쥐와 쥐에 Circumlimbal 봉합에 의해 유도 된 녹 내장의 모델

요약

만성 안구 고혈압 쥐와 쥐, 일치 녹 내장 망막 신경 절 세포의 기능 및 구조 저하로 이어지는 circumlimbal 봉합을 적용 하 여 유도 된다.

초록

Circumlimbal 봉합 만성 안구 내부 압력 (IOP), 녹 내장에 대 한 잘 알려진 위험 요소를 높이기에 의해 설치류의 실험 녹 내장을 유발 하는 기술 이다. 이 프로토콜에서는 긴 에반스 쥐 및 C57BL/6 쥐에이 기술에 대 한 단계별 가이드를 보여 줍니다. 일반 마 취, "지갑-문자열" 봉합 결, 적도 주위와 눈의 limbus 뒤에 적용 됩니다. 동료 눈 치료 컨트롤 역할을 합니다. 우리의 연구는 쥐에 대 한 8 주와 12 주 마우스의 기간의 기간 동안 IOP 리바운드 tonometry 국 소 마 취 없이 의식이 있는 동물에 의해 정기적으로 측정 된 높은, 남아. 두 종에서 sutured 눈 보여주었다 electroretinogram 기능을 우선 내부 망막 장애와 일치. 광학 일관성 단층 촬영 망막 신경 섬유 층의 선택적 숱이 보였다. 조직학 발견 횡단면에 쥐 망막의 신경 절 세포 층에 세포 밀도 하지만 다른 세포 층에 변화가 감소. 신경 절 세포 특정 표시 (RBPMS)와 함께 평면 탑재 마우스 retinae의 얼룩 ganglion 셀 손실 확인. Circumlimbal 봉합은 간단한, 최소한 침략 적이 고 비용 효율적인 방법으로 쥐 및 쥐에서 신경 절 세포 상해에 이르게 눈의 고혈압을 유발 하.

서론

동물 모델 평가 잠재적인 치료 내정간섭으로 기본 녹 병, 잘을 처리 하는 세포의 실험실 조사에 대 한 중요 한 플랫폼을 제공 합니다. 여러 모델을 유도할 수 있는 지속적인된 intraocular 압력 (IOP) 상승, 녹 내장에 대 한 가장 중요 한 위험 요소를 생산 하기 위해 개발 되었습니다. IOP 상승에 적용 된 방법은 다음과 같습니다: episcleral에 고 식 염 수 주입 혈관¹, 레이저 photocoagulation 배수 채널² 의 또는 limbal 혈관³및 intracameral와 같은 물질의 주입 빨간 유령 혈⁴, microbeads^5,6 , 점 탄성 요원⁷. 각 방법의 장점과 한계는 있습니다.

녹 내장에 대 한 좋은 모델 외상, 염증 및 미디어 불투명도 등 최소한의 합병증과 질병 과정을 모방 해야 합니다. 이러한 합병증 IOP 상승, 유도 하는 데 사용 하는 절차와 자주 연결 되 고 결과의 해석을 혼동 수 있습니다. 예를 들어 paracentesis 앞쪽 챔버의 이물질은 도입 되지, 하는 경우에 표시 되었습니다 외상 및 염증의 전형적인 glaucomatous 변경^8,9은 아닙니다 원인. 염증 방지의 중요성 뿐만 아니라 vivo에서 이미징 및 질병의 진행을 모니터링 하는 생리학 용이 광학 선명도 유지. 이러한 합병증 질환 조사, 영향을 미칠 수 있지만 그것은 어느 정도까지 불분명 모델 유도 하는 동안 눈을 관통 하지 않도록 더 있을 수 있습니다. Circumlimbal 봉합 접근 세계의 침투를 방지 하 고 망막의 구조와 기능의 비보에 경도 평가 용이 하 게. 더 중요 한 것은,이 모델은 필요할 때 봉합의 제거에 의해 초기 계획 값을 IOP를 반환 에서 이전 그들에서 다릅니다. 되돌릴 수와 돌이킬 수 없는 신경 절의 분자 상호 세포 상해^{10,11,12,,1314}그리고 IOP 정규화 세포를 공부 하는 데 유용 수 있습니다.

이 문서는 모델 유도 대 한 기술에 초점을 맞추고. 쥐와 쥐에이 모델에 의해 유도 된 망막 상해의^{15,,1617,,1819}자세히 다른 곳에서 찾을 수 있습니다.

