Method Article

사용자 정의 프로토콜 문자열 어셈블리 gRNA에 대 한 복제 (STAgR)

DOI:

10.3791/58556

⸱

December 26th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1MCN Junior Research Group, Munich Center for Neurosciences, Ludwig Maximilian Universitat, BioMedical Center, 2Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum, German Research Center for Environmental Health, 3Institute of Developmental Genetics, Helmholtz Zentrum, German Research Center for Environmental Health, 4Physiological Genomics, Ludwig Maximilian Universitat, BioMedical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 선물이 문자열 어셈블리 gRNA 복제 (STAgR), CRISPR/Cas9 접근에 쉽게 gRNA 벡터를 다중화 하는 방법. STAgR은 gRNA 멀티플렉싱 간단 하 고 효율적인 사용자 정의 합니다.

Abstract

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세균 CRISPR/Cas9 시스템은 실질적으로 생명 과학자에 대 한 방법론적 옵션을 증가 했다. 그것의 사용으로 인해 유전자와 게놈 엔지니어링 시스템의 넓은 범위에 적용 되었다. 또한, 많은 transcriptional epigenomic 엔지니어링 접근은 이제 처음으로 일반적으로 가능 하 고. CRISPR의 광범위 한 적용에 대 한 이유 중 하나는 분 자연에 있다. 작은 gRNAs의 복잡 한 게놈 대상, Cas9, 단백질의 변형 및 로컬 분자 결과 결정합니다. 그러나, 많은 CRISPR 접근 개별 셀에 여러 개의 gRNAs의 동시 제공에 따라 다릅니다. 여기, 우리는 문자열 어셈블리 gRNA (STAgR) 복제에 대 한 사용자 정의 프로토콜을 제시, 수 다중화 gRNA의 간단, 신속 하 고 효율적인 세대 단일 복제 식 벡터 방법 단계. STAgR (에이 프로토콜) 개별 대상 시퀀스는 도입 이후 짧은 오버행 뇌관에 의해 gRNA 식 카세트의 긴 DNA 서식 파일 다시 사용할 수 있는 여러 번 하는 동안 비용 효율적,입니다. 또한, STAgR gRNAs의 많은 다른 gRNA 변종, 벡터 및 발기인의 조합에의 한 단계 설립을 허용 한다.

Introduction

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문자열 어셈블리 gRNA (STAgR) 복제 여러 gRNA 식 카세트 하나의 단일 복제에 단계를 포함 하는 식 벡터의 효율적인 하룻밤 생성을 활성화 하는 방법입니다. STAgR 프로토콜 전문 지식 또는 재료에 의존 하지 않는 하 고 사용자 지정에 대 한 여러 옵션을 제공 합니다.

세균 CRISPR 단백질 Cas9에 한 고유 용량이 있습니다. 그것은 찾아서 선택적으로 자연스럽 게 발생 crRNAs 또는 조작된 gRNAs1에 인코딩된 그 DNA 시퀀스만 바인딩할 수 있습니다. 분자 도구로 이용 불가능, unfeasible 접근 또는 특정 휴대 전화 모델을 최근까지 유일한 제한의 많은 수가 있었습니다. 타겟된 유전자 변이2, 게놈 엔지니어링3,4,,56, transcriptional 활성화 및 유전자7,8입을 편집 epigenome 포함 됩니다. 우리가 아는 한 CRISPR은 보편적으로 구축, 응용 프로그램의 보고서 다양 한 대상 사이트, 세포 유형 및 종에 대 한 존재 합니다. 그러나, 많은 CRISPR 응용 프로그램에 따라 달라 직접 또는 간접적으로 게놈 조작 (translocations9,10, 중간11 및 대규모 게놈 변경의 일련을 포함 하는 여러 gRNAs의 납품 12 , 13) 게놈 엔지니어링 (Cas9 nickases14의 사용), 조건부 대립11,15 또는 직렬 돌연변이16생성 및 추적 전략17. 그러나 또한, 여러 대상 사이트는 다른 접근 (transcriptional 엔지니어링18, epigenome 엔지니어링19,20)에 대 한 엄격 하 게 필수이 고, 그들은 도달 자주이 아래 에서만 그들의 최대 효과 조건입니다.

