VASP 인 산화를 측정 하 여 혈액에 산화 질소의 혈소판 기반 탐지

요약

여기, 우리 혈액에 산화 질소 매우 민감한 센서로 혈소판의 잠재적인 사용을 해결 하기 위해 프로토콜을 제시. 그것은 산화 질소 생성기로 초기 혈소판 준비 및 아 질산염 및 deoxygenated 붉은 혈액 세포를 사용 하 여 설명합니다.

초록

혈소판은 혈액 구성 요소를 적절 한 혈액 응고에 대 한 책임. 그들의 기능은 매우 다양 한 경로 의해 통제 된다. 하나는 가장 강력한 vasoactive 에이전트, 산화 질소 (NO), 또한 혈소판의 강력한 억제제로 작동할 수 있다. 직접 혈액에서 감지 되지 않습니다 아무 반감기 밀리초 범위를 제한 하는 셀 무료 헤모글로빈으로 그것의 높은 반응성 때문에 매우 도전 이다. 현재, 변경 개입 추정만 후 아 질산염과 질산염 (질 산-아 질산염-아니 신진 대사 통로의 구성원)의 측정된 변화 기반. 그러나 정확한이 측정은 해석 대 실제 변경, 때문에 자연스럽 게 높은 기준선 아 질산염 및 질 산 몇 배나 더 자체의 변화를 예상된 보다 높은 수준에 오히려 어렵다. 따라서, 아니오를 직접 검출 할 수 것이 직접적이 고 간단한 방법의 개발은 오래전. 이 프로토콜 주소 혈액에 아무 센서로 매우 민감한 혈소판의 잠재적인 사용 합니다. 그것은 아무 생성기로 초기 혈소판 풍부 혈장 (PRP)와 씻어 혈소판 준비 및 아 질산염 및 deoxygenated 붉은 혈액 세포를 사용 하 여 설명합니다. VASP의 인 산화는 떠들고 239 (P-VASP^Ser239)에서 번호의 존재를 감지 하는 사실 VASP 단백질 높은 혈소판 표현 된 존재 하는 때 아니 그것 빠르게 phosphorylated이 통로 사용 하 여 직접 혈액에 아무 존재를 감지 하는 독특한 기회에 지도 한다.

서론

혈소판은 혈액 응고에 대 한 중요 한 없으며에서 파생 된 작은 디스크 모양의 세포 조각. 응고 폭포는 혈관 벽의 부상 이후에 출시 된 (콜라겐 또는 ADP) 등 다양 한 생리 활성 분자에 의해 시작 됩니다. 혈액 응고 과정 중 산화 질소 (NO)에 의해 다양 한 이펙터, 수정할 수 있습니다. 아니, 자연스럽 게 포유류 세포에 의해 생산, 가장 다재 다능 한 생리 신호 중 하나입니다. 그것은 강력한 vasodilator, 신경 전달 물질 및 많은 기능 몇 가지 이름을 면역 변조기 역할. 혈 류에서 더 또한 혈소판을 억제 함으로써 혈액 응고의 정도 조절 하기 위해 도움이 됩니다. 혈 류에서의 가장 가능성이 소스 중 하나입니다 아 질산염, 무기 이온의 선구자 역할을 표시 되었습니다. 적혈구 (Rbc)와 반응, 아 질산염 NO로 감소 되 고 deoxyHb 산화 methemoglobin (metHb)¹. Rbc에서 발표 없음 vasoactive 이며 원인 vasorelaxation². 이 아 질산염 감소 통로 이며 대체 아무 세대 통로와 함께 행동 내 피 산화 질소 synthase hypoxic 조건에 의해 생성 경로가 고아 한 보완.

스스로 혈소판 없음에 아 질산염을 줄일 수 있지만 그것의 존재에 매우 민감합니다. 그대로 혈소판에서 더는 nanomolar 범위 증가 cGMP (EC₅₀ = 10 nM)와 VASP의 인 산화 (EC₅₀ = 0.5 nM)³. 따라서, 혈소판 Rbc와 혈액으로 없음 릴리스 아 질산염 감소의 우수한 센서 역할을 수 있습니다. 직접 혈소판 활성화-aggregometry 및 thromboelastography (TEG) 등의 정도 측정할 수 있는 여러 방법이 있다^4,5. 그러나, 이러한 방법은 고가의 전문된 계측 및 오히려 많은 양의 자료 필요합니다. 그것은 또한 이벤트를 모니터링할 수 다운스트림, 아니 후 출시 Rbc, 혈소판 표면 단백질 표정-P selectin⁶등의 변화를 사용 하 여에서. 아니 혈소판⁷에서 cGMP의 양을 증가 알려져 있다. 이전에 우리는 deoxygenated RBC⁸아 질산염 감소 후 혈액으로 없음 릴리스를 모니터링 하려면 cGMP를 사용. 이 매우 민감한 방법; 판명 그러나, cGMP 짧은 분자 이며 그 탐지 포함 광범위 한 노동. 제시 프로토콜에서 설명 하는 또 다른 가능성, vasodilator 자극 인 (VASP)의 인 산화를 사용 하 여-단백질 혈액에의 존재를 감지. VASP은 sGC/cGMP 통로⁹없이 상호 작용에 phosphorylated 단백질 키 니 아 제 G 활성화의 기판입니다. 매우 낮은 전혀 감지 VASP 인 산화 발생 농도, 혈액에서 혈소판 없음 존재의 매우 민감한 검출기 만들 수 있는. VASP는 높은 혈소판, 표현 하지만 하지 다른 혈액 세포에서는 선택적으로 혈소판¹⁰를 포함 하는 이벤트에 따라 있습니다.

