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방법 논문

68가 표시 된 아르기닌 글리신 Aspartate (RGD) 준비-신생에 대 한 펩 티 드

6.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58218

⸱

2019년 1월 7일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Applied RI, Korea Institute of Radiological and Medical Sciences

이 논문에서

요약

Αvβ3 integrin 높은 신생 겪고 활성화 된 내 피 세포에 표현 되는 접착 단백질의 일종 이다. 따라서,는 integrin의 무결성을 평가 종양학에 큰 관심입니다. 여기, 68가 표시 된 radiopeptides를 준비 하는 방법 및 그것의 생물 학적 효과 평가 하는 방법을 소개 합니다.

초록

Αvβ3 integrin heterodimeric 접착 분자 종양 세포 마이그레이션 및 신생에 관여 이다. integrin 신생 종양 내 피 세포, 일반적으로 낮은 농도 그것이에 overexpressed입니다. 이 특정 표현의 αvβ3 항 혈관 신생 및 이미징 약에 대 한 유효한 biomarker 하기가. 기능 이미징 적임, 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 생화학 및 생리에 대 한 정보에서 변경 vivo에서, nanomolar 규모에 독특한 높은 감도 때문에 제공 합니다. 따라서, radiometal 기반 PET 방사성 의약품 종양 신생의 비-침략 적 정량화에 대 한 큰 관심을 받았습니다. 이 종이 신생의 평가 대 한 새로운 radiometal 표시 된 펩 티 드를 준비 하는 조직 프로토콜을 제공 합니다. 이 프로토콜은 방사선 화학 안정성, lipophilicity, 셀 통풍 관, 혈 청, 안정과 pharmacokinetic 속성에 대 한 정보가 있습니다. 68가-RGD-펩타이드 αvβ3 integrin 향해 대표 애완 동물 ligands 중 하나입니다. 여기, 우리는 68가 RGD 펩타이드와 생물 학적 효능 평가 준비 하는 프로토콜을 소개 합니다.

서론

신생은 새로운 혈관의 개발에 의해 특징 이다 생물학 과정. 많은 angiogenetic 요인 들 중 αvβ3 integrin 연관 된 침입는 integrin은 높은 신생 종양 혈관에 표현 되지만 결 석 때문에 정상 조직의1.

아르기닌 글리신 aspartate (RGD) 도메인, αvβ3 integrin 수용 체에 대 한 높은 선호도가지고, 이미징 에이전트2,3 유망 신생 여겨진다 방사선된 수용 체 바인딩 펩 티 드 , 4 , 5 , 6 , 7. 애완 동물을 위해 만들어진 여러 방사성 의약품 및 그것의 생물 학적 속성이 다양 한 동물 모델8,9,,1011에 검증 된. 방사성 핵 종에서 68가 다른 radioisotopes 비해 몇 가지 장점이 있다. 첫째, 그것은 사용자에 대 한 높은 접근성을가지고 하 고는 싸이 클 로트 론 필요 하기 때문에 경제적으로 유리 하다. 둘째, 68가 기반 방사성 의약품 생산 높은 공간 해상도 계산 하는 단일 광자 방출 단층 촬영 (SPECT), 더 정확한 정량화를 허용과 비교. 마지막으로, 68가 67.71 분 반감기는 작은 펩 티 드 또는 단백질의 준비에 대 한 충분 한 수 있습니다.

안정적인 단지 68가와 생산, 많은 chelators 개발 되었습니다. 대표 chelators는 diethylenetriaminepentaacetic, 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic 산 (NOTA), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic 산 (DOTA), 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecanetetraacetic 산 (TETA) 산 (DTPA), 및 N, N'-di(2-hydroxybenzyl) ethylenediamine-N, N'-diacetic 산 (HBED). NOTA 68가 (로그 안정성 일정 30.98)12,,1314와 매우 안정적인 복잡 한 형태로 보고 되었습니다.

현재 연구의 목적은 새로운 radiopeptide (그림 1)의 개발에 대 한 간단한 프로토콜을 제공 하는 것입니다. 예를 들어, 우리가 68RGD-펩타이드가 표시 된 및이 종이 식 모델에서 이러한 아날로그의 생물 학적 평가 대 한 현재 메서드를 준비합니다.

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프로토콜

모든 동물 실험 프로토콜 한국 방사능 연구소 및 의료 과학 동물 연구 위원회에 의해 승인에서 관심과 연구 동물의 사용에 대 한 지침에 따라 실시 했다. 모든 시 약 및 용 매 구입 되었고 더 정화 없이 사용. NOTA RGD 펩타이드 문학 방법15에 따라 준비 되었다.