여러 가지 유용한 방법은 포함 하는 하나 이상의 gRNA 식 카세트21,22,23,,2425,26, gRNA 벡터 생성을 설명 되었습니다. 27. 여기, 선물이 뛰어난 단순의 조합 (하나의 하룻밤 복제 단계) 속도, 낮은 비용 (DNA 템플릿을 여러 번 다시 사용할 수 있습니다), STAgR, 문자열 어셈블리 gRNA 복제에 대 한 프로토콜 (에 대 한 사용자 다른 gRNA 시스템 및 발기인)와 효과 (gRNA 카세트의 높은 숫자를 포함 하는 벡터의 세대 수 있습니다)28.

STAgR 원리에서를 사용할 수 있는 몇 가지 (1-2 gRNAs)와 식 벡터 생성, 여러 (3-5 gRNAs)와 식 카세트의 가장 높은 번호의 일부 보고 지금까지 (6-8 gRNAs)28. 마찬가지로, STAgR는 gRNA 시퀀스, 백본 또는 발기인 적용 됩니다. 그러나, STAgR은 주로 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)과 깁슨 어셈블리에 기반 하 고, 높은 순서 상사 성 가진 gRNAs는 대체 방법을 사용 하 여 생성 되어야 합니다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1입니다. 디자인 전략을 복제 하는 STAgR의

  1. 결정에 얼마나 많은 gRNA 카세트 하나의 벡터와 어떤 순서로 포함 됩니다. 발기인 및 gRNA 결정은 gRNAs의 각 건설 기계를 사용 해야 합니다. 모든 온라인 도구 (예: www.benchling.com)를 사용 하 여는 gRNAs 디자인.

2. STAgR 복제 돌출부와 뇌관 디자인

참고: 마지막 gRNA의 의미 protospacer 시퀀스와 antisense 첫 번째 gRNA의 각각에 추가 됩니다 벡터 백본 (그림 1)의 증폭에 사용 되는 PCR 뇌관. 나머지 시퀀스는 그로 인하여 감각과 센스 gRNAs 원하는 순서로 연결 문자열에서 증폭 된다. 첫 번째 문자열 조각 첫 번째 gRNA 오버행으로 N20 시퀀스를 포함 하는 앞으로 입문서와 두 번째 gRNA N20 시퀀스 (역 보수) 오버행으로 역방향 뇌관 증폭. 모든 다음 조각은 그에 따라 생성 됩니다.

  1. STAgR DNA 문자열으로 돌출 (표 1)에 대 한 앞으로 확대 뇌관에 N20 gRNA 시퀀스를 추가 합니다. (기존 비 계)에 대 한 앞으로 뇌관 "scf-FP" 또는 "샘-FP" (MS2 포함 하 비)에 대 한 감각 gRNA 시퀀스 5'를 추가 합니다. FP 뇌관 anneal 각각 STAgR 문자열 (그림 1)의 비 계/MS2 부분에.
  2. 반전 뇌관 시퀀스를 역방향 보완 N20 gRNA 시퀀스를 추가 합니다. 문자열 사용 (hU6 RP, mU6 RP, 7sK-RP, H1-라인란트) 및 특정 발기인에 따라 RP 뇌관을 선택 합니다.

