qKAT: 킬러 세포 같은 면역 글로불린 수용 체 유전자의 양적 반자동 입력

Jyothi Jayaraman; Vitalina Kirgizova; Da Di; Christopher Johnson; Wei Jiang; James A. Traherne

doi:10.3791/58646

방법 논문

qKAT: 킬러 세포 같은 면역 글로불린 수용 체 유전자의 양적 반자동 입력

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DOI:

10.3791/58646

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2019년 3월 6일

Jyothi Jayaraman¹^,²^,³^,⁴ , Vitalina Kirgizova¹ , Da Di¹^,⁵ , Christopher Johnson¹^,⁶ , Wei Jiang¹^,⁷ , James A. Traherne¹

¹Department of Pathology, University of Cambridge, ²Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, ³Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Cambridge School of Medicine, NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, ⁴Centre for Trophoblast Research, University of Cambridge, ⁵Department of Genetics & Evolution, University of Geneva, ⁶Royal Papworth Hospital, ⁷Department of Plant Sciences, University of Cambridge

이 논문에서

요약

양적 살인자 세포 수용 체 면역 글로불린 같이 (키 르) 반자동 입력 (qKAT) 인구와 질병 협회 연구에 그들의 응용 프로그램에 대 한 숫자 형식 키 르 유전자를 복사 하는 간단한, 높은 처리량 및 비용 효율적인 방법입니다.

초록

킬러 세포 면역 글로불린 같이 수용 체 (KIRs) 금지 및 활성화 면역 수용 체의, 자연적인 살인자 (NK) 및 T 세포, 유전자의 다형성 클러스터 염색체 19에 의해 설정 됩니다. 그들의 가장 특징이 ligands는 염색체 6에 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 로커 스 이내 인코딩됩니다 인간 백혈구 항 원 (HLA) 분자. 그들은 면역, 재생산, 및 이식, 유전자 형을 정확 하 게 할 수 있는 기술을가지고 중요 한 만드는 중요 한 역할을 재생 하는 실질적 증거는 그들. 그러나, 높은 순서 상 동, 뿐만 아니라 유전자 및 복사 번호 유사, 어렵게 정확 하 게 할 수 있는 디자인 방법 및 효율적으로 유전자 형을 모든 키 르 유전자. 전통적인 방법 일반적으로 가져온 데이터의 해상도, 처리량, 비용 효과성, 및 시간 설정 및 실험을 실행에 제한 됩니다. 우리 설명 양적 키 르 반 자동 입력 (qKAT) 라는 메서드는 키 르 로커 스에 있는 모든 유전자의 유전자 복사 번호를 확인할 수 있는 높은 처리량 다중 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 방법입니다. qKAT은 고해상도 키 르 숫자 데이터 복사, 그들을 포함 하는 구조적 다형성 haplotypes의 변화를 추정 하는 것 더 사용 될 수 있는 제공할 수 있는 간단한 높은 처리량 방법. 이 복사 번호와 haplotype 데이터에 대규모 질병 협회, 집단 유전학, 표현과 키 르 와 HLA간의 기능 상호 작용에 대 한 조사 연구에 대 한 유용할 수 있습니다.

서론

인간에서는, 살인자 같은 면역 글로불린 수용 체(키 르) 로커 스는 백혈구 수용 체 복합물 (LRC) 내의 염색체 19의 긴 팔에 매핑됩니다. 이 로커 스 길이 약 150 kb 고 15 키 르 유전자 배열 머리-투-꼬리를 포함 한다. 현재 알려진 키 르 loci는 KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR2DL4 KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3 그리고 두 pseudogenes, KIR2DP1 및 KIR3DP1. 키 르 유전자 2 차원 (2D)에 대 한 인코딩 및 짧은 (S; 활성화) 3 차원 (3D) 면역 글로불린과 같은 도메인 수용 체 또는 긴 (L; 억제) 세포질 꼬리, 자연 킬러 (NK) 세포와 T의 하위 집합으로 표현 되는 셀입니다. 복사 번호 유사 키 르 로커 스 양식 내의 변수 진 콘텐츠¹다양 한 haplotypes 전시. 비-유전자 동종 재결합 (NAHR), 가까운 머리-투-꼬리 유전자 배열 및 높은 순서 상 동에 의해 촉진 된 haplotypic 변화에 대 한 책임을 질 것을 제안 하는 메커니즘입니다. 100 개 이상의 다른 haplotypes 인구 전세계¹^,²^,^,³⁴에 보고 되었습니다. 이러한 모든 haplotypes 두 가지 주요 그룹으로 분할 될 수 있습니다: A와 B haplotypes. A haplotype 포함 7 키 르 유전자: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1및 KIR3DL2, 억제 키 르 유전자, 그리고 활성화 키 르 유전자 KIR2DS4. 그러나, 최대 70% 유럽 근원 개인의 키 르 haplotype를 위해 homozygous 독점적으로 수행 KIR2DS4⁵^,⁶의 비 기능 "삭제" 형태. 다른 모든 키 르 유전자 조합을 형성 그룹 B haplotypes, 특정 키 르 유전자 KIR2DS1, 중 적어도 하나를 포함 하 여 KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, 그리고 KIR2DL5, 일반적으로 두 개 이상의 활성화 키 르 유전자를 포함 하 고.