프로토콜

모든 실험 절차는 과학적 목적, 호주에서 국민 건강 및 의료 연구 위원회에 의해 설정에 대 한 관심과 동물의 사용에 대 한 호주 코드 연습에 따라 실시 했다. 하 워드 Florey 연구소 동물 윤리 위원회에서 윤리 승인을 얻은 (승인 번호 13-044-UM 그리고 13-068-음 쥐와 생쥐, 각각).

1. 안 구내 압력 측정 의식 쥐에

1. 실험실 리바운드 tonometer 쥐 설정으로 설정 합니다. 진정 동물을 부드러운 헝겊 조각에 깨어 쥐 swaddle 머리와 목 노출. 탐정의 가슴에 대하여 휴식 하는 동물의 다시 몸통 한 손에 부드럽게 잡으십시오.
   참고: 국 소 마 취는 필요 하지 않습니다.
2. 사용 하 여 다른 손을가지고 쥐의 눈 근처 리바운드 tonometer IOP 프로브 팁은 약 2-3 m m에서 및 수직 각 막 정점에. 오른손을 사용 하 여 동물의 오른쪽 눈과 왼쪽된 눈에 대 한 왼손에 IOP를 측정.
3. 진정 하 고 측정 한 번 하는 쥐에 대 한 몇 초 동안 기다립니다. IOP 프로브 팁 부드럽게 명 중 각 막 정점 한번; 관찰 그리고 리바운드 tonometer 비프음을 한 번 듣고.
   참고: 단일 비프음은 tonometer의 성공적인 측정, LCD 화면에서 읽을 수 있는 확인 합니다. 이중 비프음 측정 오류를 나타냅니다. 측정 오류 조사 및 각 막, tonometer, 또는 눈 꺼 풀 또는 각 막의 중앙이 아닌 일부 눈에 띄는 조사 방향에 과도 한 기울기 사이의 부적절 한 작동 거리 같은 요인에서 발생할 수 있습니다. 측정 오류에 관한 더 세부 사항에 대 한 제조 업체에서 리바운드 tonometer 설명서를 참조 하십시오.
4. 10 번에 1-2 초의 간격 1.3 단계를 반복, 이러한 측정에서 그 시간 지점에 대 한 평균 IOP 값을 파생. 5^번째 읽기 후에 tonometer를 다시 설정 합니다.
5. 직렬 모니터링, IOP 하루의 고 일주 IOP 사이클^20,21인 변화를 최소화 하기 위해 일관 된 조명 조건 하에서 같은 시간에 측정 합니다.

2. 의식이 쥐 안 구내 압력 측정

1. 제조업체의 지시에 따라 마우스 설정에 리바운드 tonometer를 설정 합니다.
2. 손으로 마우스를 억제, 그릴 케이지 위에 마우스 놓고 살짝 꼬리를 뒤로 당겨.
   참고:이 동물 그것의 몸을 스트레칭 약간 앞 다리와 시도 자체를 앞으로, 금속 그릴에 그립을 자극할 것 이다.
   1. 다른 손을 사용 하 여 즉시 귀 뒤에 느슨한 피부를 파악. 테일 링 손가락과 가운데 손가락 사이 (또는 작은 손가락과 손바닥 사이)를 개최 하 여 동물의 체를 보안 합니다.
      참고: 질 식과 눈에 적용 압력을 피하기 위해 너무 꽉 피부를 파악 하지 않으려고.
3. 지금 무료 손 (처음 들고 꼬리), IOP 프로브 팁은 약 2-3 m m 및 수직 각 막 정점에 마우스의 눈 근처 리바운드 tonometer가지고. 다른 눈을 측정 하는 다른 눈 이제는 tonometer 앞 마우스를 회전 합니다.
4. 진정 하 고 측정의 단추 한 번 마우스를 기다립니다. IOP 프로브 팁 부드럽게 칠 각 막 정점; 관찰 단일 경고음이 시스템이 성공 측정을 확인.
   참고: 이중 비프음 측정 오류를 나타냅니다. 그것을 두 번째 실험 읽기 및 문서 IOP 읽기 첫 번째 실험은 측정 하는 동안 도움이 됩니다.
5. 2.4 파생 된 IOP 10 성공적인 읽기를 반복 합니다. 5^번째 읽기 후에 tonometer를 다시 설정 합니다. 읽기 1-2 초 간격을 허용 한다.
6. 쥐에서 직렬 측정에 의하여 오늘의 하 고 일관 된 조명 조건 하에서 동시에 마우스 IOP를 측정 합니다.