3입니다. 파편을 복제 하는 STAgR의 생성

  1. 고 충실도 (HF) 버퍼, 10mm dNTPs의 1 µ L, 오버행-뇌관 (100 µ M), 10의 0.25 µ L 10 µ L를 설정 하 여 PCRs 깁슨 어셈블리에 대 한 개별 복제 파편을 생성 하기 위해 수행은 DNA 서식 파일 (문자열 또는 벡터), 0.5 µ L HF 중 합 효소의 ng 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 1.5 µ L H2O 50 µ L의 최종 볼륨을 추가 하 고.
    참고: 사용 플라스 미드 "STAgR_Neo" 템플릿으로 PCR 백본을 위한 마지막 gRNA에 gRNA 비 계를 통합 하 샘 비 계를 선택 하는 경우, "STAgR_SAM"를 사용 하 여. 6 gRNA 카세트와 STAgR 플라스 미드에 대 한 예를 들어 6 PCRs는 필요, 5 DNA와 서식 파일과 서식 파일으로 벡터 백본으로 문자열.
  2. 품 어 thermocycler 다음과 같은 조건에 반응: 1 분 30 s; 98 ° C의 1 개 주기 10에 대 한 98 ° C의 38 주기 s, 59 ° C (gRNA 비 계) / 68 ° C (샘 루프) 10 s, 72 ° C 30에 대 한 (삽입)에 대 한 s / 1 분 30 s로 (벡터); 10 분 동안 72 ° C의 1 주기.
  3. PCR 반응에서 5.5 µ L를 제거, 로드 염료를 추가 하 고 1 %agarose 젤에 증폭 된 파편을 분석. 부하 조정 (100 bp DNA 사다리/1 kb DNA 사다리)와 실행 실행 하는 적절 한 젤 젤에 대 한 적절 한 DNA 사다리를 30 분 동안 120 V에서 버퍼 (예를 들어, TLE 버퍼).
  4. 젤 실행 되는 동안 추가 버퍼를 제공 하는 제한 효소와 0.5 µ L의 5 µ L DpnI (10 단위) 나머지 44.5 µ L PCR 반응 하 고 37 ° c.에서 1 시간 30 분 품 어
  5. 마그네틱 비즈를 사용 하 여 DNA 정화를 수행 합니다.
    1. PCR 제품의 1 µ L 당 1.8 µ L 자석 구슬을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 혼합. 실 온 (RT)에서 2 분 동안 품 어.
    2. 별도 구슬 그리고 자석으로 잔여 액체에서 DNA 파편. 완전히 resuspending 없이 펠 릿을 rinsing 하 여 구슬 70% 에탄올으로 두 번 세척.
    3. 모든 에탄올을 피 펫을 제거 하 고 건조 한 펠 릿 공기.
    4. 아래로 pipetting으로 15-20 µ L H2O에서에서 펠 릿을 녹이 고 액체에서 자석을 사용 하 여 구슬을 분리. 새로운 튜브에 분명 상쾌한 전송.
      참고: 또는, 반응 열 기반 정리 키트 사용할 수 있습니다.
  6. 29설명 되어 있는 대로 분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA 농도 결정 합니다.

4. 깁슨 어셈블리 반응과 세균 변환

참고: 다음 단계는 깁슨 외. 에서 적응 30.