HLA 종류 I 분자 특정 금지 수용 체 (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3및 KIR3DL1) 활성화 수용 체 (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, 에 대 한 ligands로 확인 되었습니다 KIR2DS5, 및 KIR3DS1), 그리고 KIR2DL4에 대 한 고유 키 르 다른 억제 키 르 수용 체 처럼 긴 세포질 꼬리를 포함 하지만 또한 긍정적으로 위탁된 한 잔류물은 일반적인 세포 외 도메인 근처에 있다 다른 활성화 키 르 수용 체의 기능입니다. 키 르 유전자와 HLA 유전자 이체의 조합 그 모양 잠재적인 NK 세포 응답 개별 레벨⁷^,⁸수용 체 ligand 상호 작용을 좌우 한다. 유전 협회 학문에서 증거는 키 르 에 역할 (예:., 인간 면역 결핍 바이러스 [HIV]⁹ , C 형 간염 바이러스 [HCV]¹⁰), 바이러스 성 저항 표시는 이식^{의 성공 11}, 임신 장애, 생식 성공¹²^,¹³, 수용자 조 혈 줄기 세포 이식 (HSCT)¹⁴^,¹⁵^{, 후 재발에 대 한 보호의 위험} ¹⁶, 그리고 암¹⁷의 위험.

높은 순서 상 동의 조합 유전자 그리고 정확 하 게 유전형 키 르 유전자의 작업에서 haplotypic 다양성 선물 도전. 키 르 유전자 입력을 기존의 방법 순서 특정 뇌관 (SSP) 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)¹⁸^,^,¹⁹²⁰, 시퀀스 특정 oligonucleotide 조사 (SSOP) PCR²¹, 그리고 매트릭스 보조 레이저 이온화 시간의 비행 질량 분석 (MS MALDI TOF)²²desorption. 이러한 기술의 단점은 그들은 단지 부분에 통찰력을 제공 개인의 유전자 형 또한 수행 하는 힘이 드는 되 고 하는 동안 있습니다. 최근 차세대 시퀀싱 (NGS) 키 르 로커 스를 구체적으로 입력에 적용 되었습니다. 이 메서드는 매우 강력 하 고, 하는 동안 실행, 비쌀 수 있다 그리고 그것은 심층 분석 및 데이터 검사를 수행 하면 시간이 많이 소요.

qKAT는 높은 처리량 정량 PCR 방법입니다. 기존의 방법 힘들고 시간이 걸리는 반면, 두 일에 거의 1000 게놈 DNA (gDNA) 샘플을 실행할 수 있게 메서드와 키 르 유전자 유전자 복사 번호 제공. 10 다중 반응, 두 키 르 loci를 대상으로 각각의 이루어져 있다 qKAT 그리고 고정된 복사본 번호 게놈 (STAT6) 키 르 유전자의 상대적 정량화에 대 한 사용에 한 참조 유전자 복사 번호²³. 이 분석 결과 유전자 제공 뿐만 아니라 큰 인구 패널 및 HCV, 타입-1 당뇨병 같은 면역 조건 등 전염 성 질환 및 자간 전 증, 같은 임신 장애 질병 동료 연구 성공적으로 사용 되었습니다. NK 세포 기능¹^,⁴^,^,²⁴²⁵^,²⁶를 이해 하기 위한 연구에 underpinning.

프로토콜

1. 준비 및 DNA 중 도금

정확 하 게 계량 gDNA 농도 spectrophotometric 또는 fluorometric 악기를 사용 하 여.
96-잘 깊은 잘 격판덮개에 4 ng / µ L에 DNA를 희석. 알려진된 복사 번호와 하나 이상의 컨트롤 gDNA 샘플 및 비-템플릿 컨트롤을 포함 합니다.
2 분 동안 g 450 x 96 잘 접시 원심
모든 음에 10 384-잘 정량 접시에 quadruplicate에서 각 샘플을 분배 액체 처리 장비를 사용 하 여 DNA의 ng (2.5 µ L/잘). 각 qKAT 반응 한 적어도 10 384-잘 접시를 준비 합니다.
GDNA 이상의 96 잘 접시에서 적절 하 게 되는, 전체 볼륨 세척 표 백제 2%와 초순 수 처리 시스템 gDNA 샘플의 96 잘 접시 각 사이 액체의 바늘을 청소를 수행 합니다.
24 시간 이상 실 온에서 깨끗 한 지역에서 384-잘 접시를 배양 하 여 DNA를 건조.

2입니다. 프라이 머 및 프로브의 준비

참고: qKAT 10 다중 반응 이루어져 있다. 각 반응에는 3 개의 뇌관 쌍 구체적으로 두 가지 키 르 유전자와 하나의 참조 유전자 증폭 3 형광 표시 된 프로브 포함 되어 있습니다. 장 외.²⁷ 에 프로브는 oligonucleotides 이제 표시 됩니다 거 염료 때문에 그들이 제공 하는 향상 된 photostability 및 긴 신호 수명을 수정 했다. 전 aliquoted 뇌관 조합은 상용 ( 재료의 표참조).

표 1에 주어진 희석에 의하여 각 반응 위한 뇌관 조합 준비.
표 1에 의하여 각 반응에 대 한 프로브 조합을 준비 합니다. 결합 하기 전에 각 개별 프로브를 테스트 합니다.

