수정 된 난 자 마우스와 초기 단계 배아 zona pellucida, 유전자 배달에 대 한 장벽을 형성 하는 당단백질 매트릭스에 의해 보호 됩니다. 이 문서는 zona transduce lentiviral 벡터와 배아 세포와 유전자 변형 쥐를 만들고 레이저로 꿰뚫기 위한 프로토콜을 설명 합니다.
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방법 논문
마우스를 레이저를 이용한 Lentiviral 유전자 전달 수정 된 계란
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Lentiviruses는 포유류 세포에 유전자 배달에 대 한 효율적인 벡터. 변환, 다음 lentiviral 게놈은 안정적으로 호스트 염색체에 통합 하 고 자손 전달 됩니다. 따라서, 그들은 안정 된 세포의 생성, 지표, vivo에서 배달 및 유전자 변형 동물을 만드는 단일 셀 수정 된 달걀의 변환에 대 한 이상적인 벡터. 그러나, 마우스 수정 된 계란 및 초기 단계 배아 zona pellucida, lentiviral 유전자 배달에 대 한 장벽을 형성 하는 당단백질 매트릭스에 의해 보호 됩니다. Lentiviruses 너무 커서는 zona 침투 하 고 perivitelline 구멍, 배아 세포는 구역 사이의 공간에 바이러스 성 입자의 microinjection에 의해 일반적으로 전달 됩니다. 고도로 숙련 된 기술자와 전문된 장비에 대 한 요구 사항을 마우스 배아에 유전자 배달 lentiviruses 사용 하 여를 최소화 했다. 이 문서는 레이저로는 zona 꿰뚫기에 의해 수정 된 마우스 달걀 permeabilizing 위한 프로토콜을 설명 합니다. 레이저 구멍 뚫 기 손해 태아를 초래 하지 않습니다 하 고 배아 세포에 유전자 배달에 대 한 액세스는 lentiviruses를 허용 한다. 불리고 배아 blastocyst 생체 외에서 로 발전 하 고 pseudopregnant 마우스에 이식 하는 경우 유전자 변형 새끼로 발전 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용 되는 레이저는 효과적이 고 사용 하기 쉬운. 유전자는 lentiviruses 안정적으로 전달 마우스 배아 세포로 통합 하 고 생식 전송 됩니다. 필요 없는 micromanipulation 유전자 변형 생쥐의 생성 및 수정 된 난 자의 microinjection에 대 한 대체 방법입니다.
서론
이 메서드는 lentiviruses에 의해 배아 세포 유전자 배달을 위한 액세스할 수 있도록 마우스 수정 된 달걀의 zona pellucida permeabilizing에 대 한 자세한 지침을 제공 합니다. Lentiviruses는 포유류 세포에 효율적인 유전자 전달에 대 한 자연에 의해 설계 되었습니다. 그들은 나누어 및 비 분열 세포를 감염 하 고 그들의 호스트 염색체1에 lentiviral 게놈을 통합. Lentiviral 호스트 셀 범위는 쉽게 확장 pseudotyping VSV G 단백질2의 광범위 한 차 있는 굴곡 운동으로 인해 vesicular 구내 염 바이러스 당단백질 (VSV-G)와 재조합 lentivirus. 변환, 다음 lentiviral 유전자는 안정적으로 통합 하 고 그들의 호스트 염색체 유전자 변형 동물을 생성 하기 위한 이상적인 도구를 만들기의 일환으로 표현. 초기 단계 배아 세포에 전달 하는 경우 lentiviral 게놈 복제 이며 전체 유기 체에 표현. Lentiviral 변환 쥐, 쥐, 닭, 메 추 라 기의 생산을 주도하 고 있다 고3,,4
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프로토콜
모든 동물 절차와이 프로토콜에 사용 되는 치료 NIH/NIEHS 동물 보호 지침을 준수 했다 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC) NIH/NIEHS, 동물 프로토콜 2010-0004에 의해 승인 했다.
1입니다. 준비
- 관심사의 유전자를 운반 하는 재조합 형 비 전파 lentiviruses 준비/구매 이 연구에서 lentivirus SBI511 copepod 녹색 형광 단백질을 표현 (copGFP; GFP에 약식)는 신장에서 요소 1a 발기인 변환을 위해 사용 되었다. 2 생산 하는 데 사용 했다 표준 프로토콜 그리고 titer lentiviruses titers 1e8 시험 단위 (TU/mL) 당 보다 높은에서.
참고: 주의 사용 하 고 모든 자료는 lentiviruses 접촉 되어 표 백제. 안전 사용 및 lentiviruses의 취급에 대 한 연구소의 지침을 참조 하십시오. - 배아를 수확 하기 전에 하루 원하는 마우스 스트레인의 번 식 쌍 설치. 이 실험에서 쥐의 C57BL/6J 변형 사용 되었다. 여성 쥐 난소와 수 란 관 컬렉션 사용 superovulation에 대 한 어떤 호르몬으로 치료 하지 했다.