  1. 반응 혼합 하거나 상업 깁슨 복제 키트를 사용 하 여 만든 깁슨을 준비 합니다.
    1. 3 mL 1 M 트리 스 (Tris (hydroxymethyl) aminomethane)의 결합-pH 7.5, 1 M MgCl, 100 m m dGTP (deoxyguanosine 3 인산 염)의 60 µ L, 100 mM dATP (deoxyadenosine 3 인산 염)의 60 µ L, 100 m m dTTP (deoxythymidine 3 인산 염)의 60 µ L, 100 mM dCTP (60 µ L의 300 µ L에서 HCl deoxycytidine 3 인산 염), 1 M DTT (dithiothreitol), 페그-8000 (폴 리 에틸렌 글리콜), 300 µ L 100 mm 나드 (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드)의 1.5 g의 300 µ L H2O 5 × 등온 반응 버퍼의 6 mL를 추가.
      참고: Aliquoted 버퍼 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 최소 12 개월 동안.
    2. 깁슨 어셈블리 마스터에 대 한 혼합 하 고 H2O의 697 µ L 5 x 등온 반응 버퍼의 320 µ L를 결합 한 10 U / µ L T5 exonuclease의 3 µ L, 2 U / µ L DNA 중 합 효소의 20 µ L 40 U / µ L Taq DNA 리가의 160 µ L을 추가.
      참고:이 혼합 수 aliquoted-20 ° C에서 저장 된 적어도 12 개월 동안.
  2. 어셈블리 마스터 믹스의 7.5 µ L를 사용 하 여 삽입 및 벡터의 2.5 µ L로. 2 x STAgR 반응에 대 한 총에서 DNA의 1: 1만 이상 0.2 pmol의 비율을 삽입 하는 어 금 니 벡터를 사용 합니다. 2 개 이상의 gRNA 식 카세트에 대 한 벡터를 사용 하 여 1: 3의 비율을 삽입 하지만 0.5 pmol의 DNA 총액을 초과 하지 마십시오.
    참고: 모든 증폭된 gRNA 식 카세트 아데닌 금액에 사용 되어야 한다. 플라스 미드 컨트롤 벡터만 소화 되지 않은 서식 파일 벡터 (또는 각자 결 찰)에 대 한 제어를 없음 삽입의 동일한 금액을 포함 합니다.
  3. 샘플에 대 한 45 ~ 60 분이 게 샘플 얼음 50 ° C에 또는 후속 변환-20 ° C에서 품 어.
    참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
  4. 직접 변환 믹스의 화학적 유능한 박테리아.
    1. 화학적으로 유능한 TOP10 대장균 박테리아 얼음에 녹여
    2. 유능한 박테리아의 50 µ L에 깁슨 믹스의 5 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 튜브의 하단을 터치 하 여 혼합. 30 분 동안 얼음에 품 어.
    3. 42 ° C 물 목욕 또는 45에 대 한 열 블록에 튜브를 삽입 하 여 열 충격을 수행 s.
    4. 얼음에 다시 튜브를 넣어. 박테리아에 SOC 매체의 250 µ L을 추가 하 고 그들이 30-45 분 떨고 인큐베이터에서 37 ° C에 복구.
  5. 복구 후 접시에 1.5 %lysogeny 국물 (파운드) 한 천 배지 암 피 실린 포함 된 변환된 박테리아 (100 µ g / mL)와 37 ° c.에서 밤새 품 어

5. 세균성 식민지 PCR에 의해 STAgR 클론 선택

  1. 각 구문에 대 한 (3, 24) 사이 200 µ L PCR 반응 관의 적어도 2 세트 준비는 동일 하 게 표시 됩니다.
  2. 100 µ L 파운드 매체 100 µ g를 포함 한 세트를 채우기 / mL 암 피 실린.
  3. 1 세균성 식민지의 생물학 물자에서 처음에 살 균 피 펫 팁을 사용 하 고 빈 100 µ L PCR 반응 관의 하단에 그것을 확산. 즉시 파운드 매체를 포함 하는 두 번째 해당 반응 관에 팁을 전송.
  4. 박테리아의 일부 파운드 미디어를 전송 하 고 나중에 사용에 대 한 37 ° C에서 품 어 부드럽게 팁을 주위를 소용돌이 친다.
  5. PCR 마스터 믹스 (반응 당 10 µ L)를 설정 합니다.
    1. 10 반응에 대 한 10 µ L Taq 버퍼, 2 µ L 10 mM dNTPs, 뇌관 (100 µ M), Taq 중 합 효소의 0.5 µ L의 0.5 µ L를 결합 하 고 H2O 100 µ L의 볼륨을 추가 합니다.
    2. 다음 프라이 머를 사용 하 여: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG.
  6. LB 미디어 없이 레이블이 PCR 반응 관에 PCR 마스터 믹스의 10 µ L를 추가 합니다.
  7. 품 어 thermocycler 다음과 같은 조건에 반응: 30 94 ° C의 38 주기 5 분, 94 ° C의 1 사이클 s, 55 ° C 30에 대 한 s, 72 ° C 2 분; 10 분 동안 72 ° C의 1 주기.
    참고: 신장 시간 (72 ° C 단계) gRNA 식 카세트의 수로 증가 한다. 표 2 를 사용 하 여 삽입의 이론적인 크기를 계산 하 고 72 ° c.에 1kb 당 1 분 사용
  8. 로드 염료를 추가 하 고 1 %agarose 젤에 증폭 된 파편을 분석. 크기 조정에 대 한 적절 한 DNA 사다리를 로드 (1 kb DNA 사다리) 실행에 적합 한 젤 30 분 120 V에서 버퍼 (예를 들어, TLE 버퍼)를 실행 하 고.
  9. 사용 된 발기인, gRNA 건설 기계 및 수 N20 시퀀스의 개별 크기를 추가 하 여 표 2 의 도움으로는 amplicon의 이론적인 크기를 계산 합니다. 식민지 PCR의 결과에서 올바른 밴드 크기 및 올바른 벡터 항구 가능성이 있는지 여부에 따라 세균성 복제품을 식별 합니다.
  10. 해당 100 µ L 문화, 이전 설정으로 (100 µ g/mL 암 피 실린)와 2.5 mL 하룻밤 파운드 문화를 예방. 37 ° C 12 h에서 품 어.
  11. 상업적인 플라스 미드 미니 키트와 제조 업체의 지침31를 사용 하 여 플라스 미드 DNA를 추출 합니다.
  12. 다음 프라이 머를 사용 하 여 플라스 미드를 순서: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) 및 StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) 생어 시퀀싱에 의해.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

