P19 배아 암종을 이용한 신경 발생

요약

P19 마우스 배아 암세포주(P19 세포주)는 생체내 분석에 비해 매우 단순화된 신경발생의 분자 기전을 연구하는데 널리 사용된다. 여기서, 우리는 P19 세포주에서 레티노산 유도 신경발생에 대한 프로토콜을 제시한다.

초록

마우스 배아 유래 기형암유래 P19 세포주들은 3개의 세균 층으로 분화하는 능력을 가지고 있다. 레티노산(RA)의 존재에서, 현탁액 배양된 P19 세포주들은 뉴런으로 분화하도록 유도된다. 이 현상은 시험관에서 신경 발생 모델로 광범위하게 조사된다. 따라서, P19 세포주신경발생과 관련된 분자 및 세포 연구에 매우 유용하다. 그러나, 문헌에 기재된 P19 세포주신경 분화를 위한 프로토콜은 매우 복잡하다. 이 연구에서 개발 된 방법은 간단 하 고 신경 발달 이상 및 신경 퇴행 성 질환에 분자 메커니즘을 해명에 역할을 할 것 이다.

서론

배아 발달 도중, 단 하나 세포 층은 3개의 개별적인 세균 층 1,^2,3로변환됩니다. 생체 내에서 발생하는 현상의 연구 가능성을 높이기 위해 3차원 응집체(배아 체)의 생성이 편리한 모델로 개발되었습니다. 이러한 방식으로 형성된 세포 응집체는 배아^4,5의발달을 반영하는 세포 분화를 유발하는 다양한 조건에 노출될 수 있다. P19 뮤린 배아 암종 세포주(P19 세포주)는 일반적으로 시험관내 신경발생 연구를 위한 세포모델로서 사용된다 6,^7,8. P19 세포주 전형적인 다능성 줄기 세포 특징을 전시하고 부착 조건하에서 신경 쇠산 다음에 세포 응집 도중 레티노산 (RA)의 존재에 있는 신경으로 분화할 수 있습니다. 더욱이, 미분화 P19 세포주또한 디메틸 설폭사이드(DMSO)^{9,10,11,12의}영향을 받아 근육-및 심근세포 유사 세포를 형성할 수 있다.

많은 방법^{13,14,15,16은} 신경 분화에 대해 보고되었지만, 방법론은 때때로 복잡하고 설명만 읽음으로써 파악하기가 쉽지 않다. 예를 들어, 프로토콜은 때때로 종아리 혈청(CS) 및 태아 소 혈청(FBS)^13의혼합물로 보충된 덜베코의 변형 된 독수리 배지 (DMEM) 배지의 조합을 필요로한다. 더욱이, 신경 발달에 사용되는 매체는 종종 신경분과 B27 보충제^{13,14,15,16으로}구성된다. 따라서 기존 메서드에는 준비의 복잡성이 포함되어 있으며 여기서의 목표는 프로토콜을 단순화하는 것입니다. 본 연구에서, 우리는 FBS를 가진 DMEM이 P19 세포주 (DMEM + 10% FBS)뿐만 아니라 신경 발달 (DMEM + 5% FBS + RA)을 유지하는 데 이용될 수 있음을 입증하였다. P19 세포주를 사용하여 신경 발생을 위한 이 단순화한 방법은 우리가 신경세포가 어떻게 개발되는지의 분자 기계장치를 공부하는 것을 허용합니다. 더욱이, 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환에 대한 연구도 P19 세포주17,^18을이용하여 진행되고 있으며, 본 연구에서 개발된 방법이 이를 해명하는 데 한 몫을 할 것으로 믿습니다. 신경 발달 이상 및 신경 퇴행성 질환의 분자 메커니즘.

프로토콜

1. 문화유지

1. 유지 보수 매체에서 P19 세포주 배양 (Dulbecco의 수정 된 독수리의 배지와 4,500 포도당 의 mg /L 보충 10% FBS, 100 단위 / mL 페니실린 과 100 단위 / mL 연쇄상 구균). 37 °C 및 5 %CO2에서 배양하십시오.