3입니다. 마스터 믹스의 준비

참고 아래에 언급 된 볼륨 10 x 384-잘 접시 세트에서 1 개 qKAT 반응 수행입니다.

384-잘 접시에 도금 gDNA 샘플 완전히 건조 있는지 확인 하십시오. 얼음에 모든 단계를 수행 하 고 시 약 때문에 형광 표시 된 프로브는 사진 및 온도 구분 가능한 빛에 노출에서 덮여 유지.
서 리 없애다 정량 버퍼, 뇌관, 및 4 ° c.에 프로브 aliquots
얼음, 초순, 정량 버퍼, preprepared 뇌관 조합, 1000 µ L 및 preprepared 프로브 조합 (표 2)의 180 µ L의 20 mL의 18.86 mL을 추가 하 여 마스터 믹스 10 x 384-잘 접시에 대 한 준비.
분산 마스터 믹스 균등 하 게 각 우물에 415 µ L를 pipetting 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 96-깊은 잘 격판덮개. 빛에서 덮은 얼음 상자에이 접시를 유지.
액체 취급 악기를 사용 하 여, 말린된 gDNA 384-잘 접시의 각 음에 마스터 믹스의 9.5 µ L 분배. 호 일 접시를 봉인 하 고 즉시 4 ° c.에 그것을 배치합니다 나머지 접시, 바늘 액체 처리 시스템의 각 판 사이 물으로 세척은 보장에 대 한이 프로세스를 반복 합니다.
384-잘 접시 3 분 450 x g에서 원심 고 하룻밤에 4 ° C에서 또는 사이 6-12 h DNA를 resuspend 하 고 있는 어떤 공기 거품을 없앨 수 있습니다 그들을 품 어.

4입니다. 정량 분석 결과

야간 보육에 따라 어떤 나머지 공기 거품이 사라지고 3 분 450 x g 에서 원심.
정량 Pcr 기계 (예: LightCycler 480) microplate 처리기 연결 자동화의 목적 ( 재료의 표참조). 빛에서 보호 되는 냉각된 저장 독에서 정량 Pcr 기계에 접시를 microplate 처리기 프로그램.
참고 는 분석 실험, 이론, 컴퓨터에서 작동 다른 정량 호환 광섬유 설정.
다음 자전거 조건을 사용 하 여: 95 ° C의 40 주기 뒤에 5 분 동안 95 ° C 15 s와 66 ° C 50에 대 한 s, 66 ° c.에 데이터 수집
실행 완료 되 면, 로봇 정량 Pcr 기계에서 접시를 수집 하 고 폐기 독에 있다.

5. 실행된 후 분석

증폭 후 정량 컴퓨터의 소프트웨어와 함께 두 번째 파생 최대 메서드 또는 맞는 포인트 메서드를 사용 하 여 정량화 주기 (Cq) 값을 계산 ( 재료의 표참조), 다음 단계.
정량 소프트웨어를 열고 탐색기 탭에서 한 접시에 대 한 저장 된 반응 실험 파일 엽니다.
두 번째 파생 최대 메서드를 사용 하 여 분석을 위해 분석 탭을 선택 하 고 Abs Quant/Second 파생 Max 메서드를 사용 하 여 새 분석을 만들.
1. 만들기 새로운 분석 창에서 선택 분석 종류: Abs Quant/Second 파생 Max 메서드, 하위 집합: 모든 샘플, 프로그램: 증폭, 이름: Rx-돌연 사 했을까 (여기서 x 는 반응 수).
2. 필터 빗 고 빅/16 진수/Yellow555 (533-580)를선택 하십시오. 그러면 STAT6 수집 데이터 선택.
3. VIC/HEX/Yellow555(533-580)에 대 한 컬러 보정 을 선택 합니다. 계산을 클릭 합니다. 팸 (465-510) 및 Cy5/Cy5.5(618-660)에 대 한 반복이. 파일 저장을 클릭 합니다.
맞는 포인트 메서드를 사용 하 여 분석을 위해 분석 탭에서 Abs 양의/맞는 포인트를 선택 합니다.
1. 만들기 새로운 분석 창에서 선택 분석 종류: Abs 양의/맞춤 포인트 방법, 하위 집합: 모든 샘플, 프로그램: 증폭, 이름: RxF-돌연 사 했을까 (여기서 x 는 반응 수).
2. 올바른 필터 및 STAT6 및 키 르 유전자 (팸/Cy5) 각각의 색상 보정을 선택 합니다. Noiseband 탭에서 배경 잡음을 제외 하려면 소음 밴드를 설정 합니다.
3. 분석 탭에서 3 에 맞는 포인트를 설정 하 고 쇼 포인트에 맞게선택 합니다. 계산을 클릭 합니다. 파일 저장을 클릭 합니다.