프로토콜에 따라 사용자 지정 된 멀티플렉싱 gRNA 벡터의 실현 (그림 1) 생성을 합니다. 6 다른 gRNA 카세트를 사용 하 여 STAgR 접근의 대표적인 결과 그림 2에 묘사 된다. 그림 2 A STAgR 조각 (3.1-3.3 프로토콜)를 사용 하는 PCRs의 전형적인 결과 보여줍니다. 6 amplicons (BB, S1-s 5) 그들의 끝에 개별 gRNA N20 시퀀스를 포함 하는 선형 DNA 조각을 나타냅니다. 플라스 미드 백본 (BB) gRNA1와 gRNA6의 대상 시퀀스와 지금 확장 하 고 따라서 두 개의 다른 PCRs (s 1과 s 5) 깁슨 어셈블리 (그림 2A, 표 3)에 필요한 오버랩을 소유한 다. 정화 후 벡터 및 삽입에 대 한 적어도 1 µ g의 DNA 수율을 얻을 수 있습니다.

깁슨 조립 후 세균 변환 100 700 세균성 식민지 발생 한다. 그림 2 B 식민지 PCR, 다음 6 gRNA 카세트와 STAgR 프로토콜을 통해 10 세균성 식민지의 대표적인 분석을 보여줍니다. 젤 전기 이동 법 3 클론 전체 어셈블리 (표 2)에 대 한 예상된 amplicon 크기를 보여을 나타냅니다. 다른 복제 가능성이 받은 STAgR 벡터를 포함 하는 1-5 gRNA 카세트, 한 복제 (그림 2B, No.18)는 빈.

figure-results-1
그림 1 : STAgR 뇌관 설계의 개요. 첫 번째 gRNA 번호와 건설 기계 있습니다 선택한 다음 gRNA 순서 및 발기인 및 마지막으로, 벡터의 어떤 종류를 사용 해야 합니다. 각 gRNA 감각 방향 및 일반적인 부분의 "scf-FP" 또는 "샘-FP" 시퀀스를 대상으로 하는 gRNA와 특정 앞으로 뇌관 설계 되었습니다. 마찬가지로, 개별 역 뇌관 해당 발기인 순서를 생성 하기 위해 (RP)은 융합 다음 gRNA의 네 20 시퀀스의 반전 보수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-2
그림 2 : 6 다른 gRNA 카세트를 사용 하 여 STAgR 접근의 대표적인 결과. (A) 5 삽입 벡터 STAgR_Tomato의 PCR의 대표적인 예입니다. STAgR 반응 샘 건설 기계 뿐만 아니라 hU6 및 mU6 발기인 및 정식 gRNA를 사용 하 여 x 6 (B) 식민지 PCR. 22 세균성 식민지의 7 나타났다 완전 한 어셈블리를 나타내는 예상된 밴드 분석 되었다. 사다리: 1 kb 플러스, 기본적인 쌍 (bp)에 숫자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

문자열 및 벡터에 대 한 입문서를 전달
scaffold_fwdGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT
SAM_fwdGTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGG
문자열 및 벡터에 대 한 역방향 뇌관
hU6_revCGGTGTTTCGTCCTTT
mU6_revCAAACAAGGCTTTTCTCCAAGG
hH1_revCTGGGAAAGAGTGGTCTCATACAGA
h7SK_revCCGAGGTACCCAAGCGG

표 1: 뇌관 시퀀스 gRNA 건설 기계 및 발기인.