- 마우스 수정 된 달걀, 수확 전에....
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결과
절연/불리고 마우스 수정 된 달걀의 개발 매일 현미경 (그림 1)에서 확인할 수 있습니다. 건강 한 태아는 blastocyst으로 3-4 일 이내 발전. 이 프로토콜에서 치료 배아의 60-70%는 blastocyst23으로 발전. 54 blastocyst (47%의 비율)으로 발전 하는 114 레이저 천공 불리고 배아에서 46 blastocysts 표현 GFP (46/54 = 85%)23.
마우스 배아 수확의 날에 레이저 천공을 했다. 레이저 치료에 대 한 최적의 설정을 수정 란 당 3 구멍 그리고 250 양 레이저 구멍 (그림 2)을 만드는 대신 zona 얇은 목적으로 한.......
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토론
그들의 호스트 게놈으로 통합 하는 lentiviruses의 능력은 그들이 안정적인 유전자 배달에 대 한 이상적인 벡터 합니다. Lentiviral 벡터 셀 또는 유도할 수 있는 발기인, 선택 표시, 또는 형광 moieties 수용할 수 있는 유전 물질의 최대 8.5 kilobase 쌍 (kbp)을 수행할 수 있습니다. 법인된 게놈 자료 그들의 호스트 게놈의 일환으로 복제할 수 고를 표현 하거나 원하는 시간 지점에서 비활성화할 통제 될. 이러한 벡터 spatiotemporal 제어할 유전자 배달에 대 한 강력한 도구로 개발 및 브랜드는 lentiviruses의 다양 한 단계에서 유전자 발현에 대 한 수 있습니다.
레이저를 이용한 lentiviral transgenesis 유전자 식에 비보에대 한 효과적이 고 사용 하기 쉬운 방법입니다. 이 메서드는 vivo에서 단백질 생산 유전자 인코딩된 지표, 또는 기능 연구의 식에 사용할 수 있습니다. 다른 방법.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 연구는 국립 연구소의 건강 (NIH), 국립 환경 보건 과학 연구소 (NIEHS)의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다. 우리는 박사 로버트 페트 로비치와 박사 제이슨 윌리엄스는 원고 및 유용한 조언의 중요 한 독서에 대 한 감사입니다. 우리 또한 인정 하 고 박사 베른트 광택, 녹아웃 코어, Cytometry 교류 시설, 형광 현미경 및 이미징 센터, 그들의 기술적인 기여는 NIEHS의 비교 약 분기 시설 감사 하 고 싶습니다. 우리는 비교 약 지점에서 미스터 데이비드 Goulding와 사진 및 일러스트와 함께 우리를 제공 하기 위한 NIEHS에 이미징 센터의 양 로이스 Wyrick 감사 하 고 싶습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| CD510B-1 플라스미드 | 시스템 Biosciences | CD510B-1 | EF1a-copGFP를 발현하는 렌티바이러스를 포장하는 데 사용됩니다. |
| 디메틸폴리실록산, | 시그마 | DMPS5X | 아 배양 |
| 히알루로니다아제 | 시그마 | H3506 | 적운 세포를 제거하는 데 사용됩니다 |
| XYClone Laser | , Hamilton Thorne Biosciences, | 천공 마우스 수정란을 뚫는 | |
| 비수술적 배아 이식(NSET) 장치 | ParaTechs | 60010 | 배아의 NSET |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | 배양 배 |
| 배아KSOM의 구성: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH 2 < / sub>PO < > 4 < / sub> | 4.75 | ||
| MgSO < > 4 < / sub> 7H < > 2 < / sub>O | 4.95 | ||
| CaCl 2< / sub> 2H 2 < / sub>O | 25 | ||
| NaHCO 3< / sub> | 210 | ||
| 포도 | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, 나트륨 염 | 0.174mL | ||
| 10 mM EDTA | 100µ L | ||
| 스트렙토 마이신 | 5 | ||
| 페니실린 | 6.3 | ||
| 0.5 % 페놀 레드 | 0.1mL | ||
| L- 글루타민 | 14.6 | ||
| MEM 필수 아미노산 | 1mL | ||
| MEM 비 필수 AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 매체 < / strong> | Millipore | MR-015-D | 배양 배아 |
| M2의 구성 : < / strong> | mg / 100mL / < / strong> | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| 황산 마그네슘 (무수) | 16.5 | ||
| 염화 | 35.6 | ||
| 인산칼륨, 일염기성 | 16.2 | ||
| 중탄산 | 35 | ||
| 염화 | 553.2 | ||
| 알부민, 소 분획 | 400 | ||
| D-포도 | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| 페놀 레드 | 1.1 | ||
| 피루브산 | 3.6 | ||
| DL- 젖산 | 295 |
참고문헌
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 12 Unit 12 10 (2007).
- Lois, C., ....
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재인쇄 및 허가
