방법 논문

HIV 관련 간 병인을 위한 이중 인간화 TK-NOG 마우스 모델 구축

DOI:

10.3791/58645

⸱

2019년 9월 11일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Experimental Neuroscience, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Pathology and Microbiology, University of Nebraska Medical Center

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 인간 면역 계통 및 간 세포 둘 다로 인간화한 마우스를 설치하는 믿을 수 있는 방법을 제공합니다. 인간 간세포 및 CD34+ 조혈 줄기 세포의 경내 주사를 통해 달성된 이중 재구성 면역 결핍 마우스는 인간 면역 결핍 바이러스-1 감염에 취약하고 관찰된 바와 같이 간 손상을 재현합니다. HIV에 감염된 환자.

초록

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인간 면역 결핍 바이러스-1 (HIV-1)에 감염된 환자의 기대 수명이 증가했음에도 불구하고 간 질환은 이환율의 일반적인 원인으로 나타났습니다. HIV-1에 기인한 간 면역 병리학은 애매하게 남아 있습니다. 인간 간세포및 인간 면역 계통을 가진 작은 이종이식 동물 모형은 질병의 병인의 인간 생물학을 되풀이할 수 있습니다. 본 명세서에서, 프로토콜은 인간 간세포 및CD34+ 조혈줄기/전구세포(HSPC) 이식을 통해 이중 인간화된 마우스 모델을 확립하고, HIV 감염 환자에서 관찰된 바와 같이 간 면역병리학을 연구하기 위해 기술된다. 이중 재구성을 달성하기 위해, 남성 TK-NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg (Alb-TK)7-2/ShiJic) 마우스는 쥐 형질전환 간 세포를 제거하기 위해 간시 클로비르 (GCV) 투여량으로 복강 내 주입, 그리고 비 myeloablative 컨디셔닝을위한 treosulfan, 둘 다 인간 간세포 (HEP) 생착 및 인간 면역 체계 (HIS) 개발을 용이하게합니다. 인간 알부민(ALB) 수준은 간 생착에 대해 평가되고, 유세포측정에 의해 검출된 혈액내 인간 면역 세포의 존재는 인간 면역 계통의 확립을 확인한다. 여기에 설명된 프로토콜을 사용하여 개발된 모델은 HIV-1 감염으로 인한 간 손상의 여러 구성 요소와 유사합니다. 그것의 설립은 간염 바이러스 공동 감염의 연구 결과 및 항 바이러스 및 항 레트로 바이러스 약물의 평가에 필수적인 증명할 수 있었습니다.

서론

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항 레트로 바이러스 치료의 출현 이후, HIV-1 단독 감염과 관련된 사망이 상당히 감소했습니다. 그러나, 간 질환은 HIV 감염 환자에서 이환율의 일반적인 원인으로등장하고있다 1,2. HIV-1 감염을 가진 간염 바이러스의 공동 감염은 미국에 있는 HIV 감염한 사람의 10% - 30%를 차지하는 일반적입니다3,4,5.

HIV-1 및 간염 바이러스의 호스트 특이성은 인간 특정 전염병을 연구하거나 HIV-1 관련 간 병인의 다중 양상을 조사하기 위하여 작은 동물 모형의 유용성을 제한합니다. 인간 세포 및/또는 조직(인간화마우스 모델이라고 불등)의 생생을 허용하는 면역결핍 마우스는 전임상연구에서6,7,8에허용되는 동물 모델이다. 2000 년대 초반에 인간화 된 마우스의 도입 이후, 담즙 정체 인간의 간 독성의 여러 전임상 연구, HIV-1 및 HIV 관련 신경 인지 장애를 포함한 인간 특정 병원체, 엡스타인 바 바이러스, 간염, 기타 감염성 질환은, 이들 마우스6,9,10,11에서조사되었다. CD34+ HSPC 및/또는 인간 간세포 이식에 대한 다중 마우스 모델은 오랫동안 개발되어 왔으며 시간이 지남에 따라 B형 간염 바이러스(HBV)-관련 간 질환의 질병 발병기전을 연구하기 위해 개선되었습니다12. 13세 , 14. HSPC 및 인간 간세포 (HEP) 이식에 대한 여러 모델은 NOG (NOD)로 알려진 균주를 기반으로합니다. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13,NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15,Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12,및 fah-/- NOD rag1-/- il2rγnull 마우스16. 그러나 각 모델에는 고유한 장점과 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, BALb/C-Rag2-/- γc-/- 배경상에 있는 HEPs 및 인간 줄기 세포(HSC)를 위한 AFC8 이중 인간화 마우스는 면역 세포와 HSC의 성공적인 생착을 가능하게 하지만 항원 특이적 T-및 B 세포의 부재가 있습니다. 이 모델12의응답 . 이중 인간화 마우스를 재구성하는 주요 관심사는 최적이 아닌 생착, 다른 조직을 지원하기위한 적합한 모델의 부족, 불일치 조건, 면역 거부, 또는 이식편대- 숙주 질환 (GVHD) 및 기술 신생아와 함께 위험한 조작과 신진 대사 이상으로 인한 높은 사망률과 같은 어려움13.