6입니다. 결과의 수출

정량 소프트웨어에서 탐색기 를 열고 탭 선택 결과 일괄 내보내기.
실험 파일 저장 되 고 윈도우의 오른쪽 부분에는 파일을 전송할 폴더를 엽니다. 다음을 클릭 합니다. 이름 및 내보내기 파일의 위치를 선택 합니다.
Abs Quant/Second 파생 Max 메서드 또는 Abs 양의/맞춤 포인트분석 유형을 선택 합니다. 다음을 클릭 합니다. 내보내기 폴더 파일과 분석 종류의 이름이 올바른지 확인 하 다음 내보내기 프로세스를 시작 하려면 클릭 합니다.
내보내기 상태 확인될 때까지 기다립니다. 화면 자동으로 다음 단계로 이동 합니다. 선택한 모든 파일 성공적으로 내보낸 확인을 실패 한 파일 수 = 0. 완료를 클릭 합니다.
각 접시에 대 한 개인적인 반응이 내보낸된 접시를 분할할 스크립트 split_file.pl 및 roche2sds.pl를 사용 합니다.
참고 스크립트 요청/GitHub에 제공 됩니다.

7. 숫자 계산

복사 번호 분석 소프트웨어 (예: CopyCaller)를 엽니다. 실시간 PCR 결과 파일 가져오기를 선택 하 고 roche2sds.pl에서 만든 텍스트 파일을 로드.
분석 을 선택 하 고 어느 선택 알려진된 복사 번호 보정 샘플 또는 가장 빈번한 복사본 수를 선택 하 여 분석을 실시. 일반적으로 유럽 근원 인구에서 관찰 하는 키 르 유전자의 가장 빈번한 복사 번호 표 5 를 참조 하십시오.

8. 데이터 품질 검사

KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215 R 스크립트를 사용 합니다. R 스프레드시트에 모든 접시에서 숫자 데이터를 복사를 결합 하 여.
참고 스크립트 요청/GitHub에 제공 됩니다.
키 르 유전자 (표 6)에 대 한 알려진된 결합 불균형 (LD)을 따르지 않는 샘플에 대 한 복사 번호 분석 소프트웨어에 원시 데이터 확인

결과

복사 번호 분석 복사 번호 분석 소프트웨어, ΔΔCq 방법에 따라 예측 하 고 예상 복사본 수를 제공 하는 파일을 내보내기 하 여 수행할 수 있습니다.

복사본 수 중 제어 DNA 샘플 접시에 또는 가장 빈번한 유전자 복사 번호 (표 5)를 입력 하 여 알려진된 복사본 수에 따라 예언 될 수 있다. 그림 1 보여줍니다 KIR2DL4 KIR3DS1, 뿐만 아니라 참조 유전자를 대상으로 하는 반응에 대 한 판의 결과 STAT6. KIR2DL4, 키 르 로커 스에서 프레임 워크 유전자에 대 한 가장 빈번한 복사 번호 KIR3DS1, 활성화 유전자에 대 한 가장 빈번한 복사 번호는 하나의 복사본 2 부, 이다. 그림에서 결과 정량 소프트웨어 및 정량 데이터에서 생성 된 숫자 데이터 복사에 관찰 하는 PCR 증폭 플롯을 보여준다. 같이, 분석 결과 0, 1, 2, 3, 및 4 키 르 유전자 복사 번호를 구분할 수 있다. 복사 번호 분석 소프트웨어는 원형 차트 또는 막대 그래프 접시에 걸쳐 복사 번호의 배급의 보기를 해줍니다. 복사 번호 예측의 효능은 복사 번호가 높은 샘플에 대 한 낮은.

반응, gDNA, 버퍼, 뇌관, 및 프로브에 사용 된 모든 재료의 품질 얻은 결과의 정확도 영향을 수 있습니다. 그러나, 결과에서 부조화 접시에 걸쳐 DNA의 농도 있는 변화 때문에 발생할 수 가능성이 가장 높습니다. 260/280 260을 사용 하 여 측정 될 수 있는 추출된 gDNA의 순도/230 비율, 또한 품질에 영향을 미칠 수 있습니다. 260/280 비율이 1.8-2와 260/230 비율 2-2.2의 바람직한 있습니다. 접시에 걸쳐 고르지 DNA 농도 높은 가변성 임계값 주기 (C_t)에서 샘플 사이의 부조화 예상된 복사본 수의 범위에서 발생할 수 있습니다. 그림 2 에 결과 접시 값은 C_t 사이의 격차 복사 번호의 예측의 정확도에 미칠 수 있는 효과 보여 줍니다. 레드 라인 샘플에 대 한 예상된 복사 숫자의 범위를 나타냅니다 하 고, 이상적으로, 가능한 정수에 가까운 이어야 한다.

한번 분석, 복사 숫자 데이터를 스프레드시트 파일에 96-잘 형식으로 내보낼 수 있습니다. 우리는 결합 한 스프레드시트에 집합으로 실행 되는 모든 10 접시의 숫자 데이터를 복사 하는 R 스크립트 (요청에 사용 가능)을 사용. 주로 유럽 근원 인구에서 KIRs 에 대 한 게시 된 데이터에는 키 르 복잡 한¹에 다양 한 유전자 사이 존재 하는 LD 규칙의 예측 수 있습니다. 이러한 예측은 (표 6) 복사 번호 결과 대 한 다운스트림 검사를 실시 하는 데 사용 됩니다. 비정상적인 다형성 또는 haplotypic 구조 변이 유전자 사이 예측된 LD에 따르지 않는 샘플 포함할 수 있습니다. 프로토콜을 설명 하는 순서도 그림 3에 표시 됩니다.