발기인 및 건설 기계 크기입니다.
hU6265 혈압
hH1225 bp
mU6316 혈압
h7SK245 혈압
gRNA 비 계83 혈압
SAMloop + gRNA 발판143 혈압

표 2: 식민지 PCR 결과 계산 하려면 각 식 카세트의 이론적인 크기.

hU6hH1mU6h7SKSTAgR_NeoSTAgR_tdTomato
gRNA Scf400 bp360 혈압451 혈압380 혈압3722 혈압4487 혈압
샘460 혈압420 혈압511 혈압440 혈압--

표 3: 발기인 및 건설 기계 크기입니다.

hU6hH1mU6h7SKSTAgR_NeoSTAgR_tdTomato
gRNA Scf368 혈압328 혈압419 혈압348 혈압+74 bp+67 bp
샘428 혈압388 혈압479 혈압408 혈압

표 4: PCR 후 STAgR의 계산 된 크기.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기 우리가 현재 자세한 프로토콜 STAgR에 대 한 다양 한 크기의 gRNA 식 플라스 미드의 신속 하 고 간단한 세대 수 있습니다. 이 프로토콜 2-8 gRNA 식 카세트 (또는 두 MS2 RNA aptamers 없이)와 gRNA 플라스 미드의 원스텝 세대 gRNA 식 벡터 STAgR_Neo, 인간의 U6, 마우스 U6, 인간의 7sK와 인간 H1 발기인28 의 사용으로 사용 될 수 있습니다. ,3233. 이상 4 개의 카세트 바란다면 형식을 사용 하 여 두 개 이상의 다른 발기인/비 효율성을 증가 하는 것이 좋습니다. 다른 벡터, 발기인 및 발기인 조합으로 8 gRNA 카세트 수도 가능할 뿐; 그러나, 이것은 테스트 되지. 우리의 경험에서 방법은 안정적으로 그리고 reproducibly, 비록 우리는 중요 한 단계를 결정 하 고 문제 해결 전략 예상된 결과 즉시 발생 한다. 우리의 경험에서 몇 가지 단계는 접근의 성공을 위한 중추적인: 맨먼저, 그것은 깁슨 어셈블리 단계 (3:1)에서 벡터 백본 삽입의 올바른 어 금 니 비율을 사용 하는 것이 중요. 그러나, 우리는 일부 gRNA 집합에 대 한 벡터에 삽입의 1:1 비율 도움이 됩니다, gRNA 카세트 수 두를 초과 않도록 하는 경우에 것으로 나타났습니다. 둘째, 깁슨 어셈블리 반응의 기간을 충분히 긴 있어야 (적어도 45 분 권장).

STAgR 수정 많은 함께 사용할 수 있습니다. 대상 시퀀스, gRNA 숫자 및 건설 기계, 발기인 및 벡터 백본 사용자 지정 고 자유롭게 결합. 그러나, 각 조합에는 약간 다른 요구 사항이 있을 수 있습니다. 우리의 경험에서는, 중간 또는 높은 경우 gRNA 카세트의 숫자 (> 4) 원하는 하지만 얻지 못하면 즉시, 일반적으로이 문제를 극복 하는 가장 빠른 방법은 개별 gRNA 카세트는 벡터에서의 순서를 변경 하는. 마찬가지로, 다른 gRNA 발기인 및 건설 기계 결합 효율 향상 (그리고 따라서 득점 해야 식민지 PCRs의 필요한 수를 낮춘 다) 때 많은 gRNA 카세트 복제 됩니다. 우리는 잘못 된 클론 깁슨 조립 하는 동안 반복된 시퀀스의 자연 스러운 결합에 의해 일반적으로 생성 됩니다 발견. 이 방법의 효율성을 줄일 수 있습니다, 하지만이 또한 기능 gRNA 하위 집합28와 벡터의 동시 발생을 발생 합니다.

