 순환기	Kent Scientific Corporation	TP-700
1ml Sub-Q 주사기	Thermo Fisher Scientific
ENCORE Sensi-Touch PF	Moore Medical LLC	30347	라텍스, 파우더-프리 수술용 장갑
PrecisionGlide 25G 피하 주사 바늘	Thermo Fisher Scientific	14-826-49
초고온 텅스텐 와이어,	McMaster-Carr	3775K37	0.005" 직경, 1/16 lb. 스풀, 380' 길이
304 스테인리스 스틸, 24G 얇은 벽 튜빙	Microgroup Inc	304h24tw-5ft
#15 메스 블레이드	파인 사이	10015-00
#10 메스 블레이드	파인 사이언스 도구	10010-00
좁은 패턴 펜치	파인 사이언스 도구	11002-12	톱니/스트레이트/12cm
아이리스 펜치	파인 사이언스 도구	11066-07	1x2 이빨/스트레이트/7cm
해부기 가위	파인 사이언스 도구	14081-09	슬림 블레이드/옆면으로 각진/날카롭게/10cm
파인	사이언스 도구	14058-11	ToughCut/Straight/Sharp-Sharp/11.5cm
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