인간화마우스는17, 18,19년동안 HIV 연구에 사용되어 왔지만, HIV-1에 의한 간 손상을 연구하기 위해 인간화된 마우스의 사용은20개에제한되어 왔다. 우리는 이전에 이중 인간화 TK-NOG 마우스 모델의 설립과 HIV 관련 간 질환에 그것의 응용 프로그램의설립을보고 8. 이 모형은 간 및 면역 세포의 강력한 생착을 보여주고 HIV 감염 병인을 되풀이합니다. 이 토론은 인간 간세포의 이식에 있는 가장 중요한 단계를 포함하여 상세한 프로토콜을 제출합니다. HEPs의 성공적인 생착 및 TK-NOG 마우스에서 기능성 면역 계통의 확립에 필요한 HSPC에 대한 설명도 제시된다. HIV 관련 간 면역요법을 연구하기 위하여 이 마우스의 사용은 상세한입니다. 간특이적 포진심플렉스 바이러스 타입 1티미딘 키나아제(HSV-TK)를 운반하는 TK-NOG 수컷 마우스가 이식유전자를 사용한다. 이 이식유전자를 발현하는 마우스 간 세포는 GCV의 비독성 용량에 잠깐 노출된 후에 쉽게 절제될 수 있다. 이식된 인간 간 세포는 외인성 약물 없이 마우스 간 내에서 안정적으로유지된다(21). 마우스는 또한 인간 세포에 대한 마우스 골수에 틈새 시장을 만들기 위해 treosulfan의 비myeloablative 복용량으로전제조건8. 면역결핍 TK-NOG 마우스는 HEPs 및 다능성 HSPC로 경내 주사된다. 마우스는 혈액 면역 phenotyping 및 혈청 인간 알부민 수준의 측정에 의해 혈액과 간 재구성을 위해 정기적으로 모니터링됩니다. 인간 면역 세포와 HEPs 둘 다에 대해 15% 이상의 성공적인 재구성을 가진 마우스는 복강 내 HIV-1로 주입됩니다. 간장에 대한 HIV의 효과는 감염 후 4 - 5 주 일찍 평가 할 수 있습니다. HIV-1이 사용되기 때문에 바이러스를 처리하고 마우스에 주입하는 동안 필요한 모든 예방 조치를 취해야합니다.

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프로토콜

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이 프로토콜은 네브래스카 대학 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

참고: 동물 실험을 수행하기 전에 현지 IACUC의 승인을 얻으실 수 있습니다.