주의: 68가 양전자와 감마선을 방출 한다. 방사성 물질과 직접 또는 간접 접촉을 포함 하 여 모든 실험 훈련 하 고 인사만을 허용에 의해 이루어져야 합니다. 방사성 물질을 처리 하는 경우 적절 한 보호 장비, 차폐, 방사선 dosimeter 배지 및 반지, 그리고 조사 미터를 사용 해야 합니다.

1. radiolabeling RGD 펩타이드 68GaCl3

참고: 68가 (t1/2 = 68 분, β+ = 89%, EC = 11%) 68조지아에서에서 얻은 /68Ge 발전기.

  1. 68GaCl3 4 mL와 발전기에서 0.05 M HCl의 elute
  2. 5 mL 반응 유리병에 68GaCl3 (333 kBq, 1 mL)을 건조 30 분 동안 80 ° C에 질소 가스 제거.
  3. RGD-펩타이드의 솔루션 추가 (100 µ g)에서 68GaCl3 단계 1.2에서에서 포함 된 반응 유리병에 1 M 나트륨 아세테이트 (100 µ L, pH 5-6).
  4. 5 분 동안 80 ° C에서 반응 혼합물이 열. 다음, 실내 온도 아래로 냉각 하십시오.
  5. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)와 원유 제품을 정화. 다음과 같은 시스템을 사용 하 여: C-18 열, 0.5 mL/min의 유량, 1.17%/min (5%-40%에서 30 분)의 차입 이기의 그라데이션 기울기: A = 0.1 %trifluoroacetic 산 (TFA) 이기, B = 0.1 %TFA 물에.
    참고:는 HPLC는 갖추고 포토 다이오드 배열 검출기와 방사능 검출기. 68가-RGD-펩타이드는 12.5 분 (그림 2)의 보존 기간에 수집 되었다.
  6. 조지아-RGD-펩타이드 고체 상 추출 시스템을 사용 하 여 결과 68정화.
    1. C18 역 상 카트리지를 통해 해결책을 통과 하 고 염 분의 2 mL로 씻어.
    2. 68가-RGD-펩타이드 95% 에탄올의 0.7 mL와 함께 elute 20 분에 대 한 질소 가스에서 80 ° C에서 용 매를 제거 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 사용 하기 전에 함께 다시 구성.
    3. 방사선된 제품 0.22 μ m 살 균 필터를 통해 필터링 하 고 메 마른 염 분 해결책의 1 mL에 공식화.
  7. 라디오 얇은 층 크로마토그래피 (TLC)에 의해 방사선 화학 수확량을 확인 합니다.
    1. 인스턴트 얇은 층 크로마토그래피 판 (ITLC, 길이 10 ㎝)에 1 µ L를 자리. 자리에서 9 cm까지 eluent (수성 0.1 M 구 연산 산 성, pH 5.0)을 포함 하는 상공에서 접시를 개발 합니다.
      참고: 68가 RGD 펩타이드에 대 한 보존 요소 0 이며 unreacted 68Ga3 + 에 대 한 고정 요소는 1.
  8. MBq/nmol로 비 방사능에 해당 하는 방사능의 비율에서 마지막 특정 활동을 계산 합니다.
    참고:는 공식화 68가-RGD-펩타이드 HPLC를 100 µ L의 주입 후 양의 비 방사성 구성 요소 nonradioactive가 RGD 펩타이드를 사용 하 여 표준 보정 곡선에서 계산 했다.

2. 체 외에서 세포 통풍 관

참고: 웁살라 87 악성 Glioma (U87MG) 인간의 세포종 세포 Dulbecco의 수정된 독수리의 미디어 (DMEM), 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린-스 보충에서 성장 했다. 셀 5% CO2의 습도 분위기에서 37 ° C에서 150 m m 요리에서 성장 했다. 셀 수확 또는 trypsinization 분할: 0.25% (w/v) trypsin 및 3-5 분 동안 37 ° C에서 PBS에 0.02% (w/v) ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA).