2. 하위 배양 세포

1. 세포가 약 80% 합류에 도달하면, 세포 배양 플라스크(표면적 25 cm2)로부터 소비배지를 제거한다.
2. 칼슘과 마그네슘이 없는 인산완충식염수(PBS)2 mL로 세포를 세척합니다.
3. 세포 단층에 0.25% 트립신-EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)의 1 mL를 첨가합니다.
4. 플라스크를 CO2 인큐베이터(37°C 및 5% CO2)에 2-3분 동안 넣습니다.
5. 플라스크 표면에 대한 세포 부착을 평가합니다. 모든 셀이 매매체에 분리되고 부동되어 있는지 확인합니다.
6. 트립신의 효소 활동을 중지 유지 보수 매체의 9 mL를 추가합니다.
7. 유지 관리 매체에서 셀을 다시 일시 중단합니다.
8. 세포를 200 x g 및 실온(RT)에서 5분 동안 15 mL 튜브 및 원심분리기로 옮긴다.
9. 상급을 버리고 15 mL 튜브에 신선한 유지 보수 매체 10 mL를 추가하십시오.
10. 셀 서스펜션을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 셀 카운터를 사용하여 셀 번호를 확인합니다.
11. 새로운 25 cm² 플라스크에서 2 x 10⁴ 세포 / cm2에서 종자 세포.
12. 유지 보수 매체를 최대 10mL까지 추가합니다.
13. 플라스크를_CO2 인큐베이터(37°C 및 5% CO2)에 2-3일 동안 넣습니다.

3. 트립신 소화

1. 세포 플라스크로부터 흡인 유지 보수 배지. 칼슘 과 마그네슘이없는 PBS의 2 mL로 한 번 세포를 씻어.
2. 0.25% 트립신-EDTA의 1 mL을 추가합니다.
3. 세포가 있는 플라스크를 37°C에서 CO2 인큐베이터에 넣고 2-3분 동안 넣습니다.
4. 1 mL 파이펫을 사용하여 셀을 10번 파이펫팅하여 세포를 해리합니다.
5. 세포에 RA없이 9 mL의 분화 매체 (Dulbecco의 수정 된 독수리 배지와 포도당 4500 mg / L을 5 % FBS, 100 단위 / mL 페니실린 및 100 단위 / mL 연쇄상 구균)로 보충하여 트립신을 중화하십시오.
6. 세포를 15 mL 튜브및 원심분리기로 200 x g 및 RT에서 5분 동안 이송합니다.
7. 상온제를 버리고 레티노산(RA)없이 분화 배지 1 mL를 첨가합니다. 세포 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
8. 셀 서스펜션을 사용하여 제조업체의 지시에 따라 셀 카운터를 사용하여 셀 번호를 결정합니다.

4. 집계 생성

1. 5 μL의 RA (99.8 % 에탄올에 용해 된 1 mMM 스톡을 -20 °C에서 저장)를 분화 매체의 10 mL에 넣고 잘 혼합하십시오 (0.5 μM RA의 최종 농도).
   참고: RA는 빛에 민감합니다. EtOH의 낮은 농도는 세포 분화에 영향을 미치지 않습니다^19,20,21.
2. 100mm 비처리 배양 접시(서스펜션 배양 전용)에 10 mL의 분화 배지(RA)를 추가합니다.
3. 100mm 접시에 1 x 10⁶ 세포를 시드 (접시 표면적 56.5 cm 2).
4. 응집체 형성을 촉진하기 위해 세포를 37°C 및 5% CO2에서 인큐베이터에 넣고 2일 동안.
5. 2일 후, 분화 매체를 교환한다. 10 mL 파이펫을 사용하여 응집체를 함유하는 흡인 배지를 RT에서 15 mL 튜브로 전달한다.
6. RT에서 1.5분 동안 응집체가 중력에 의해 정착되도록 합니다.
7. 상급제는 버리십시오.
8. 10 mL 의 세레학적인 파이펫을 사용하여 0.5 μM RA로 신선한 10 mL의 분화 매체를 추가하십시오.
   주의 사항: 셀이 위아래로 응집되지 않도록 피펫을 설치하지 마십시오.
9. 새로운 100 mm 비 처리 배양 접시에 응집체를 종자 (서스펜션 배양 전용).
10. 플레이트를 인큐베이터(37°C 및 5% CO2)에서 2일 동안 놓습니다.

5. 응집체 해리

1. 10 mL 파이펫을 사용하여 셀 응집체를 흡인합니다.
2. 응집체를 15 mL 튜브로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김. 셀 응집체가 중력에 의해 1.5 분 동안 정착할 수 있도록 합니다.
3. 상급체를 제거합니다.
4. 단독으로 DMEM으로 응집체를 세척하십시오 (혈청 및 항생제 - 무료).
5. RT에서 1.5분 동안 중력 침전에 의해 세포 응집체가 침전되도록 합니다.
6. 상한을 흡인하고 트립신-EDTA(0.25%)의 2 mL을 추가합니다.
7. 세포 응집체를 수조(37°C)에 10분 동안 넣고 손으로 두드려 2분마다 응고물을 부드럽게 교반합니다.
8. 유지 보수 매체의 4 mL를 추가하여 트립시니화 프로세스를 중지합니다.
9. 파이펫은 1mL 파이펫을 사용하여 20회 위아래로 응집됩니다.
10. 200 x g 및 RT에서 5 분 동안 원심 분리지 세포.
11. 상급체를 제거하고 유지 보수 매체의 5 mL에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.
12. 셀 카운터를 사용하여 셀 번호를 확인합니다.