1. 배꼽 제대혈 의 처리 와 인간 HSPC의 격리

  1. 층류 캐비닛의 멸균 조건하에서 프로토콜의 모든 단계를 수행합니다.
  2. 헤파린화 된 튜브에서 수집 된 탯줄 혈액 (CB)을 취하고 인산염 완충 식염수 (PBS)를 추가하여 최대 35 mL의 부피를 만듭니다. 그림 1에 도시된 바와 같이 림프구 분리 배지(LSM) 위에 샘플을 층화하고 4°C에서 4°C에서 35분 동안 400 x g의 적층 CB로 LSM을 원심분리합니다.
    참고 : 인터페이스에서 혼합하지 않도록 조심스럽게 부드럽게 혈액을 희석.
  3. 상부 LSM 및 플라즈마 층을 조심스럽게 제거하고 전사 파이펫을 사용하여 흰색 버피 코트 인터페이스를 새 튜브로 옮김을 옮김을 옮김을 제거합니다.
  4. 30- 40 mL의 얼음-차가운 완충제(PBS + 0.5% 소 혈청 알부민 [BSA] + 2 mMM에 에틸렌디아미네테트라아세트산 [EDTA])에 버피 코트를 다시 중단시켰다. 파이펫을 사용하여 셀 서스펜션의 20 μL과 0.4% 트라이판 블루 및 피펫 10 μL의 혼합물을 카운팅 슬라이드의 두 챔버 중 하나의 외부 개구부로 결합하고 셀을 계수하는 자동화된 셀 카운터에 슬라이드를 삽입합니다.
    참고: 세포를 생존할 수 있도록 모든 단계에서 얼음 처럼 차가운 버퍼를 사용 하십시오.
  5. 세포를 300 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하고 상월체를 조심스럽게 흡인한다. 그런 다음 300 μL의 얼음 차가운 버퍼를 추가합니다.
  6. 최대 1 x 108 셀에 대한 인간 Fc 수용체 차단 시약 100 μL 및 단일 클로날 마우스 항 인간 CD34 항체 공액 마이크로 비드 100 μL을 추가합니다 (재료 표참조). 4 °C에서 30 분 동안 배양하고, 세포를 세척하기 위해 얼음 차가운 완충액 10 mL을 추가하고, 4 °C에서 10 분 동안 300 x g에서 원심 분리기를 추가합니다.
    참고: 1 x 108 셀이 존재하는 경우 셀 수에 따라 이 것을 확장하십시오.
  7. 상판을 조심스럽게 제거하고 500 μL의 버퍼로 펠릿을 다시 일시 중단하고 자성 분리 단계를 진행하여 HSPC를 풍부하게합니다.
  8. 자기 활성화 셀 정렬 필드에 양수 선택 LS 열(재료 표참조)을 배치하고 3mL의 버퍼로 통과합니다.
  9. 샘플에서 인간 CD34+에 결합된 마이크로비드를 포획할 수 있는 LS 컬럼에 샘플을 로드하고 중력의 영향으로 수집 튜브로 흐르도록 합니다.
  10. 완충액으로 컬럼 3x를 세척하고 CD34의 동일한 수집 튜브에서 용루를 수집- 세포의 분율.
  11. CD34+ 셀을 새 컬렉션 튜브에 용해시키기 위해 5 mL의 버퍼로 컬럼을 급락시다. >90%의 순도를 달성하기 위해 절차를 반복합니다.
  12. 혈세포계에서 트라이판 블루 염료를 사용하여 용출 된 CD34+ 세포를 계산합니다. 계산 한 후 CD34+ 세포를 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리하고 상한자를 버립니다.
  13. 동결 배지에서 1-2백만/mL의 농도로 세포를 이식또는 냉동 보존에 즉시 사용할 주사를 위해 PBS의 25 μL에CD34+ 세포를 다시 일시 중단합니다(로스웰 파크 기념 연구소 매체 [RPMI 1640 배지] + 50% 태아 소 혈청 (FBS) + 10 % 디메틸 설폭사이드 [DMSO]) 이식에 추가 사용을 위해.
    참고: 이식에 사용하기 전에 항상 생존 가능한 세포를 다시 이야기하십시오.
  14. CD34+ 용황의 순도를 확인하려면, 현탁액의 50 μL을 취하고 4 °C에서 30 분 동안 PE 컨쥬게이트 항 인간 CD34 항체의 10 μL로 배양하십시오. 항체 배양 후, 염색된 세포를 PBS로 세척하고, PBS의 100 μL에서 이를 재중단한 다음, 유세포측정을 진행한다. 유세포계에서 게이트를 설계하기 위해 항체가 없는 세포의 튜브를 추가합니다.
  15. 수집 후, 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC) 플롯에서 관심 영역을 선택한 다음 FSC 영역 및 FSC 높이 플롯에서 단일 셀에 대한 게이팅을 선택하여 데이터를 분석합니다. PE 채널 및 SSC 영역 플롯에서 단일 셀에 게이트 CD34 양성 세포.

2. 이식용 인간 간세포 의 준비

  1. 액체 질소에서 냉동 보존 된 간세포를 제거하고 수조에서 유리병을 신속하게 침수하고 약 90 - 120 s용 해동하십시오.
  2. 바이알 캡을 제거하고 해동된 간세포를 데운 해동 매체의 50 mL 원엽 튜브에 붓습니다.
  3. 50 mL 튜브를 몇 초 동안 손으로 흔들어 세포를 일시 중단하십시오.
    참고: 튜브를 소용돌이하지 마십시오.
  4. 실온에서 8 분 동안 100 x g에서 세포를 펠렛. 0.1% BSA로 PBS에서 펠릿 세포를 세척하고 80 μL/마우스의 최종 부피에서 PBS에서 신선하거나 해동된 HSPC(비율 10:1)로 풀을 합니다.