키 르 Haplotype 식별자 (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) 라는 도구는 데이터 집합에서 haplotypes의 돌리기를 촉진 하기 위하여 개발 되었다. 돌리기 유럽 근원 인구¹관찰 참조 haplotypes의 목록에 근거 하 여 작동 합니다. 그러나, 도구 수도 있습니다 참조 haplotypes의 사용자 지정 설정 대신 사용할 수 있습니다. 3 별도 파일이 생성 됩니다. 첫 번째 파일 샘플에 대 한 모든 haplotype 조합을 나열, 두 번째 파일 높은 결합 된 주파수가 haplotypes 조합의 트림된 목록 하며 세 번째 파일 목록 샘플 haplotypes를 할당할 수 없습니다. 비-할당 haplotypes의 소설 haplotypes의 지시자로 사용 될 수 있습니다.

figure-results-1
그림 1: 반응에 대 한 접시의 대표적인 결과 번호 5. (A)이 패널 쇼 증폭 구획. (B)이이 패널 쇼 번호 플롯을 복사합니다. (C)이이 패널 복사 번호 배포를 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-2
그림 2: 반응 변수 DNA 농도와 접시의 대표적인 결과 번호 5. (A)이 패널 쇼 증폭 구획. (B)이이 패널 쇼 번호 플롯을 복사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-3
그림 3: qKAT 프로토콜의 순서도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

분석 결과	유전자	앞으로 뇌관	농도 (nM)	반전 뇌관	농도 (nM)	프로브	농도 (nM)
아니 1	*3DP1*	A4F	250	A5R	250	P4a	150
	*2 DL 2*	2DL2F4	400	C3R2	600	P5b	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
아니오 2	*2DS2*	A4F	400	A6R	400	P4a	200
	*2 DL 3*	D1F	400	D1R	400	P9	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
아니 3	*3 DL 3*	A8F	500	A8R	500	P4a	150
	*2DS4Del*	2DS4Del	250	2DS4R2	250	P5b	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
아니 4	*3DL1e4*	지 하 1 층	250	B1R	125	P4b	150
	*3DL1e9*	D4F	250	D4R2	500	P9	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
No 5	*3DS1*	지 하 2 층	250	B1R	250	P4b	150
	*2 DL 4*	C1F	200	C1R	200	P5b-2 DL 4	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
No 6	*2 DL 1*	B3F	500	B3R	125	P4b	150
	*2DP1*	D3F	250	D3R	500	P9	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
아니 7	*2DS1*	B4F	500	B4R	250	P4b	150
	*2 DL 5*	D2F	500	D2R	500	P9	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
No 8	*2DS3*	B5F	250	B5R	250	P4b	150
	*3DL2e9*	D4F	250	D5R	125	P9	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
No 9	*3DL2e4*	A1F	200	A1R	200	P4a	150
	*2DS4FL*	2DS4FL	250	2DS4R2	500	P5b	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150
No 10	*2DS5*	B6F2	200	B6R3	200	P4b	150
	*2DS4*	C5F	250	C5R	250	P5b	150
	*STAT6*	STAT6F	200	STAT6R	200	PSTAT6	150

표 1: 조합과 뇌관과 각 qKAT 반응에 사용 되는 프로브 ²⁷ .

반응					뇌관 Aliquots (µ L)				프로브 Aliquots (µ L)
R1	3DP1	A4F	A5R	2DL2F4	C3R2	물	STAT6F	STAT6R	P4A	P5B	PSTAT6
	2 DL 2	100	100	160	240	200	80	80	60	60	60
R2	2DS2	A2F	A6R	D1F	D1R	물	STAT6F	STAT6R	P4A	P9	PSTAT6
	2 DL 3	160	160	160	160	160	80	80	80	60	60
									참고: 필요 더 적은 물에는 MasterMix 20 µ L
R3	3 DL 3	A8F A8FB	A8R	2DS4DELF	2DS4R2	물	STAT6F	STAT6R	P4A	P5B	PSTAT6
	2DS4DEL	100 100	200	100	100	200	80	80	60	60	60
R4	3DL1E4	지 하 1 층	B1R	D4F	D4R2	물	STAT6F	STAT6R	P4B	P9	PSTAT6
	3DL1E9	100	50	100	200	350	80	80	60	60	60
R5	3DS1	지 하 2 층	B1R	C1F	C1R	물	STAT6F	STAT6R	P4B	P5B-2 L 4	PSTAT6
	2 DL 4	100	100	80	80	440	80	80	60	60	60
R6	2 DL 1	B3F	B3R	D3F	D3R	물	STAT6F	STAT6R	P4B	P9	PSTAT6
	2DP1	200	50	100	200	250	80	80	60	60	60
R7	2DS1	B4F	B4R	D2F	D2R	물	STAT6F	STAT6R	P4B	P9	PSTAT6
	2 DL 5	200	100	200	200	100	80	80	60	60	60
R8	2DS3	B5F	B5R	D4F	D5R	물	STAT6F	STAT6R	P4B	P9	PSTAT6
	3DL2E9	100	100	100	50	450	80	80	60	60	60
R9	3DL2E4	A1F	A1R	2DS4WTF	2DS4R2	물	STAT6F	STAT6R	P4A	P5B	PSTAT6
	2DS4WT	80	80	100	200	340	80	80	60	60	60
R10	2DS5	B6F2	B6R3	C5F	C5R	물	STAT6F	STAT6R	P4B	P5B	PSTAT6
	2DS4TOTAL	80	80	100	100	440	80	80	60	60	60

표 2: 볼륨 (µ L) 100 µ M 뇌관/프로브의 주식 뇌관 및 조합은 aliquots 프로브 솔루션.