3. 마 취 쥐 및 쥐에 안구 내부 압력 상승의 유도

1. 70% 에탄올에 0.5% 액체와 수술 도구를 청소 합니다. 무 균 커튼으로 벤치를 커버. 오토 클레이 브 모든 수술 장비 사전. 적절 한 개인 보호 장비 (스 쿠와 멸 균된 장갑, 가운)을 착용 하는 모든 경험을 확인 하십시오.
2. 전신 마 취 유도, 유도 챔버에서 동물을 배치 합니다. 3 L/min의 유량에 O₂ 와 3-3.5 %isoflurane 제공 합니다.
   1. 1.5 %2 L/min 전달 통해 수술 내내 설치류 얼굴 마스크에서 isoflurane와 마 취를 유지 합니다. 발 핀치 반사의 부재에 의해 마 취의 충분 한 깊이 확인 합니다.
   2. 때 약 60 호흡/분 호흡 속도 유지 하기 위해 필요한 유량을 조정 하 여 호흡을 하지 마십시오.
3. 치료 컨트롤 역할을 contralateral 눈으로, 눈의 고혈압을 유발 하는 눈 하나를 임의로 선택 합니다. 국 소 마 취에 대 한 0.5 %proxymetacaine 안과 솔루션의 한 방울을 주는. 눈 표면을 청소, 살 균 정상적인 염 분의 3 mL와 함께 눈을 씻어 하십시오.
4. 커버는 살 균, fenestrated 수술 드 레이프, 봉합 될에 눈을 노출 된 동물.
5. 전세계 안구 결 막에 지갑 문자열 봉합을 수행 합니다. 쥐, 7/0 나일론 봉합 병렬 및 2mm 후부 limbus (그림 1) 짜 다. 쥐, 장소 10/0 나일론 봉합 1 m m는 limbus를 후부.
   1. 알아서 하지 여 sclera에 침투. 수술 하는 동안 갑자기 동 공 팽창이 나타냅니다는 sclera 침투 가능성이 있다.
   2. 5-6 앵커 포인트 쥐, 및 쥐에 4-5 앵커 포인트를 사용 하 여 결 막에 봉합 앵커.
   3. 이러한 정 맥의 교차점에 결 막 아래 봉합을 스레딩 하 여 주요 episcleral 혈관에 직접 압축을 하지 마십시오.
      참고: 쥐에 있는 주요 episcleral 정 맥의 압축을 피하는 것이 좋습니다, 하는 동안이 수행 되지 않습니다 정기적으로 쥐 마우스 눈에서 이러한 혈관의 낮은 가시성 때문에. 주요 정 맥 직접 압축 되지 않는다 하더라도 그것은 episcleral 정 맥 총에 작은 혈관 압력, 기여 지속적인된 IOP 상승 하는 요인이 될 수 있는 가능성이 (IOP 상승의 메커니즘에 대 한 논의 참조 하십시오).
6. 두 번째 간단한 매듭 (그림 1)에 의해 다음 매듭을 매 서 지갑 문자열 봉합 고정. 지나치게 높은 수술 후 IOP 스파이크를 방지 하려면 조 두 번째 매듭을 체결 직전 IOP를 측정할 수가 있다.
   1. IOP 너무 높게 되 면 부분적으로 봉합 ( 그림 1A화살표)의 한쪽 끝에 긴장을 방출 하 여 슬립 매듭을 조정 합니다.
   2. 후 원하는 IOP 이루어집니다 (이상적으로 30-60 mmHg 쥐 또는 쥐에 30-40 mmHg), 봉합 ( 그림 1화살표)의 끝에는 연속 당기는 힘을 유지 하면서 두 번째 매듭에서 넥타이.
   3. 두 번째 후 매듭 강화 되었습니다, 그리고 어떤 외국 몸 센 세이 션을 최소화 하기 위해 봉합의 끝을 잘라. 전신 마 취에서 회복 하는 동안 동물을 모니터링 합니다.
      참고: 그것은 눈에 적절 한 내부 압축 되도록 때 첫 매듭을 매는 매듭을 사용 하는 것이 중요입니다. 몇 주 후 끝 결 막에 포함 되 고 일반적으로 주의 된다.

4. 모니터링 IOP

1. Post-operatively isoflurane 마 취 아래 2 분에서 첫 번째 IOP 측정을 가져가 라. 설치류는 앞서 언급 한 1 단계와 2 단계에 의하여 의식 회복 하는 때 그 후, IOP를 모니터링 합니다.
   참고: 매일 첫 주에 한 번 또는 두 번 주당 그 후 두 번 (2 분, 1 시간), 첫 번째 하루 동안 IOP를 모니터링 합니다.