3. 인간 HSPC 및 간세포 이식에 대한 동물 취급, 선별, 지질 기능 미성년 및 치료

  1. 동물 취급
    1. 심한 면역 결핍의 결과로, 품종, 집, 무균 조건하에서 TK-NOG 마우스를 처리.
    2. 항상 실험실 코트, 장갑, 신발 커버 및 잠재적으로 병원성 미생물과의 감염을 방지하기 위해 얼굴 마스크를 착용하십시오.
    3. 수술에 멸균 장갑과 악기를 사용하고 수술 내내 동물을 무균처리하십시오.
  2. 실험을 위한 TK-NOG 마우스 선택
    1. TK-NOG 균주 콜로니를 수컷 비-TK-NOG 리터메이트와 암컷 TK-NOG 마우스를 사육하고 유전자 변형에 의해 형질전환 자손을 선택한다.
      참고: 유질 검사를 수행 (단계 참조 3.3) 유동시에 신생아 남성 및 여성 마우스에서 이식 유전자의 존재 또는 부재를 결정합니다.
    2. HSV-TK 이식유전자 발현 간세포21의GCV 매개 고갈에 대한 높은 민감도 로 인해 이식에 대한 6-8주에서 남성을 선택한다.
    3. 귀 태그 마우스를 귀 에 이의를 쉽게 식별하기 위해 위닝 또는 수술시. 동물의 체중과 건강 상태를 기록하십시오.
  3. 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응을 이용한 HSV-TK 이식유전자의 존재에 대한 유전자 변형
    1. (일반적으로 3 - 4 주에) 위닝시 에 헤비 티핑을 수행합니다. 게노티핑의 경우, 마우스 귀의 조각을 층류 생물학적 안전 캐비닛에 잘라 멸균을 유지하고 게놈 DNA 분리 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추출합니다.
    2. 20 μL 반응 혼합물에서 귀조각에서 추출된 게놈 DNA증폭은 HSV-TK 트랜스유전자를 위해 인간 알부민 프로모터의 제어하에 1 μL의 전방 프라이머 5'-CCATGCACGTCTTTGG-3', 1 μL의 역프라이머 5'-TAAGTTGCGCGCGCGC-3', 0.5l의 FAM 프로브 5′-FAM-AATCGCCCCGC-3', 및 실시간 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)계측기(22)에대한 마스터 믹스의 10 μL.
    3. 다음과 같이 실시간 PCR 설정을 설정합니다: 30s에 대한 60°C(프리레드 스테이지), 10분 동안 95°C(홀드 스테이지), 15s용 95°C의 40°C, 1분 동안 60°C(PCR 단계), 30초용 60°C(포스트레드 스테이지).
      참고: 임계값(Ct)의 주기는 HSV-TK 이식유전자에 대해 양성으로 간주됩니다.
  4. 간시클로비르와 트레오술판을 이용한 치료
    1. 27 G 바늘을 사용하여, TK-NOG 마우스를 복강 내 GCV 주사로 주입 (6 mg/kg) 하루에 2 x 7 일째에 및 식염수의 100 μL에 5 에 100 식염수의 생쥐의 형질 전환 실세포를 고갈 (그림 2의실험 전략에 도시 된 바와 같이)23 .
    2. 수술 전 3일, 2일 및 1일, 27 G 바늘을 사용하여 식염수 100 μL에서 treosulfan (1.5 g/kg/day)의 비근육내 투여량으로 마우스를 미리 조건화한다.