  1. 6 잘 플레이트 1 x 106 의 밀도 시드 U87MG 세포 세포/음.
  2. 68가 RGD 펩타이드와 셀을 품 어 (111 kBq) 30, 60, 90, 120 분 준비 샘플 3 중에서 37 ° C에서.
  3. 셀 2 워시 x 2 mL PBS의 trypsinization 여 수확. 사용 하 여 0.25% (w/v) trypsin 및 0.02% (w/v) ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) PBS에서 37 ° C에서 3-5 분.
  4. 세포 현 탁 액 (500 µ L)와 γ-카운터에서 측정값을 수집 합니다.
  5. % (셀/총 개수에 개수)는 세포에 의해 화합물의 백분율 이해를 계산 합니다.

3. 혈 청 안정성 생체 외에서

  1. 갓된 마우스 혈 청의 500 µ L, 500 µ L의 인간 혈 청, 그리고 PBS의 500 µ L를 추가 합니다. 2 시간 동안 37 ° C에 혼합물을 품 어.
  2. 지정 된 시간 간격에 의해 ITLC 평가 (30, 60, 90, 및 120 분). 1-2 µ L 약 수 ITLC 접시에 혼합물의 자리 (모바일 단계: 0.1 M 구 연산 산). 개발 단계 1.7에서 접시.
    참고: 68가3 + 예정 이다 용 매 전면 이동 반면 레이블이 화합물 근원에 남아 있을 것 이다.

4입니다. Lipophilicity 결정

  1. 68가-RGD-펩타이드 (3.7 MBq, 3.7 µ L) octanol-PBS 시스템 추가 (1:1, v/v, 총 1 mL).
  2. 실 온에서 5 분을 실 온에서 5 분 동안 10000 x g 에서 원심 분리기 적극적으로 튜브를 혼합.
  3. 각 계층에서 100 µ L 샘플을가지고 고 γ-카운터와 방사능 측정. 보고 된 log P 값은 3 샘플의 평균을 기반으로 합니다.

5. 종양 모델

참고: BALB/c 누드 마우스 (6-8 주 오래 된, 여성, n = 23)이이 연구를 위해 사용 되었다. 쥐 이후 애완 동물 연구를 위해 사용 되었다 (n = 3) 그리고 biodistribution (n = 20) 종양 볼륨에 200-300 m m3 (이식 후 1-2 주)를 도달 하는 때.

  1. 28 G, 1/2 인치 인슐린 주사기로 종양 세포를 로드 합니다.
  2. 왼쪽된 팔 지역으로 PBS의 100 µ L에서 U87MG 세포 (5 x 106)를 주사.
  3. 세포 주입 중 2 %isoflurane 산소 가스에서와 마우스를 anesthetize.
    1. 마우스는 페달 철수 반사 다음 곤란 오른쪽 뒷 다리의 발가락 사이의 집게와의 손실에 의해 anesthetized 되었습니다 확인 하십시오. 두지 마십시오 동물 무인 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지.

6. αvβ3 Integrin 사용 하 여 애완 동물의 비보에 정량화

  1. 산소의 2 %isoflurane 마우스 anesthetize
    1. 마우스는 페달 철수 반사 다음 곤란 오른쪽 뒷 다리의 발가락 사이의 집게와의 손실에 의해 anesthetized 되었습니다 확인 하십시오. 두지 마십시오 동물 무인 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지.
  2. 애완 동물 갠트리의 중앙에 머리를 놓습니다.
  3. 정 맥은 종이 식 마우스 모델을 통해 1 분 동안 꼬리 정 맥에 68가-RGD-펩타이드 솔루션 (7.4 MBq, 200 µ L)를 관리 합니다.
  4. 동시에 150 분 목록 모드 (동적 검사) 애완 동물 검사를 수행 합니다.
    참고: 원시 애완 동물 데이터는 사용자 정의 기간 (즉, 매 30 분)에 의해 재건 되었다. 애완 동물 검사, 마이크로 계산 된 단층 촬영 (CT) 스캔 후 (x 선, 0.16의 50 kVp mA) 감쇠 보정에 대 한 실시 했다.

7. 전 비보 Biodistribution

  1. 68가-RGD-펩타이드 (0.37 MBq, 200 µ L)이 종이 식 마우스 모델의 꼬리 정 맥에 주사. 주사 기간 동안 2 %isoflurane 산소 가스에서와 마우스를 anesthetize.
    참고: BALB/c 누드 마우스 섹션 5에에서 설명 된 대로 4 개의 그룹으로 나누어 되었고 다른 시간 지점에서 희생 (n = 그룹 당 5).
  2. 68가-RGD-펩타이드의 직후 쥐 그리고 30, 60, 90, 및 이산화탄소 안락사와 120 분 postinjection에 그들을 희생.
    참고: 관심의 조직 추출 되었다. 선택된 대상 했다 혈액, 근육, 심장, 폐, 간, 비장, 위장, 소장, 신장, 뼈, 및 종양.
  3. 조직 무게 고 γ-카운터와 방사능을 측정 한다.
    참고: 결과 조직 (%ID / g)의 그램 당 주입된 비율 복용량으로 표현 되었다.

