이 프로토콜은 다중 색상 4D (타임 랩스 3D) 공초점 현미경을 사용하여 신진 효모에서 형광 표지 된 세포 내 구획의 분석을 설명합니다. 이미징 매개 변수는 광손상을 제한하면서 적절한 신호를 캡처하도록 선택됩니다. 사용자 정의 ImageJ 플러그인은 레이블이 지정된 구조를 추적하고 정량적으로 분석할 수 있도록 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜의 목표는 막 구획이 신진 효모의 살아있는 세포에서 어떻게 형성되고 변형되는지 특성화하는 것입니다. 효모에 있는 많은 세포내 구획은 역동적이고, 그들의 속성의 완전한 이해는 시간 경과 화상 진찰을 요구합니다. 다색 4D 공초점 형광 현미경 검사법은 5-15 분의 시간 척도로 세포 내 구획의 동작과 구성을 추적하는 강력한 방법입니다. 섹션. 이를 위해 매우 낮은 레이저 전력으로 빠르게 스캔하여 광표백 및 광독성을 최소화하고 픽셀 크기와 Z-스텝 간격을 최대 해상도로 이미지 샘플링과 호환되는 가장 큰 값으로 설정합니다. 결과 4D 데이터 세트는 시끄러우지만 데컨볼루션으로 평활할 수 있습니다. 높은 품질의 데이터를 가지고 있더라도 세포내 구조는 종종 수,이질성 및 이동이 기때문에 분석 단계는 도전적입니다. 이러한 요구를 충족하기 위해 사용자 지정 ImageJ 플러그인은 컴퓨터 화면의 4D 데이터를 배열하고, 관심 있는 구조를 식별하고, 개별 구조를 격리하기 위해 데이터를 편집하고, 형광 시간 과정을 정량화하고, 투영된 Z 스택의 동영상을 만들기 위해 작성되었습니다. 4D 동영상은 안정적인 구획과 성숙에 의해 뒤집어발생하는 일시적인 구획을 구별하는 데 특히 유용합니다. 이러한 영화는 또한 구획 융합과 같은 이벤트를 특성화하고 특정 돌연변이 또는 다른 섭동의 효과를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.
서론
endomembrane 시스템의 구획은 일정한 유속에 있고, 그들의 전체 특성은 살아있는 세포 화상 진찰을 요구합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 4D(time-lapse 3D) 공초점 현미경을 사용하여 신진 효모에서 형광으로 표지된 구획을 시각화하는 프로토콜입니다. 이 방법은 피키아 목회와 사카로마이세스 세레비시아1,2,3의분비구의 역학을 추적하기 위해 개발되었다. 이 프로토콜은 개별 시스터네이가 광학적으로 해결할 수있는 비 스택 골지가있는 S. cerevisiae에 초점을 맞춥니다4. S. cerevisiae에 있는 특이한 Golgi 조직은 4D 현미경 검사법에 의하여 Golgi cisterna가 처음에 상주 초기 골지 단백질로 레이블을 붙였다는 것을 가능하게 하고, 그 때 상주 늦은 Golgi 단백질을 취득하는 동안 그 단백질을 분실합니다3 ,5. 이러한 전이가 초기 골지 단백질 Vrg4가 GFP로 표지되는 균주....
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프로토콜
1. 준비
- 비형광 최소한의 NSD 매체2를 확인합니다. 리보플라빈의 부재는 배경 세포 내 녹색 형광 및 관련 광 독성을 감소시킬 것으로 예상된다.
- 효모 균주를 ~23°C에서 하룻밤 동안 성장시키고 5 0mL NSD에서 로그내믹 상으로 50 mL의 배플플라스크에서 좋은 폭기를 갖는다. 분석 하기 전에 약 3-4 시간, 최종 OD600 이미징 시에 0.5-0.8 될 것 이다 있도록 신선한 NSD에서 효 모 배양 희석.
- concanavalin A (ConA)의 2 mg / mL 용액을 준비하십시오. 원하는 경우, 액체 질소에이 용액의 aliquots를 동결 하 고 -80 °C에서 저장 합니다.