    3. 수술 하루 전, 5 mm 랜싯으로 찌르면 하악 정맥에서 혈액을 2 ~3 방울 (~100 μL)하고, 알라닌 아미노 트랜스퍼 라제 (ALT)를 평가하기 위해 원심 분리 (4 °C에서 10 분 동안 1,500 x g)로 혈청을 분리합니다. 간 손상의 ee.
  5. 수술 준비
    1. 수술 전에 클리퍼를 사용하여 절개 부위(복막 벽 왼쪽)를 둘러싼 마우스의 털을 면도합니다.
    2. 마우스 마취 기계를 사용하여 유도 챔버에서 산소 흐름을 1 L / min으로 조정하고 이소플루란 흐름을 3 % - 5 %로 조정하십시오. 마취를 위한 유도 챔버에 한 번에 한 개의 마우스를 놓습니다.
    3. 멸균 연장 튜브의 한쪽 끝(현탁액 의 보유 용량 550 μL; 사양에 대한 재료 표 참조)을 30G 바늘에 연결하고 다른 쪽 끝은 1mL 주사기에 부착합니다.
    4. 풀링된 HEPs 및 HSPC(섹션 2 참조)의 서스펜션(80 μL/mouse)으로 주사기를 채우고, 반복적인 디스펜싱 파이펫의 노치에 주사기를 맞추고, 디스펜서를 조정하여 각 프레스에서 10 μL을 분배합니다.
    5. 일단 마우스가 마취되면 (보통 3 - 4 분 후), 이소플루란 흐름을 코콘으로 전환하고 이소플루란 유량을 2 % - 3 %로 줄입니다.
  6. 마우스에 있는 인간 HSPC 그리고 간세포의 경내 이식
    1. 멸균 조건하에서 층류 캐비닛에서 모든 수술 단계를 수행합니다.
    2. 깨끗한 멸균 드레이프를 작업 표면에 놓고 각 마우스의 왼쪽을 10 % 포비도 요오드로 문질러 70 % 이소 프로필 알코올을 제거한 다음 절개를하십시오.
    3. Vanna의 형 가위로 복막 벽 왼쪽의 피부, 근육 및 복막에 작은 절개 (~1 - 1-1.5 cm 및 깊이 5mm)를 만들어 흉막 케이지의 아래쪽 가장자리보다 약 5mm 아래복 구멍에 들어갑니다.
    4. 비장을 찾아서 집게로 약간 당겨 서 쉽게 접근할 수 있도록 30G 바늘을 비장의 하부 기둥에 삽입합니다.
    5. 디스펜싱 파이펫의 플런저를 잠금 해제하고 비장당 60 ~ 80 μL의 제한으로 한 번에 부피 10 μL을 분배합니다. 바늘을 천천히 후퇴시키고 결찰 을 사용하여 클립을 결찰하여 비장을 클립합니다.
    6. 멸균 된 PBS로 적신 면 팁 어플리케이터로 비장을 다시 신체 구멍으로 밀어 넣습니다.
    7. 흡수성 봉합사 중단 봉합사 패턴을 사용하여 복벽의 근육 층을 닫습니다 (연속적이지 않음). 흡수할 수 없는 봉합사를 사용하여 중단된 봉합사 패턴으로 피부 폐쇄를 달성합니다.
    8. 수술 후 저체온증으로부터 마우스를 보호하기 위해 따뜻한 물 순환 패드를 사용합니다.
    9. 수술 후 10-14일 후에 흡수할 수 없는 봉합사를 제거하십시오.
  7. 수술 후 치료
    1. 이식된 동물이 깨어나면, 진통 부프레노르핀(0.1 mg/kg)을 복강 내로 주입하고, 하루 에 2회 연속 3일 동안 주사하십시오.
    2. 동물이 정상적인 신체 상태로 돌아올 때까지 하루에 적어도 1 회 관찰하십시오.
      참고: 일부 마우스는 수술 후 체중을 잃을 수 있기 때문에 각 동물의 체중을 확인합니다. 마우스는 전형적으로 1 2 주에 있는 그들의 본래 무게를 회복합니다.

