하위 형식 관련 광학 활동 전위 녹음 인간의 유도 만능 줄기 세포 유래 심 실 Cardiomyocytes

요약

여기 우리는 특히 심 실 같은 유도 만능 줄기 세포 유래 cardiomyocytes에에서 광학 이미지 활동 전위, 하는 방법을 제시. 메서드를 사용 하면 전압에 민감한 형광 단백질의 발기인 기반 식을 기반으로 합니다.

초록

Cardiomyocytes 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC-CMs)에서 생성 된 심혈 관 연구에 새로운 도구입니다. 셀의 균질 성 인구 되 고, 보다는 오히려 현재 분화 프로토콜에 의해 생성 된 iPSC CMs 대표 심 실 세포의 혼합-, 심 방-, 및 phenotypic 분석을 복잡 하 게 꾸벅꾸벅 졸 기 같은 고기. 여기, 특히 심 실 같은 iPSC-CMs에서에서 광학 기록 활동 전위 하는 방법을 제시 합니다. 이는 유전자 인코딩 전압 표시기가 심 실 특정 발기인 요소의 제어 구조와 lentiviral 변환에 의해 달성 된다. IPSC-CMs는이 구문으로 불리고 때 하위 특정 광 막 잠재적인 녹음 시간 경과 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 사용 전압 센서 심 실 같은 셀에 독점적으로 표현 된다.

서론

유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)에서 파생 된 Cardiomyocytes (CMs)는 불리 한 심장 약물 효과^{1,2 에 대 한 분자 메커니즘의 심장 질환, 비 발한 요법을 조사 하 고 화면을 해 부하는 신흥 도구 3}. 바로 처음부터, channelopathies 같은 arrhythmogenic 질병이 연구⁴의 중요 한 초점 되었습니다. 따라서, 부정맥 또는 활동 전위 (AP) 형태학 변화 같은 CMs의 전기 고기를 조사 하는 방법이이 기술의 마음에 있습니다.

IPSC CMs의 응용 프로그램에서 중요 한 고려 사항이입니다 셀의 균질 성 인구 현재 심장 차별화 프로토콜 발생 하지 않습니다. 대신, 그들은 오히려 셀 닮은 공동 노드, 심 방, 심 실 CMs 성숙^5,6,,78의 서로 다른 수준에서의 혼합물. 이 관....

프로토콜

1. 이미징 iPSC 파생 Cardiomyocytes의 준비

참고: iPSC 문화와 심장 차별화 방법^12,,1314 전에 게시 된 고 여기 자세하게에서 논의 하지 않습니다. 수동 서, 자석 세포 별거, 또는 젖 산 선택 iPSC-CMs의 정화 것이 좋습니다, 분화 프로토콜 사용에 따라. 다음 프로토콜에 대 한 지역, 생성 된 구타에서 microdissected explants 단층 차별화 프로토콜¹³를 사용 하 여, 심장 감 별 법의 15 날에 촬영 되었고 설명한 fibronectin 코팅 판에 30 날까지 교양 ¹⁰전에.

1. 받아 셀 인큐베이터에서 배양 배지 및 수동으로 microcentrifuge 튜브 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 심장 explants를 수집 합니다. 침전, 후 세포 배양 표면에 뜨는 발음 하 고 부드럽게 행 크와 2 x의 균형 explants 소금 세척 솔루션 (HBSS).
2. IPSC CMs 콜라 유형 II를 추가 하 여 해리 (HBS....

결과

그림 4a에서 대표 단일 iPSC CM RFP (왼쪽)와 GFP (오른쪽) 채널에서 이미징 분석 하는 동안 그린 투자 수익을 표시 하얀 점선으로 그려져 있습니다. RFP 채널에서 신호 (그림 4b, 상단 패널) 각 활동 전위 동안 형광 강도 주기적 증가 보여줍니다. 소개에 설명 된 대로 이것은 잠재적인 막 (그림 1)에 있는 변화에 기인한 증가 무서 워. Concordantly, GFP 신호는 형광 강도 (그림 4b, 중간 패널)에서 정기적인 감소를 보여 줍니다. RFP/GFP 비율 (그림 4b, 하단 패널)는 APD₅₀ 및 APD₉₀ 측정 등 다운스트림 분석에 사용 .......

토론

여기 설명 하는 방법을 인간의 Ipsc에서 생성 하는 CMs의 특정 하위 (즉, 같은 심 실 세포)에서 Ap의 광학 기록 수 있습니다. 인간의 iPSC-CMs는 거 대 한 다양 한 생물학과 의료 문제를 해결 하기 위해 새로운 도구 이며 다른 CM 하위 형식에 차별화 실험적인 다양성의 중요 한 소스. 특정 발기인 요소를 사용 하 여는 GEVI의 식 CMs에 관심, 하위를 나타내는 있는 광학 이미지 다음에 구체적으로 달성 된다.

단일 iPSC-CMs에서 APs의 성공적인 인수 분리 후 reseeding 밀도에 따라 달라 집니다. 셀 너무 밀도가 다시 시드해야는, 그것은 고립 된 하나의 iPSC-CMs는 전기 syncytium에 속하지 않는 찾을 수 있습니다. 그러나, 너무 낮은 시드 밀도 부정적인 세포의 생존에 영향을. 따라서, 다른 시드 밀도의 체계적인 테스트 것이 좋습니다, 특히 높은 처리량 영상에 의존 하는 실험에 참여 하기 전에.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ß-메르캅토에탄올	Invitrogen	21985023
DMEM-F12 Medium	Invitrogen	21331046
FBS (Fetal Bovine Serum)	Invitrogen	16141079
MEM Non-Essential Amino Acids	Invitrogen	11140050
GlutaMax-I Supplement	Invitrogen	35050061	alternative L-Glutamine
페니실린-스트렙토마이신	인비트로겐	15140122
피브로넥틴 소 혈장	시그마-알드리치	F1141
콜라겐 분해 효소 유형 II	Worthington Biochem	LS004174
헥사 디메 트린 브로마이드 (폴리 브렌	Sigma-Aldrich	H9268	강화 렌 티바이러스 감염
3.5cm 유리 바닥 마이크로 접시	MatTek Corporation, Ashland, MA, USA	P35G-1.5-14-C
현미경 스탠드	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	DMI6000B
현미경 대물렌즈	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Oil
sCMOS camera	Andor Technology, Belfast, UK	Zyla V
현미경 필터 큐브: 여기 필터	Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA	ET480/40X	bandpass 480/40
microscope filter cube: dichroic mirror	Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA	T505lpxr	longpass 505 nm
이미지 스플리터	케언 리서치, 영국 파버샴	OptoSplit II
이미지 스플리터 필터 큐브: 이색성 거울	AHF Analysentechnik GmbH, Tü bigen, 독일	568LPXR	롱패스 568 nm
이미지 스플리터 필터 큐브: 방출 필터 1 (GFP 방출)	AHF Analysentechnik GmbH, Tü bigen, 독일	520/28 BrightLine HC	대역통과 520/28 nm
이미지 스플리터 필터 큐브: 방출 필터 2 (RFP 방출)	AHF Analysentechnik GmbH, Tü bigen, 독일	630/75 ET 대역 통과	대역 통과 630/75 nm
페이싱 삽입	Warner Instruments, Hamden, 코네티컷, 미국	RC-37FS