포함 하는 하나 이상의 gRNA 식 카세트 gRNA 벡터 멀티플렉싱의 세대 다른 방법21,22,23,,2425의 번호와 함께 보고 되었습니다. 26,27. 일부 고용 동시 또는 순차적 gRNA 쌍22,34의 복제를 하는 동안 다른 골든 게이트 어셈블리 및 여러 순차적 복제 단계25,35에 따라 달라 집니다. 특별 한 접근은 단일 조상 대 본36에서 여러 gRNAs를 잘라 생 세포 tRNA 처리 시스템을 채용 하 여 시 외.에 의해 사용 되었습니다. 이 방법의 advangetage는 하나의 발기인;의 요구 사항 단점은 각 gRNA 조합에 대 한 새로 합성된 DNA 파편의 필요성입니다. 각 gRNA 다중화 하는 방법에는 장점과 단점이; STAgR은 효율성, 낮은 비용으로 가능한 gRNA 카세트의 높은 번호와 단순을 결합합니다.

STAgR (와 다른 멀티플렉싱 시스템) 됩니다 (효율과 동시) 중단 여러 유전자에 vivo에서,의 사용에 zebrafish 두뇌28개척으로. GRNA 멀티플렉싱 벡터의 또 다른 미래의 응용 프로그램에는 유도 또는 단일 유전자의 진압에 대조적으로 완전 한 transcriptional 프로그램의 조작에 대 한 약속 이다. 아마, 이러한 방식을 변형 세포와 장기에는 그것이 가능한 오늘날 보다 훨씬 더 높은 학위를 허용할 것 이다.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자 교수 박사 스테판 벡과 교수 박사 Jovica Ninkovic 그들의 입력에 대 한 감사, 도움말 및 STAgR 메서드를 사용 하면 개발에 지원 하 고 싶습니다. Tobias Klötzer, 안 나 Köferle 하 고 유용한 의견에 대 한 발렌틴 바 우만. 작품은 DFG (STR 1385/1-1)에 의해 지원 되었습니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Phusion High-Fidelity DNA 중합효소NEBM0530LGibson 마스터 믹스용 중합효소 및 모든 PCR용
dNTP LifeTechnologyR0191dNTP 모든 PCR용
dATPLife TechnologyR0141dNTP Gibson 마스터 믹스용
dCTPLife TechnologyR0151dNTP Gibson 마스터 믹스용
dGTPLife TechnologyGibson 마스터 믹스용R0161
dTTPLife TechnologyGibson 마스터 믹스용R0171
AgaroseVWR443666A,
DpnI,NEB,R0176S
AMPure XP 비드,Beckman CoulterA63881, DNA 클린업용
Tris HCLRoth9090.2Gibson 마스터 믹스
DTTGibson 마스터 믹스
PEG 8000VWRRC-077Gibson 마스터 믹스
NADCayman Chemicals Company16077Gibson 마스터 믹스
T5 엑소뉴클레아제NEBM0363SGibson 마스터 믹스
Taq DNA LigaseNEBM0208SGibson 마스터 믹스
AmpicilinSigmaAldrichPHR1393-1G
DNA Ladder 1 kb PlusThermo ScientificSM0311
플라스미드 미니 키트Thermo ScientificK0503
플라스미드 및 프라이머 염기서열모든 염기서열은 Figshare(https://goo.gl/UGdc3Q)에서 사용 가능합니다.
MgCl2Gibson Master Mix
Top10 화학적 유능 박테리아Thermo ScientificC404003
SOC 매체Thermo Scientific15544034
효모 추출물SigmaAldrichY1625 용원 육수(LB Media)
NaClSigmaAldrichS7653용원 육수(LB Media)
펩톤SigmaAldrich91249용원 육수(LB Media)
한천SigmaAldrich5040용원 육수(LB Media)
Taq DNA 중합효소Quiagen201203
dNTP,, dNTP, , , 용TLE 버퍼 용 EDTA PanReacAppliChem 6381-92-6 용 한천-

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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