4. ELISA에 의한 인간 간 이식 검증 및 유세포 측정에 의한 인간 면역 체계

참고: 인체 간 및 면역 계통의 재구성을 매달 평가하고, 효소 연계 면역흡착 분석(ELISA) 및 유세포 분석에 의한 이식 후 1개월 후부터 각각 평가한다.

  1. EDTA 관에 있는 랜싯을 사용하여 하정맥 정맥에서 혈액 샘플을 수집하고, 4°C에서 10분 동안 1,500 x g에서 원심분리기를 채취합니다. 인간 알부민 수준을 확인하기 위해 인간 알부민 수준을 확인하여 인간 간이식 에 대한 마우스 간 생착 효율을 평가하고, 인간 알부민 ELISA 정량 세트(재료 표참조)를 이용하여 제조사의 지침.
    참고: 펠릿을 폐기하지 말고 유세포 분석용 펠릿 세포를 사용하여 인간 면역 체계 재구성을 평가한다.
  2. FACS 완충액(PBS + 2% FBS)의 35 μL에서 혈청 없이 세포 펠릿을 다시 일시 중단하고 5 μL의 마우스 특이적 CD45(농도 0.5 mg/mL), 5 μL로 염색했습니다. 각 인간 특이적 항체 CD45(0.1 mg/mL), CD3(0.2 mg/mL), CD8(0.1 mg/mL), CD19(0.5 mg/mL) , CD4(0.25 mg/mL) 및 CD14(0.25 mg/mL)의 20 μL을 각각 4°C에서 30분 동안,CD34+ HSPC로부터 기능성 면역 체계의 발달을 점검하였다.
    참고: 염색되지 않은 세포의 게이팅을 결정하기 위해 얼룩이 없는 세포의 튜브를 하나 더 추가하는 것을 고려하십시오.
  3. 배양 후, 폴리스티렌 바닥 유동 세포 분석 튜브에 스테인드 서스펜션(~100 μL)을 옮기고 1x 용해 완충액 2mL(재료 표참조)를 사용하여 10x 용해 완충제의 1부분을 희석하고 9부분의 증류수와 배양 10-0-0 적혈구를 15 분 동안 적혈구를 포리합니다.
    참고 : 적혈구 포액을 평가하기 위해 탁도를 관찰하십시오. 샘플이 명확해지면, lysis가 완료됩니다.
  4. 용해 후, 펠릿을 얻기 위해 4°C에서 300 x g에서 300 x g에서 FACS 완충제 3 mL을 첨가한다. 펠릿 및 원심분리기에 3 mL의 FACS 버퍼를 추가하여 세척을 반복하고 300 x g에서 4°C에서 5분 동안.
  5. 새로 만든 1% 파라포름알데히드(PFA)에서 세포를 고정시키고 유동 세포계에 염색된 세포를 획득하고, 유량 소프트웨어로 분석하였다.
  6. 분석을 위해 FSC/SSC 플롯에서 림프구 게이팅을 선택한 다음 FSC 영역/FSC 높이에서 단일 셀 게이팅을 선택합니다.
  7. 또한, 단일 세포 집단상인간 특이적 CD45(hCD45)에 대한 게이트및 뮤린 기원의 세포의 배제를 위한 마우스 특이적 CD45(mCD45)를 포함한다. 스테인드 되지 않은 세포의 게이팅에 따라 스테인드 집단의 게이팅을 전략화합니다.
  8. 게이트 hCD45+ 셀은CD3+ T 세포 및 CD19+ B 세포의 빈도를 결정한다. 게이트 T 셀은 CD4 및 CD8 서브세트를 결정한다. 단핵구를 평가하기 위해 hCD45의 게이트를 사용하여 CD14+ 단핵구를 결정합니다.

5. TK-NOG 마우스의 HIV 감염과 인간의 간 및 면역 체계에 미치는 영향

  1. 지정된 생물 안전 수준 2 시설에서 HIV-1 바이러스 및 모든 감염된 마우스를 처리합니다.
    주의 사항: 이중 생물학적 위험 봉투에 모든 HIV 감염 폐기물을 오토클레이브하고 폐기하십시오. 안전상의 이유로, HIV에 감염된 마우스를 건네면서 절단 방지 장갑을 착용하십시오.
  2. 바이러스를 다루는 동안 일회용 커버올 가운, 신발 커버, 얼굴 마스크 및 이중 장갑을 포함한 개인 보호 장비(PPE)를 항상 착용하십시오.
  3. 인간 CD45+ 세포의 15% 이상의 재구성을 가진 마우스를 선택(단계 4.7에서 시험) 및 HIV-1 감염을 위한 혈청에 인간 알부민의 존재 (단계 4.1에서 시험).
  4. 마우스를 1 x 103 대 1 x 104 조직 배양 전염성 용량 50 (TCID50)HIV-1ADA를 마우스 당 100 - 200 μL의 부피로 주입하고 복강 내로 주입한다.
  5. 이소플루란(isoflurane)을 사용하여 감염 후 5주 동안 HIV에 감염된 마우스를 안락사시킵니다(이소플루란 증기 농도 >5%).
  6. 마우스를 안락사 한 후, 혈청의 격리를위한 심장 천자에 의해 EDTA 튜브에 혈액을 수집, ELISA에 의해 인간 특정 알부민 수준을 평가하여 간HIV-1의 효과를 볼 수 (단계 4.1 참조) 및 혈액 세포는 인간의 면역의 변화를 확인 유세포 분석기를 사용하는 세포(단계 4.2 - 4.8 참조).
    참고: 마우스가 감염되었는지 확인하기 위해 바이오 분석기에서 감염 후 5 주 말초 바이러스 부하를 평가하십시오.
  7. 혈액을 뽑은 후 안락사 된 마우스에서 간을 절제하십시오.
  8. 간 절제의 경우, 자시포이드에서 피부, 근육 및 복막에 1.5 - 2cm 길이 및 0.5 cm 깊이의 절개를하여 복강을 노출하십시오. 간과 횡격막 사이의 척추에 수직으로 절단합니다. 간을 들어 올리고 위장과 내장에 부착하는 막을 끊습니다.
  9. 하룻밤 동안 4% 파라포름알데히드에서 간을 수집하고 고치고 표준 면역성 화학 프로토콜을 따라 인간 특이적 CK18 항체8을사용하여 CK18+ 간세포에 대한 HIV의 효과를 평가하였다.