이름	방향	5´ 수정	3´ 수정	시퀀스 (5' →3')	길이	Tm	GC %	Exon	위치
P4a	감각	식구 들	BHQ-1	TCATCCTGC AATGTTGGT CAGATGTCA	27	60	44.4	4	425-451
P4b	Antisense	식구 들	BHQ-1	AACAGAACC GTAGCATCT GTAGGTCCC T	28	62	50	4	576-603
P5b	감각	ATTO647N	BHQ-2	AACATTCCA GGCCGACT TTCCTCTG	25	60	52	5	828-852
P5b-2 DL 4	감각	ATTO647N	BHQ-2	AACATTCCA GGCCGACT TCCCTCTG	25	61	56	5	828-852
P9	감각	ATTO647N	BHQ-2	CCCTTCTCA GAGGCCCA AGACACC	24	60	62.5	9	1246-1269
PSTAT6		ATTO550	BHQ-2	CTGATTCCT CCATGAGCA TGCAGCTT	26	62	50

표 3: qKAT에서 사용 하는 프로브 목록 ¹^, ²⁷. 올리고 프로브 P5b, P5b-2 DL 4, P9, 및 PSTAT6의 5' 끝에 사용 하는 형광 염료 ATTO 염료를 수정 했다.

유전자	뇌관	방향	시퀀스 (5´-3´)	길이	Tm	GC %	Exon	위치	Amplicon (bp)	대립 유전자를 놓칠 수 있습니다.
3DL2e4	A1F	앞으로	GCCCCTGCTGAA ATCAGG	18	52	61.1	4	399-416	179	3 DL 2 * 008, * 021, * 027, * 038.
	A1R	역	CTGCAAGGACAG GCATCAA	19	53	52.6		559-577		3 DL 2 * 048
3DP1	A4F	앞으로	GTCCCCTGGTGA AATCAGA	19	49	52.6	4	398-416	112	없음
	A5R	역	GTGAGGCGCAAA GTGTCA	18	52	55.6		492-509		없음
2DS2	A2F	앞으로	GTCGCCTGGTGA AATCAGA	19	49	52.6	4	398-416	111	없음
	A6R	역	TGAGGTGCAAAG TGTCCTTAT	21	51	42.9		488-508		없음
3 DL 3	A8Fa	앞으로	GTGAAATCGGGA GAGACG	18	50	55.6	4	406-423	139	없음
	A8Fb	앞으로	GGTGAAATCAGG AGAGACG	19	50	52.6		405-423		3 듀얼 레이어 3 * 054, 3 DL 3 * 00905
	A8R	역	AGTTGACCTGGG AACCCG	18	51	61.1		526-543		없음
3DL1e4	지 하 1 층	앞으로	CATCGGTCCCAT GATGCT	18	51	55.6	4	549-566	85	3 DL 1 * 00505, 3 DL 1 * 006, 3 DL 1 * 054 3 DL 1 * 086, 3 DL 1 * 089
	B1R	역	GGGAGCTGACAA CTGATAGG	20	52	55		614-633		3 DL 1 * 00502
3DS1	지 하 2 층	앞으로	CATCGGTTCCAT GATGCG	18	51	55.6	4	549-566	85	3DS1 * 047; 3 DL 1 * 054를 선택할 수 있습니다.
	B1R	역	GGGAGCTGACAA CTGATAGG	20	52	55		614-633		없음
2 DL 1	B3F	앞으로	TTCTCCATCAGT CGCATGAC	20	52	50	4	544-563	96	2 DL 1 * 020, 2 DL 1 * 028
	B3R	역	GTCACTGGGAGC TGACAC	18	50	61.1		622-639		2 DL 1 * 023, 2 DL 1 * 029, 2 DL 1 * 030
2DS1	B4F	앞으로	TCTCCATCAGTC GCATGAA	19	51	47.4	4	545-563	96	2DS1 * 001
	B4R	역	GGTCACTGGGAG CTGAC	17	49	64.7		624-640		없음
2DS3	B5F	앞으로	CTCCATCGGTCG CATGAG	18	53	61.1	4	546-563	96	없음
	B5R	역	GGGTCACTGGGA GCTGAA	18	51	61.1		624-641		없음
2DS5	B6F2	앞으로	AGAGAGGGGACG TTTAACC	19	50	52.6	4	475-493	173	없음
	B6R3	역	TCCAGAGGGTCA CTGGGC	18	53	66.7		630-647		2DS5 * 003
2 DL 4	C1F	앞으로	GCAGTGCCCAGC ATCAAT	18	52	55.6	5	808-825	83	없음
	C1R	역	CCGAAGCATCTG TAGGTCT	19	52	52.6		872-890		2 DL 4 * 018, 2 DL 4 * 019
2 DL 2	2DL2F4	앞으로	GAGGTGGAGGCC CATGAAT	19	52	57.9	5	778-796	151	2 DL 2 * 009; 782 G a 변경
	C3R2	역	TCGAGTTTGACC ACTCGTAT	20	51	45		909-928		없음
2DS4	C5F	앞으로	TCCCTGCAGTGC GCAGC	17	57	70.6	5	803-819	120	없음
	C5R	역	TTGACCACTCGT AGGGAGC	19	52	57.9		904-922		2DS4 * 013
2DS4Del	2DS4Del	앞으로	CCTTGTCCTGCA GCTCCAT	19	54	57.9	5	750-768	203	없음
	2DS4R2	역	TGACGGAAACAA GCAGTGGA	20	53	50		933-952		없음
2DS4FL	2DS4FL	앞으로	CCGGAGCTCCTA TGACATG	19	53	57.9	5	744-762	209	없음
	2DS4R2	역	TGACGGAAACAA GCAGTGGA	20	53	50		933-952		없음
2 DL 3	D1F	앞으로	AGACCCTCAGGA GGTGA	17	48	58.8	9	1180-1196	156	없음
	D1R	역	CAGGAGACAACT TTGGATCA	20	50	45		1316-1335		2 DL 3 * 010, 2 DL 3 * 017, 2 DL 3 * 01801 및 2 DL 3 * 01802
2 DL 5	D2F	앞으로	CACTGCGTTTTC ACACAGAC	20	52	50	9	1214-1233	120	2DL5B * 011 및 2DL5B * 020
	D2R	역	GGCAGGAGACAA TGATCTT	19	49	47.4		1315-1333		없음
2DP1	D3F	앞으로	CCTCAGGAGGTG ACATACGT	20	53	55	9	1184-1203	121	없음
	D3R	역	TTGGAAGTTCCG TGTACACT	20	50	45		1285-1304		없음
3DL1e9	D4F	앞으로	CACAGTTGGATC ACTGCGT	19	52	52.6	9	1203-1221	93	3 DL 1 * 061, 3 DL 1 * 068
	D4R2	역	CCGTGTACAAGA TGGTATCTGTA	23	53	43.5		1273-1295		3 DL 1 * 05901, 3 DL 1 * 05902, 3 DL 1 * 060, 3 DL 1 * 061, 3 DL 1 * 064, 3 DL 1 * 065, 3 DL 1 * 094N, 3 DL 1 * 098
3DL2e9	D4F	앞으로	CACAGTTGGATC ACTGCGT	19	52	52.6	9	1203-1221	156	없음
	D5R	역	GACCTGACTGTG GTGCTCG	19	54	63.2		1340-1358		없음
STAT6	STAT6F	앞으로	CCAGATGCCTAC CATGGTGC	20	54	60			129
	STAT6R	역	CCATCTGCACAG ACCACTCC	20	54	60