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결과

NOTA RGD 펩타이드와 68GaCl3 의 chelation 간단 했다 그리고 radiolabeling 수율 99% 이었다. 그림 2와 같이 반응 불순물 제거 성공적으로 되었습니다. 68가-RGD-펩타이드의 방사선 화학 순수성 보다 큰 99% 이었고, 종합의 끝에 특정 활동은 90-130 MBq/nmol (그림 3).

셀 통풍 관 68가 RGD 펩타이드에 대 한 값 되었고 1.49%, 0.85%, 0.36%, 0.39 0, 60, 90, 120 분, 각각. 혈 청 안정성 그 68가-RGD-펩타이드 외피와 PBS (> 92% 안정성에서 2 h) 뿐만 아니라...

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토론

현재에 연구, 우리 radiopeptide integrin αvβ3 및 그것의 생물 학적 평가 대상으로 준비 하는 프로토콜을 도입. 전통적인 신약 개발 복잡 한 절차를 포함 한다. 참고 자료 및 비교적 긴 평가 시간에 많은 양의 필요합니다. 제안 된 방법론은 섬세 한 평가 과정을 대체할 수 없습니다, 하지만이 시스템 심사 목적으로 사용할 수 있습니다. 이 시스템 시간 및 비용을 상당히 줄일 것 이라고 제안 했다.

지난 10 년간 많은 방사선된 RGD-펩타이드는 종양16이미징을 위한 radiotracers로 광범위 하 게 연구 되었습니다. 임상 시험 유망 방사성 의약품을 얻기 위해 약물 개발에 대 한 체계적 접근을 제공 한다. 방사선 화학 타당성, 높은 선택도 선호도 대상, 신진 대사, 안정과 적절 한 약물 동력 학 4 개의 주요 우려가 있습니다. 일상적인 애완 동물 연구에 대 한 합리적인 방사선 화...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 핵 연구 및 개발 프로그램 (No. 2017M2A2A6A02019904) 한국 정부에 의해 투자 하는 한국 국립 연구 재단 (NRF) 부여의 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
68Ga/68Ge 발전기ITGCompany-10mCi 
염화수소 용액: Sigma-aldrich84429
아세트산 나트륨Sigma-aldrichS2889
C18 역상 카트리지, WatersWAT020515
0.22-μ m 멸균 필터MillliporeSLGV033RS
Radio-TLC 스캐너BioscanAR2000
ITLC 종이AgilentSGI001
구연산Sigma-aldrich251275
HPLCWaters-Waters1525 시스템 바이너리 펌프, 포토 다이오드 어레이 (Waters 2998), 방사능 검출기 (Raytest, Gabi)
AcetonitrileJ.T. Baker14-650-359
Trifluoroacetic acidSigma-aldrich302031
Dulbecco의 변형된 Eagle media Thermo fisher scientific11965092
소 태아 혈청Thermo fisher scientific16000044
T175 플라스크 코닝CLS431080
트립신 EDTA (0.25%)써모 피셔 사이언티픽25200072
페니실린 스트렙토 마이신써모 피셔 사이언티픽15240112
γ - 카운터퍼킨 엘머-1480 마법사 3
인선린 주사기Becton 디킨슨326105
Synringe 펌프하버드 장치70-4500
micro-PET/CTSiemens Inveon-
, ,

참고문헌

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  13. Clarke, E. T., Martell, A. E. Stabilities of the Fe(III), Ga(III) and In(III) chelates of N,N′,N″-triazacyclononanetriacetic acid. Inorganica Chimica Acta. 181 (2), 273-280 (1991).
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  15. Shin, U. C., et al. Synthesis and Preliminary Evaluation of 68Ga-NOTA-Biphenyl-c(RGDyK) for the Quantification of Integrin αvβ3. Bulletin of the Korean Chemical Society. 38 (12), 1415-1418 (2017).
  16. Cai, W., Chen, X. Multimodality Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis. Journal of Nuclear Medicine. 49, suppl2 113-128 (2008).

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