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결과

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인간의 간 및 면역 세포를 가진 이중 인간화 마우스 모형의 설치는 각각 아주 간단한 ELISA 및 유세포 측정을 가진 각 단계에서 쉽게 감시될 수 있습니다. 유세포측정은 기능성 면역 계통의 발달을 평가하고 면역 세포에 대한 HIV 감염의 효과를 보기 위해 정기적으로 수행된다. 이중 인간화 마우스에서 기능성 면역 세포의 발달은 림프구 게이트의 15 %에서 90 %까지 다양할 수 있습니다. 면역 세포의 대표적인 서브세트는 도트 도표에 나타내다(그림3). 인간 간세포의 생착의 평가를 위해, 인간 특이적 알부민 수준에 대한 ELISA는 마우스 혈청에서 매월 수행된다. HSPC 와 HEPs 둘 다로 이식된 마우스는 한 달에 ~ 7 μg/mL에서 377 μg/mL에 이르는 인간 특이적 알부민 수준을 나타내며, 관찰 시간 동안 계속 증가합니다(6개월)(그림4). 이중 인간화 마...

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토론

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간은 HIV에 감염된 환자24에서손상되고 손상됩니다. HIV-1의 존재에 있는 인간적인 간 질병을 공부하기 위한 실험적인 작은 동물 모형은 CD34+ HSPC 및 간세포7,12를가진 몇몇 공동 이식한 동물 모형의 가용성에도 불구하고, 극단적으로 제한됩니다 25. 시험관 내 실험에서, 간세포는 낮은 수준의 HIV-1 감염(26)을가지고 있는 것으로 나타났다. 인간 세포의 두 모형을 전송하는 인간화한 마우스는 바람직한 모형입니다. 인간 면역계로만 재구성된 마우스의 간은 인간 조절 T 세포의 실험적 고갈하에 HIV 감염에 의해 영향을 받는 것으로 나타났다20,27.