6. 도금 세포

1. 6웰 플레이트에 유지 보수 매체당 3 mL를 추가합니다.
2. 종자 세포는 0.5 x 10 6/well의밀도로 6웰 배양 플레이트에서.
3. 37°C에서 5% CO2 농도로 배양합니다.
4. 6웰 배양플레이트에서 커버 글라스상에 세포를 시드하고 항MAP2 항체(20% 합류)로 면역염색을 수행한다. 6웰 플레이트를 사용하여 RNA를 분리하고 Map2, NeuN, Oct4, Nano및 Gapdh (20 % 합류)에 대한 RT-PCR을 수행하십시오.

결과

P19 세포주에서 신경 발생 유도에 대한 프로토콜의 단순화 된 계획은 도1에 제시되어 있다. P19 세포주의 특성을 미분화 상태 및 신경 발생 시 정의하기 위해 RT-PCR(역전사-폴리머라제 연쇄 반응) 방법을 사용하였다. 미분화 P19 세포주들은 유기 양이온/카르니틴 트랜스포터4(Oct4) 및 나노홈박스(Nanog)와 같은 다능성 유전자를 발현하였다. RA의 존재에서 현탁액 배양에서 세포 응집에 의해 유도된 신경발생은 Oct4 및 나노발현의 급격한 감소를 이끌었다. 반대로, 뉴런 마커의 발현: 미세투관 관련 단백질 2(Map2) 및 NeuN(RNA 결합 단백질이라고도 함, 폭스-1 호몰로그 3(Rbfox3)))은 신경 발생 유발 후 증가 (도2)<...

토론

여기서, 우리는 P19 세포주를 사용하여 신경 발생에 대한 간단한 프로토콜을 기술한다. 많은 보고가 이 점에서 간행되었더라도, P19 세포주를 사용하여 신경 발생 유도를 위한 상세한 방법론은 불분명합니다. 또한, 우리는 전체 실험에 대해 10 % FBS를 가진 간단한 높은 포도당 (4,500 mg / L) DMEM 배지를 이용했습니다. 이를 통해 우리는 사용자 친화적 인 방식으로 신경 성 실험을 수행하고 미래를 위해이 방법의 사용을 확장 할 수있었습니다.

이 프로토콜 내에서 가장 중요한 점은 현탁액 배양내의 세포 응집체 의 생성뿐만 아니라 RA 농도이다. P19 세포주에서 신경발생의 자극은 응집체의 형성 없이 수행될 수 있지만, 생성된 뉴런 세포의 수는 세포 배양(22)에서 3분의 2로 감소될 것이다. Monzo 외. 단층^15에서배양하여 P19 세포주에서 신경 발생 유도를 나타내고 있다. 그들의...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
6x DNA 로딩 염료	EURx	E0260-01
아가로 스	시그마 - 알드리치	A9539
cDNA 합성 키트	EURx	E0801-02
DAPI (4 ′ ,6-Diamidine-2 ′ -phenylindole dihydrochloride)	시그마 - Aldrich	10236276001	작업 농도 : 1 μ g/mL
DMEM 고포도당(4.5g/L) L-글루타민	Lonza	BE12-604Q
에탄올 99.8%	Chempur	CHEM*613964202
소 태아 혈청(FBS)	EURx	E5050-03
MAP2 항체	Thermo Fisher Scientific	PA517646	희석 1:100
PCR 반응 키트	EURx	E0411-03
페니실린/스트렙토마이신 10K/10K	Lonza	DE17-602E
인산 완충 식염수 (PBS), Ca2+, Mg2+	Lonza	BE17- 517Q
레티노산	Sigma- Aldrich	R2625-50MG	없이 집중; 99.8 % 에탄올에 용해; -20 °에 보관하십시오. C 최대 6개월
2차 항체 (Alexa Fluor 488)	Thermo Fisher Scientific	A11034	희석 1:500
탈지 우유	Sigma- Aldrich	1153630500
TBE 버퍼	Thermo Fisher Scientific	B52
Triton-X 100	Sigma- Aldrich	T8787-100ML
트립신 0.25% - HBSS의 EDTA  Ca2+, Mg2+, 페놀 레드	biosera	LM-T1720/500
세포 배양 플라스틱
1 mL 혈청학 피펫	Profilab	515.01
		10 mL
현탁 배양 전용 100 mm 접시	Corning	C351029
15 mL 원심분리기 튜브	Sigma- Aldrich	CLS430791-500EA5
mL 혈청학 피펫	Profilab	515.05
6웰 플레이트	Corning	CLS3516
세포 배양 플라스크, 표면적 25 cm2	Sigma- Aldrich	CLS430639-200EA