5. 시 금 망막 구조와 기능

1. 설명 된 대로 측정 dark-adapted electroretinogram (에) 망막 기능을 원하는 실험 끝 지점에서 (이 경우에 8 주 쥐 및 쥐에 있는 12 주 후), 케 타 민/xylazine와 복 주입을 사용 하 여 일반 마 취, 자세히 다른^15,,1617.
   참고: 우리가 발견 강력한 신경 절 세포 기능 장애, 망막 신경 섬유 층 숱이 고 신경 절의 세포 손실 8 ~ 12 주 사이의 기간에 대 한. 다른 사람 성공적으로 IOP 상승^14,15의 긴 기간을 고용 했다.
2. 직후에 측정, 망막 신경 섬유 층 (RNFL)의 두께 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (SD-10 월) ^16,18를 사용 하 여 전체 망막 두께 측정 합니다.
3. 종 적 연구의 끝에, 깊은 마 취 동물 안락사.
   1. 해 부 조직학¹⁸, 다중 접합 항 체 (RBPMS) 또는 뇌 특정 homeobox/POU 도메인 RNA 의무적인 단백질 등 망막 신경 절 세포 (RGC) 특정 항 체를 사용 하 여 전체 마운트 망막의 예를 들어 immunostaining에 대 한 망막 단백질 3A (Brn3a)^16,,1922.

결과

쥐¹⁸ 및 마우스¹⁶ 다음 결과 이전에 보고 된 고 여기 요약 된다. Circumlimbal 봉합 사 생산 IOP 상승 쥐와 생쥐 (그림 2)에서 비슷한 패턴. 간단한 IOP 스파이크, 최대 58.1 ± 2.7 mmHg 쥐에서와 쥐, 38.7 ± 2.2 mmHg 봉합 수술 후 즉시 발견 되었다. 쥐, IOP 크기 3와 24 시간, 각각¹⁵에 44 ± 6 mmHg 그리고 32 ± 2 mm Hg, 수 시간이 지남에 따라 점차적으로 감소. 이 초기 IOP 스파이크 후 IOP 몇 주 동안 상대적으로 안정 유지. 실험 기간 동안, IOP 눈 고혈압 (OHT) 눈에 의해 높은 남아 ~ 쥐에 8 주 동안 9 mmHg ~ 쥐에서 12 주 동안 5 mmHg.

토론

Circumlimbal 봉합 만성 눈의 고혈압의 새로운 모델입니다. 연구는 대표적인 결과 공급된^16,18, 뿐만 아니라이 동물 모델은 최근 연구^{15,,2324,25의 수에 이용 되어 ,26}. 이러한 이전 보고서에 걸쳐 비교는 방법은 모델 유도 동안 IOP 상승, 간단한 IOP 스파이크의 크기를 포함 하 여 반복 결과 생성 보여줍니다 (나중에 토론을 참조 하십시오). IOP 상승 강력한 RGC 변화를 유도 하는 데 필요한 기간은 8과 12 주 사이, 비록 모델 수 유지에 대 한 이상, IOP 상승¹⁴

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
정상 식염수	Baxter International Inc	AHB1323	수술 중 각막 수분 유지
클로르헥사딘 0.5%	Orion Laboratories	27411, 80085	수술 기구 소독
Isoflurane 99.9%	Abbott Australasia Pty Ltd	CAS 26675-46-7	소유명: Isoflo(TM) 흡입 마취제. 봉합 절차를 위한 산소 가스와 혼합된 제약 등급 흡입 마취제
	Alcon Laboratories	1618611	소유 이름: 다른 쪽 눈을 촉촉하게 유지하는 Genteal, 안구 윤활제
바늘 홀더 (미세 수술)	World Precision Instruments	555419NT	안과 수술 중 바늘을 잡기 위해
Proxymetacaine 0.5%	Alcon Laboratories	CAS 5875-06-9	국소 안구 진통
가위 (미세 수술)	세계 정밀 기기	501232	결찰 중 과도한 봉합 그루터기를 줄이기 위해
외과 드레이프	생명 의료 용품	GM29-612EE	수술 중 멸균 환경 보장
쥐 (미세 수술)를 위한 봉합 바늘닌	보 의료 바늘	151109	8-0 둥근 바늘이 부착 된 나일론 봉합사, 절삭 날 3/8, 이중 바늘, 봉합 길이 30cm
마우스 봉합 바늘 (미세 수술)	닌보 의료 바늘	160905	10-0 나일론 봉합사 둥근 바늘, 절삭 날 3/8, 이중 바늘, 봉합 길이 30cm
핀셋 (미세 수술)	World Precision Instruments	500342	안구 수술 중 조직 조작
리바운드 안압계	TONOLAB, iCare, 핀란드 헬싱키안	압 모니터링을 위한	TV02