P19 마우스 배아 암세포주(P19 세포주)는 생체내 분석에 비해 매우 단순화된 신경발생의 분자 기전을 연구하는데 널리 사용된다. 여기서, 우리는 P19 세포주에서 레티노산 유도 신경발생에 대한 프로토콜을 제시한다.
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이 논문에서
요약
초록
마우스 배아 유래 기형암유래 P19 세포주들은 3개의 세균 층으로 분화하는 능력을 가지고 있다. 레티노산(RA)의 존재에서, 현탁액 배양된 P19 세포주들은 뉴런으로 분화하도록 유도된다. 이 현상은 시험관에서 신경 발생 모델로 광범위하게 조사된다. 따라서, P19 세포주신경발생과 관련된 분자 및 세포 연구에 매우 유용하다. 그러나, 문헌에 기재된 P19 세포주신경 분화를 위한 프로토콜은 매우 복잡하다. 이 연구에서 개발 된 방법은 간단 하 고 신경 발달 이상 및 신경 퇴행 성 질환에 분자 메커니즘을 해명에 역할을 할 것 이다.
서론
배아 발달 도중, 단 하나 세포 층은 3개의 개별적인 세균 층 1,2,3로변환됩니다. 생체 내에서 발생하는 현상의 연구 가능성을 높이기 위해 3차원 응집체(배아 체)의 생성이 편리한 모델로 개발되었습니다. 이러한 방식으로 형성된 세포 응집체는 배아4,5의발달을 반영하는 세포 분화를 유발하는 다양한 조건에 노출될 수 있다. P19 뮤린 배아 암종 세포주(P19 세포주)는 일반적으로 시험관내 신경발생 연구를 위한 세포모델로서 사용된다 6,7,8. P19 세포주 전형적인 다능성 줄기 세포 특징을 전시하고 부착 조건하에서 신경 쇠산 다음에 세포 응집 도중 레티노산 (RA)의 존재에 있는 신경으로 분화할 수 있습니다. 더욱이, 미분화 P19 세포주또한 디메틸 설폭사이드(DMSO)9,
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프로토콜
1. 문화유지
- 유지 보수 매체에서 P19 세포주 배양 (Dulbecco의 수정 된 독수리의 배지와 4,500 포도당 의 mg /L 보충 10% FBS, 100 단위 / mL 페니실린 과 100 단위 / mL 연쇄상 구균). 37 °C 및 5 %CO2에서 배양하십시오.
2. 하위 배양 세포
- 세포가 약 80% 합류에 도달하면, 세포 배양 플라스크(표면적 25 cm2)로부터 소비배지를 제거한다.
- 칼슘과 마그네슘이 없는 인산완충식염수(PBS)2 mL로 세포를 세척합니다.
- 세포 단층에 0.25% 트립신-EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)의 1 mL를 첨가합니다.
- 플라스크를 CO2 인큐베이터(37°C 및 5% CO2)에 2-3분 동안 넣습니다.
- 플라스크 표면에 대한 세포 부착을 평가합니다. 모든 셀이 매매체에 분리되고 부동되어 있는지 확인합니다.
- 트립신의 효소 활동을 중지 유지 보수 매체의 9 mL를 추가합니다.
- 유지 관리 매체에서 셀을 다시 일시 중단합니다.
- 세포를 200 x g 및 실온(....
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결과
P19 세포주에서 신경 발생 유도에 대한 프로토콜의 단순화 된 계획은 도1에 제시되어 있다. P19 세포주의 특성을 미분화 상태 및 신경 발생 시 정의하기 위해 RT-PCR(역전사-폴리머라제 연쇄 반응) 방법을 사용하였다. 미분화 P19 세포주들은 유기 양이온/카르니틴 트랜스포터4(Oct4) 및 나노홈박스(Nanog)와 같은 다능성 유전자를 발현하였다. RA의 존재에서 현탁액 배양에서 세포 응집에 의해 유도된 신경발생은 Oct4 및 나노발현의 급격한 감소를 이끌었다. 반대로, 뉴런 마커의 발현: 미세투관 관련 단백질 2(Map2) 및 NeuN(RNA 결합 단백질이라고도 함, 폭스-1 호몰로그 3(Rbfox3)))은 신경 발생 유발 후 증가 (도2)<.......