표 4: qKAT에서 사용 된 뇌관의 시퀀스 ¹^, ²⁷.

*키 르* 유전자		3 DL 3	2DS2	2 DL 2	2 DL 3	2DP1	2 DL 1	3DP1	2 DL 4	3 DL 1 EX9	3 DL 1 EX9	3DS1	2 DL 5	2DS3	2DS5	2DS1	2DS4 총	2DS4 플로리다	2DS4 델	3 DL 2 ex4	3 DL 2 EX9
가장 빈번한 복사 수		2	1	1	2	2	2	2	2	2	2	1	1	1	1	1	2	1	1	2	2

표 5: 가장 빈번한 복사 번호 키 르 유전자 일반적으로 유럽 원본 샘플에서 관찰.

	QKAT 유럽 인구에 기반에 대 한 결합 불균형 규칙	복사 번호 확인
1	KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 및 KIR3DL2 framework 유전자 두 haplotypes에 있습니다.	KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 , KIR3DL2 = 2
2	KIR2DS2 와 KIR2DL2 는 LD에 서로	2DS2=2 DL 2
3	KIR2DL2 와 KIR2DL3 는 동일한 유전자의 대립 유전자	2 DL 2+2 DL 3= 2
4	KIR2DP1 와 KIR2DL1 는 LD에 서로	2DP1=2 DL 1
5	Exon KIR3DL1 및 KIR3DL2 의 4 엑손 9 KIR3DL1 및 KIR3DL2 의 각각은.	3DL1ex4=3DL1ex9 및 3DL2ex4=3DL2ex9
6	KIR3DL1 와 KIR3DS1 는 대립 유전자	3 DL 1+3DS1= 2
7	KIR2DS3 및 KIR2DS5 KIR2DL5 와 LD 있는	2DS3+2DS5=2 DL 5
8	KIR3DS1 와 KIR2DS1 는 LD에	3DS1=2DS1
9	KIR2DS1 및 KIR2DS4Total의 존재는 haplotype에 상호 배타적 이다	2DS1+2DS4TOTAL= 2
10	KIR2DS4FL 와 KIR2DS4del 는 KIR2DS4TOTAL 의 변종	2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL

표 6: 결합 불균형 사이 키 르 일반적으로 유럽 근원 인구에서 관찰 하는 유전자 숫자 데이터 복사 확인을 사용할 수 있습니다 ¹^,²⁷.