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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이 작품은 국립 보건 원 보조금 R24OD018546에 의해 지원되었다 (L.Y.P. 및 S.G.에). 저자는 외과 적 절차에 도움을 Weizhe 리, 박사, 박사, 아만다 지점 우즈, B.S., 면역 신체 에 대한 얀 청, UNMC 흐름 세포 분석 연구 시설 회원 이사 필립 헥슬리, 박사, 빅토리아 B. 스미스, B.S., 및 사만다에 도움을 감사드립니다 월, B.S., UNMC 고급 현미경 핵심 시설 회원 제니스 A. 테일러, B.S., 제임스 R. Talaska, B.S., 기술 지원을 위해. 저자는 TK-NOG 마우스와 테오술판을 제공하는 요아킴 바움가르트 박사를 제공한 CIEA의 이토 마모루 박사와 스에미즈 히로시 박사를 인정합니다. 저자는 원고에 그녀의 편집 기여에 대한 박사 아드리안 Koesters, UNMC, 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
27 G1/2" 바늘BD biosciences305109
30 G1/2" 바늘BD biosciences305106
5 mL 폴리스티렌  둥근 바닥 튜브 12 mm x 75 mm 스타일Corning352054
BD 1 mL 투베르쿨린 주사기 바늘 없음BD biosciences309659
BD FACS 어레이 bioanalyzer BD Biosciences용리된 CD34+ 세포의 순도 검사 
BD FACS 어레이 소프트웨어BD Biosciences소프트웨어 FACS 어레이에서 획득 된 CD34+ 세포 분석
BD FACS 용해 솔루션BD Biosciences349202적혈구
BD LSR IIBD Biosciences유세포 분석 샘플의 획득을 위한 기기
BD  Vacutainer 플라스틱 혈액 수집 튜브BD 생명과학BD 367874을 수집하기 위해
 Sigma-aldrichA9576
부프레노르핀제어 물질 및 진통제
CD14-PEBD Biosciences555398인간 전용
CD19-BV605BD Biosciences562653인간
전용 CD34 MicroBead Kit, humanMiltenyi Biotec130-046-702격리를 위해    CD34+ HSPC
CD34-PE, 인간Miltenyi Biotec130-081-002항체는 용출된 CD34+ 세포의 순도 검사에 사용됩니다.
CD3-AF700BD Biosciences557943human 특이적
CD45-PerCPCy5.5BD Biosciences564105human 특이적
CD4-APCBD Biosciences555349human 특이적
CD8-BV421BD Biosciences562428
Cell counting slidesBio-rad1450015
특이적ChargeSwitch gDNA 미니 티슈 키트Thermofisher 과학CS11204귀 조각에서 게놈 DNA를 추출하는
Cobas 앰플리코 시스템 v1.5 Roche Molecular Diagnostics바이오분석기로 바이러스 부하를 측정합니다
.  McKesson24-106-2S
Cytokeratin-18 (CK18)DAKOM7010인간
DMSO (Dimethyl sulfoxide)Sigma-aldrichD2650-5X5ML
확장 세트 마이크로 보어 슬라이드 클램프 고정 남성 Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path SterileBD biosciences30914디스펜싱 피펫에 부착 및 HSPC 및 HEP suspesion
FACS Diva 버전 6BD Biosciences유세포 분석기 소프트웨어 필요   샘플
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10438026
FLOWJO 분석 소프트웨어
v10.2		FLOWJO, 유세포 분석 소프트웨어
GanciclovirAPP Pharmaceuticals, Inc.315110처방약
Greiner MiniCollect EDTA 튜브Greiner bio-one450475
간세포 해동 매체 트라이앵글 리서치 랩 MCHT50
호라이즌 오픈 결찰 클립 어플리어Teleflex537061결찰 클립을 고정하기 위해
Hospira 주입용 멸균수ACE 외과 공급 co., Inc.001-1187부프레노르핀(진통제)의 희석을 위해
인간 알부민 ELISA 정량 세트베틸 연구소E80-129마우스 혈청의 인간 알부민 수치 평가를 위해
인간 간세포삼각형 연구소 HUCP1  냉동 보존된 인간 간세포, 유도 자격 
아이리스 가위, 스트레이트테드 펠라, Inc.13295
LancetMEDIpointGoldenrod 5mm
LS 기둥 Miltenyi Biotec130-042-401CD34+ 마이크로비즈를 함정에 넣는 데 사용됩니다 (양성 선택)
림프구 분리 매체 (LSM)MP Biomedicals50494격리를 위해    말초 혈액
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303Qudro MACS 분리기 및 LS 기둥
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring ScissorsRoboz Surgical Instrument Co.를RS-5605비장을 노출시키기 위해 피부를 절개
마이크로 절개 겸자Roboz Surgical Instrument Co.RS-5157 복막강에서 비장을 잡고 빼내기 위해
마우스 CD45-FITCBD Biosciences553080마우스 특정
PBS (인산염 완충 식염수)HycloneSH30256.02
Qudro MACS 분리기 Miltenyi Biotec130-090-976은
RPMI 1640 매체Gibco11875093
StepOne Plus Real Time PCR사용된 유전자형
스테퍼 시리즈 반복 분배 피펫 1mlDYMAX CORPT15469nbsp; 분배 HSPC와 HEP supension in controlled manner
Suturevet PGA 합성 흡수 봉합Henry Schein Animal Health41178피부와 복막의 봉합
TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스Thermofisher scientific4369016
TC20 자동 세포 카운터Bio-rad1450102
TK-NOG 마우스 중앙 실험 동물 연구소 (CIEA, 일본; Drs. Mamoru Ito 및 Hiroshi Suemizu) 제공
TreosulfanMedac GmbH제공  Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) 
Trypan BlueBio-rad1450022
Vannas형 마이크로 가위, 스트레이트, 80mm LTed Pella, Inc.1346비장을 노출시키기 위해 피부를 절개하는 데 사용
Weck hemoclip 전통적인 티타늄 결찰 클립봉합523700주입 후 비장을 접합하기 위해
코드 혈액 소 혈청 알부민 human LLC 의 림프구는 보유하고 있습니다.하는 데 사용 의 네 개의 LS 컬럼을 보유하고 있습니다. 사용된 응용 생물 시스템 기기 &사 사

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