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토론
여기서, 우리는 P19 세포주를 사용하여 신경 발생에 대한 간단한 프로토콜을 기술한다. 많은 보고가 이 점에서 간행되었더라도, P19 세포주를 사용하여 신경 발생 유도를 위한 상세한 방법론은 불분명합니다. 또한, 우리는 전체 실험에 대해 10 % FBS를 가진 간단한 높은 포도당 (4,500 mg / L) DMEM 배지를 이용했습니다. 이를 통해 우리는 사용자 친화적 인 방식으로 신경 성 실험을 수행하고 미래를 위해이 방법의 사용을 확장 할 수있었습니다.
이 프로토콜 내에서 가장 중요한 점은 현탁액 배양내의 세포 응집체 의 생성뿐만 아니라 RA 농도이다. P19 세포주에서 신경발생의 자극은 응집체의 형성 없이 수행될 수 있지만, 생성된 뉴런 세포의 수는 세포 배양(22)에서 3분의 2로 감소될 것이다. Monzo 외. 단층15에서배양하여 P19 세포주에서 신경 발생 유도를 나타내고 있다. 그들의.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
연구 결과는 국립 과학 센터에 의해 재정적으로 지원되었다, 폴란드 (부여 없음. UMO-2017/25/N/NZ3/01886) 및 KNOW (주요 국가 연구 센터) 과학 컨소시엄 "건강한 동물 - 안전한 식품", 과학 고등 교육부의 결정 No. 05-1/KNOW2/2015
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 6x DNA 로딩 염료 | EURx | E0260-01 | |
| 아가로 스 | 시그마 - 알드리치 | A9539 | |
| cDNA 합성 키트 | EURx | E0801-02 | |
| DAPI (4 ′ ,6-Diamidine-2 ′ -phenylindole dihydrochloride) | 시그마 - Aldrich | 10236276001 | 작업 농도 : 1 μ g/mL |
| DMEM 고포도당(4.5g/L) L-글루타민 | Lonza | BE12-604Q | |
| 에탄올 99.8% | Chempur | CHEM*613964202 | |
| 소 태아 혈청(FBS) | EURx | E5050-03 | |
| MAP2 항체 | Thermo Fisher Scientific | PA517646 | 희석 1:100 |
| PCR 반응 키트 | EURx | E0411-03 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 10K/10K | Lonza | DE17-602E | |
| 인산 완충 식염수 (PBS), Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17- 517Q | |
| 레티노산 | Sigma- Aldrich | R2625-50MG | 없이 집중; 99.8 % 에탄올에 용해; -20 °에 보관하십시오. C 최대 6개월 |
| 2차 항체 (Alexa Fluor 488) | Thermo Fisher Scientific | A11034 | 희석 1:500 |
| 탈지 우유 | Sigma- Aldrich | 1153630500 | |
| TBE 버퍼 | Thermo Fisher Scientific | B52 | |
| Triton-X 100 | Sigma- Aldrich | T8787-100ML | |
| 트립신 0.25% - HBSS의 EDTA Ca2+, Mg2+, 페놀 레드 | biosera | LM-T1720/500 | |
| 세포 배양 플라스틱 | |||
| 1 mL 혈청학 피펫 | Profilab | 515.01 | |
| 10 mL | |||
| 현탁 배양 전용 100 mm 접시 | Corning | C351029 | |
| 15 mL 원심분리기 튜브 | Sigma- Aldrich | CLS430791-500EA5 | |
| mL 혈청학 피펫 | Profilab | 515.05 | |
| 6웰 플레이트 | Corning | CLS3516 | |
| 세포 배양 플라스크, 표면적 25 cm2 | Sigma- Aldrich | CLS430639-200EA |
참고문헌
- Ramkumar, N., Anderson, K. V. SnapShot: mouse primitive streak. Cell. 146 (3), 488(2011).
- Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. Gastrulation: making and shaping germ layers. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).
- Tam, P. P. L., Gad, J. M. Chapte....
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재인쇄 및 허가