토론

우리는 소설 반자동된 높은 처리량 메서드를 복사 키 르 유전자. 의 숫자 입력을 용이 하 게 qKAT 설명 방법은 낮은 처리량이 높은 다형성 유전자의 유무만 나타낼 수는 SSP-PCR, 같은 기존의 방법에 비해 개선 이다.

가져온 숫자 데이터 복사의 정확도 품질 및 농도-gDNA 샘플 및는 시 약의 품질의 균일성을 포함 한 여러 요인에 따라 달라 집니다. 이후 유사 농도 격판덮개의 맞은편에 복사 숫자의 계산에서 오류가 발생할 수 있습니다 품질 및 접시에 걸쳐 gDNA 샘플의 정확도 매우 중요 하다. 분석 실험 유럽 원본 샘플 세트를 사용 하 여 확인 했다, 이후 동료는 세계의 다른 부분에서에서 데이터 보다 철저 한 검사를 필요로 합니다. 이것은 대립 유전자 강하 또는 일반적인 뇌관/프로브 바인딩 인스턴스 복사 번호 유사로 오해 하지는 보장 하기 위해.

분석 실험 설계 하 고 높은 처리량으로 실행 하도록 최적화, 하는 동안 그들은 적은 샘플을 실행 하려면 수정할 수 있습니다. 적은 샘플을 분석할 때 자신감 통계 복사 번호 분석 소프트웨어에 영향을 하지만이 알려진된 키 르 유전자 복사 번호와 제어 genomic DNA 샘플에 포함 되어 있고 추가 샘플 복제는 향상 시킬 수 있습니다. 포함 되어 있습니다.

액체/플레이트-처리 로봇 없이 실험실, 멀티 채널 펫을 사용 하 여 마스터 믹스를 적절 수 있습니다 및 판 정량에 수동으로 로드할 수 있습니다.

QKAT의 발달의 뒤에 주요 목표를 만드는 간단 하 고, 높은 처리량, 고해상도, 고 비용 효율적인 방법을 유전자 KIRs 질병에 대 한 협회 연구 했다. 이것은 성공적으로 달성 이후 qKAT 감염 증, 자기 면역 조건, 그리고 임신 장애⁴^, 의 범위를 포함 하 여 몇몇 큰 질병 협회 연구에 키 르 의 역할 조사에서 고용 되어 ²⁴ ^, ²⁵ ^, ²⁶.

공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

의료 연구 위원회 (MRC), 유럽 연합의 수평선 2020 연구와 혁신 프로그램 (부여 계약 번호 695551)에서 유럽 연구 회의 (ERC)와 국립 보건원 (NIH) 케임브리지에서 자금 지원을 받은 프로젝트 생물 의학 연구 센터와 NIH 연구 혈액 및 이식 연구 단위 (NIHR BTRU) 장기 기증 및 이식 캠브리지 대학에서 보 건국 혈액과 이식 (NHSBT)와 협력 표현 되며 그 저자 반드시 보 건국에서 NIHR, 보건, 또는 NHSBT의.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름	회사	카탈로그 번호	댓글
REAGENTS
Oligonucleotides	Sigma	Custom	order SEQUENCES: 표 4에 나열
ATTO 염료로 표시된 프로브	Sigma	Custom	order SEQUENCES: 표 3에 나열됨
SensiFAST Probe No-ROX Kit	Bioline	BIO-86020	−
MilliQ 물	&마이너스;	&빼기;	&빼기;
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
EQUIPMENT
Centrifuge with a swinging bucket rotor	Eppendorf(또는 동급)	Eppendorf 5810R 또는 동급 시스템
NanoDrop	Thermo Scientific	ND-2000
OR
QuBit 형광측정기	Life Technologies	Q33216
Matrix Hydra	Thermo Scientific	109611
LightCycler 480 II Instrument 384-well	Roche	05015243001
Twister II 마이크로플레이트 핸들러(Mé 포함); Cour 열 플레이트 스태커(Mé Cour)	Caliper Life Sciences	204135
Vortex mixer	Biosan	BS-010201-AAA
단일 채널 피펫 (부피 범위: 0.5– 10 & 마이크로; L, 2– 20 & 마이크로; L, 20– 200 &마이크로; L, 200– 1,000 &마이크로; L; 1-10 mL)	Gilson(또는 동급)	F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
RNase- 및 DNase-free 피펫 팁 여과(10 µ L, 20 &마이크로; L, 200 &마이크로; L, 1,000 &마이크로; L, 10 mL)	Starlab (또는 동급)	S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
StarTub PS 시약 저장용기, 55 mL	STARLAB	E2310-1010
50 mL 원심분리기 튜브	STARLAB	E1450-0200
96-well deep well plate	Fisher Scientific	12194162
LC480 384 Multi-well plates	Roche	04729749001
LightCycler 480 씰링 포일	Roche	04729757001
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
SOFTWARE
Roche LightCycler 480 소프트웨어 v1.5
Applied Biosystems CopyCaller 소프트웨어 v2.1			https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
KIR 일배체형 식별자			http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/

됨

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재인쇄 및 허가

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허가 요청

qKAT: 킬러 세포 같은 면역 글로불린 수용 체 유전자의 양적 반자동 입력

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요약

초록

서론

프로토콜

결과

토론

공개 사항

감사의 글

재료

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재인쇄 및 허가

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