이 프로토콜 단백질 호모-oligomerization에서 체 외에 상업 조명 현미경 검사를 사용 하 여 형광 변동 분광학에 따라 측정을 위한 보정 없는 접근을 설명 합니다. 올바른 인수 설정 및 분석 방법을 표시 됩니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
생체 외에서 교정 무료 단백질 호모-oligomerization 상업 계측 및 무료, 오픈 소스 밝기 분석 소프트웨어를 사용 하 여의 정량화
이 논문에서
요약
초록
수와 밝기 감지 단백질 호모-oligomerization에 대 한 교정 무료 형광 변동 분광학 (FFS) 기술입니다. 그것은 전통적인 confocal 현미경 디지털 감지기 장비를 사용 하 여 사용할 수 있습니다. 생체 외에서 기술 사용에 대 한 프로토콜 번호와 밝기를 dimerizing 약 AP20187의 추가 전후 mVenus 표시 FKBP12F36V의 oligomeric 상태를 정확 하 게 계량을 볼 수 있는 사용 사례에 의해 표시 됩니다. 정확한 현미경 수집 매개 변수를 사용 하 여 올바른 데이터 전처리 및 분석 방법의 중요성을 설명 합니다. 특히, photobleaching의 선택의 중요성은 강조 했다. 이 저렴 한 방법은 많은 생물학 문맥에서 단백질 단백질 상호 작용 연구에 사용할 수 있습니다.
서론
단백질-단백질 상호 작용 나 n 체 외
전통적으로, 결정학 및 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryoEM)와 결합 하는 핵 자기 공명 실험은 정확 하 게 단백질의 3 차원 구조를 설명 하 고 그들의 기능을 추정 하는 것을 선택 하는 기술 그들의 높은 해상도 구조 세부 사항을 면밀히 그러나 단백질,, 정적 구조 하 시간과 공간에 다양 한 구조적 변화와 진동 받을 수 있습니다. 이 때문에 구조 결정학에서 정보 또는 CryoEM 데이터 (예: 분자 동역학 시뮬레이션 기술과 단일 분자) 다른 기술로 보완 될 필요가: 그 구조적 관련 단백질의 기능 변경 및 상호 작용, 그리고이 정보는 정적 구조에 존재. 내부 분자 역학 조사, 순서 기술 포스터 공명 에너지 전송 (smFRET) 단일 분자에 따라 매우 효과적인1있습니다. 이러한 방식을 복잡 한 매체에 있는 분자의 다른 부분 모집단을 평가할 수 있습니다. 이것은 매우 중요 하 고, 이러한 변경 신속 하 고 (즉, 두 번째 범위에 나노초) 데이터 수집 중에 발생.
두 가지 주요 방법을 감....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. FKBP12 F36V-mVenus 정화
- Monomerized 인간 FKBP12F36V12 및 N 맨끝 His6 태그와 mVenus 태그 (요청에 사용할 수 있는 벡터)를 포함 하는 pET22b 벡터와 (DE3) pLysS 셀을 변환 합니다. 파운드 천 50 µ g/mL 암 피 실린과 34 µ g/mL 페니와 보완에 플레이트 세포.
- 100 mL 파운드 스타터 문화로 변환 된 식민지를 전송 하 고 떨고와 37 ℃에서 16 ~ 20 시간에 대 한 성장.
- 고밀도 스타터 문화를 희석 (OD600 > 1) 1: 100 파운드 매체 (2 x 500 mL 배치)에 OD600를 2-3 시간 동안 성장 = 0.6-0.8 (37 ° C, 200 rpm).
- 얼음에 멋진 문화입니다. 250 µ M IPTG 유발 하 고 21 ° C, 200 rpm에서 16-20 시간에 대 한 성장.
- 20 분 동안 2000 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 수확.
- 아이맥 버퍼 (20 m m 인산 나트륨 pH 7.5, 500 m m NaCl, 이미 3 m m, 1mm β-mercaptoethanol) 보충 EDTA 무료 protease 억제제 (1 태블릿 셀 펠 릿 당) 40 mL....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
트렌딩 및 단위체 밝기
데이터 획득 되 면 하나의 솔루션에 관심사의 단백질의 oligomeric 상태를 확인 하려면 밝기 계산을 시작할 수 있습니다. 솔루션에서 표백의 효과 과감 한 되지 않을 수도 있습니다 경우에 그것으로 비보에있을 수 있습니다, 그리고 강도 추적 여전히 아마 없을 것 photophysical 효과 fluorophore,18 하지만이 뒤에 이유를 관련으로 인해 고정 된 의미 완전히 이해 되지 않는다. 이 영향; 밝기를 계산할 때 모노 머-이합체 전환 결정 하려고,이 측면은 중요 합니다. 자동 적용 하 여 알고리즘에 그림 2표시 된 데이터를 detrend, 강도 추적 제대로 해.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
N & B multimerization 상업적인 빛 디지털 검출기를 장착 하는 confocal 현미경 검사를 사용 하 여 감지 하는 기술입니다. 이 방법은 단일 지점 FCS, FCCS, 및 smFRET 교정 무료 이며 밝기 계산 하기 때문에 간단 하 고 농도 독립6에 비해 매우 매력적 이다. 그러나 그것은 중요 한 중요성의, 밝기 계산9;를 수행 하기 전에 표백 및 장기 강도 변동에 대 한 수정 표백에 따른 휘도 및 기타 아티팩트에의 약간의 증가 수 수 잘못 해석 oligomeric 상태에서 변화 (같이 그림 2는) 무시 트렌딩 또는 잘못 수행 하는 경우. 자동 사용 detrend 알고리즘 정확한 밝기 계산에 대 한 수 있습니다.
그것은, 이미지를 수집 하는 때 규칙의 수를 따르는 것이 중요입니다. 첫째, con.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품 Wellcome 신망에 의해 지원 되었습니다 105278/Z/14/2 치료에 부여 Wellcome 신뢰 센터 인간 유전학에 의해 Wellcome 신뢰 코어 수상 203852/Z/16/2 자금입니다. 작업 씨에 스 그룹에 암 연구 영국 (C20724/A14414), 그리고 유럽 연합의 지평선 2020 연구 및 혁신 프로그램 그랜트 647278 유럽 연구 위원회에 의해 지원 됩니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| RosettaTM (DE3) pLysS 세포 | Novagen | 70956-3 | |
| 암피실린 | 시그마 Aldrich | PubChem 물질 ID 329824407 | |
| 클로람페니콜 | 시그마 Aldrich | PubChem 물질 ID: 24892250 | |
| LB 스타터 배양 | QIAGEN | ||
| LB 매체 | QIAGEN | ||
| https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif IPTG | Sigma Aldrich | PubChem 물질 ID 329815691 | |
| IMAC 버퍼 | Medicago | 09-1010-10 | |
| EDTA-free 프로테아제 억제제 | 시그마 알드리치 | 11873580001 | |
| TALON 수지 | 클론테크 | ||
| 니켈 세파로스 | GE 헬스케어 | ||
| S200 16/60 열 | GE 헬스케어 | ||
| 유리 바닥 8웰 관찰 접시 | Ibidi | 80827 |
참고문헌
- Voith von Voithenberg, L., Lamb, D. C. Single pair forster resonance energy transfer: A versatile tool to investigate protein conformational dynamics. BioEssays. 40, (2018).
- Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