- 미세 원심 분리기에서 최대 속도로 5분 동안 ConA 용액을 회전하여 이미징을 방해할 수 있는 미립자 물질을 제거합니다. 그런 다음 깨끗한 35mm 커버 글래스 바닥 현미경 접시에 상급제 250 μL을 추가하십시오. 15 분 후, dH2O의 2 mL로 2-3 회 씻고 건조시키십시오.
- ConA 코팅 접시에 효모 배양 250 μL을 추가하고 세포가 부착 될 때까지 10 분 간 기다린 다음 2 mL NSD로 2-3 회 부드럽게 씻으십시오. 2 mL 신선한 NSD로 세....
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결과
여기서 제시된 예는 이중 색상 4D 공초점 현미경 3에 의해 가시화된 바와 같이 두 효모골지 시스터네이의 성숙도를 정량화한다. 효모 세포는 10-15 골지 시스터네의 순서에 포함, 각각의 약의 시간 과정을 통해 성숙 2-4 분. 성숙은 GFP와 초기 골지 마커 Vrg4를 태그하고 빨간색 형광으로 후반 골지 마커 Sec7을 태그하여 시각화 할 수 있습니다 mCherry 또는 mScarlet과 같은 단백질. 개별 시스터나 라벨은 Vrg4 마커로 처음에 표시한 다음 마커가 교환되는 간단한 전환을 거쳐 Sec7 마커로 레이블을 지정합니다.
세포에는 매우 이동성이 있는 여러 골지 시스터네이가 포함되어 있기 때문에 전체 라벨링 기간 동안 개별 시스테르나(cisterna)를 따르는 것은 쉽지 않습니다. Cisternae는 이미지 데이.......
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토론
효모 세포기관의 4D 공초점 이미징은 여러 매개 변수를 주의 깊게 조정해야 합니다. 주요 관심사는 광표백 및 광독성입니다. 일반적인 4D 영화는 수천 개의 광학 섹션을 수집하는 것을 포함하므로 레이저 조명을 가능한 한 낮게 유지해야 합니다. 탠덤 형광 단백질 태그는 태그된단백질(16,17)의발현을 증가시키지 않고 신호를 증진하는데 사용될 수 있다. 스캔 속도를 최대화하면 광손상을 제한할 수 있으며 Z-스택을 짧은 간격으로 캡처할 수 있습니다. XY 및 Z 모두에서 나이퀴스트 한계에 있는 복셀 크기는 광 노출을 최소화하는 동시에 이론적으로 광학설정(18)에서 사용할 수 있는 정보를 복구한다. 결국, 광학 섹션의 신호 함유 영역내의 각 복셀은 일반적으로 1-3개의 광자만 수신한다. 이 양의 정보는 단일 Z 스택으로 최적의 이미징을 위해 일반적으로 권장되는 정보보다 훨씬 낮습니다. 그러나.......
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공개 사항
저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 NIH 교부금 R01 GM104010에 의해 지원되었다. NIH 가 지원하는 암 센터 지원 교부금 P30 CA014599에 의해 지원되는 통합 현미경 코어 시설에서 비타스 빈도카스와 크리스틴 Labno에 형광 현미경 검사법에 대한 지원을 주셔서 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 35 mm 유리 바닥 접시 No. 1.5 | MatTek | P35G-0.170-14-C | 이미징 접시 |
| Concanavalin A 분말 | Sigma-Aldrich | C2010 | |
| Trolox | Vector Laboratories | CB-1000 | |
| Leica SP8 컨포칼 현미경 | Leica Microsystems | ||
| Leica 애플리케이션 스위트 X | Leica Microsystems | 현미경 소프트웨어 | |
| Huygens Essential 소프트웨어, 버전 17.04 | Scientific Volume Imaging | Deconvolution 소프트웨어 | |
| ImageJ | NIH | 이미지 처리 및 분석 소프트웨어 |
참고문헌
- Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris. Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).
- Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. 4D confocal imaging of yeast organelles. <....
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재인쇄 및 허가