이 프로토콜의 주요 목표는 VASP 인 산화^11,12를 모니터링 하 여 혈소판와의 상호 작용을 사용 하 여 전체 혈액에 없는 자료의 검색에 대 한 세부 사항에 있는 메서드를 설명 하는. 설명된 메서드를 수 있습니다 낮은의 조기 발견 아무 농도를-이론적으로 현재 프로토콜 기술의 표준 서쪽 오 점 달성 대부분 실험실에서 사용 cGMP 결정 보다 더 민감한 nanomolar 범위에 설정.

프로토콜

참고: NIH 혈액 은행에서 혈액 샘플을 가져온 (IRB 승인 프로토콜: 99-CC-0168).

1. 혈액 샘플 준비

참고: 혈소판 활성화를 방지 하려면 혈액 천천히 그리고 부드럽게 시트르산 반전 튜브 여러 번에 의해 혼합.

1. 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP) 준비
   1. 20 G 또는 더 큰 직경 바늘을 사용 하 여 혈액의 30-50 mL 그리고 나트륨 구 연산 염 (3.8%)는 1:9 비율 또는 산 성 구 연산 염 포도 당 (ACD) (85mm trisodium 시트르산, 66.6 m m 구 연산, 111 mM 포도 당, pH 4.5) 1: 6의 비율에 포함 된 튜브에 추가.
   2. 빈 15 mL 원뿔 튜브로 갓 수집 된 전체 혈액 5 mL aliquot. 실 온에서 10 분 동안 120 x g 에서 전체 혈액 원심
   3. 조심 스럽게 플라스틱 전송 피 펫으로 상단 부분에서 혈소판 (혈소판이 풍부한 혈장, PRP)를 포함 하는 상쾌한을 수집 합니다.
      참고: 1.1.3 단계에서 PRP는 실험에 사용 하기 위해 준비 또는 준비에 추가 처리를 위해 혈소판을 세척. 세척된 적혈구 (RBC)를 정화 하 고 원심 (1.1.2 단계) 적혈구와 백혈구를 포함 하 고 더 일 수 있다 후 얻은 부드러운 펠 릿-1.3 단계. 를 참조 하십시오 실험은 혈액을 그리기 후 2 시간 이내 완료 될 필요가 있다. PRP (표면에 뜨는) 수집, PRP/RBC 인터페이스에 축적 된 버 피 코트 포함 된 백혈구의 컬렉션을 하지 않도록 합니다.
2. 씻어 혈소판 준비 (옵션)
   1. 원심 분리기는 실 온에서 10 분에 대 한 400 x g 에서 PRP를 수집. 삭제는 상쾌한 고 혈소판 펠 릿을 유지.
   2. 부드럽게 실 온에서 10 분에 대 한 400 x g 에서 CGS 버퍼 (120 mM NaCl, 12.9 m m trisodium 시트르산과 30 mM 포도 당, pH 6.5) 및 원심 분리기의 5 mL을 추가 하 여 펠 릿을 세척.
   3. 수정 된 Tyrode 버퍼 (134 m m NaCl, 0.34 m m NaH₂포₄, 2.9 m m KCl, 12 m m NaHCO₃, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl₂, 2mm CaCl₂, 10 m m 포도 당 pH 7.4) 3 mL와 혈소판 펠 릿 resuspend
   4. 혈소판을 희석 (1: 100-예를 들어, 리스 Ecker 솔루션의 990 µ L에서 혈소판의 10 µ L) 리스 Ecker 솔루션 및 hemocytometer 여 수.
   5. Tyrode 버퍼를 추가 하 여 3 x 10⁸ 셀/mL에 혈소판의 밀도 조정 합니다.
   6. 실험을 시작 하기 전에 1 시간 동안 37 ° C에서 혈소판 정지를 품 어.
      참고: 씻어 혈소판은 5-8 h 37 ° c.에 대 한 안정적인
3. 세척된 적혈구 (RBC)의 준비
   1. 컬렉션, 후 실 온에서 10 분 동안 2500 x g 에 1.1.3 단계에서 얻은 부드러운 펠 릿 원심.
   2. 상쾌한 무시 하 고 실 온에서 10 분 동안 2500 x g 에서 원심 분리 하 여 PBS의 5 mL와 RBC 펠 릿을 세척. 3 번이 단계를 반복 합니다.
   3. PBS를 삭제 하 고 씻어 RBCs를 사용 하 여 추가 실험을 위해.

2입니다. deoxygenation

1. PRP의 혼합물의 1 mL을 추가 (준비 단계 1.1.4에서에서. 또는 1.2.4.) 및 폴 리 프로필 렌 병 고무 마 개와 함께 폐쇄에 원하는 (1.3 단계에서에서 준비.) Rbc. 예를 들어 20%가에서 Rbc의 200 µ L PRP의 800 µ L를 추가 합니다.
   참고: 제안 hematocrits는 0%에서 최대 40%까지. 혈소판 유리 표면에 고착으로 유리병 이나 플라스 크를 사용 하지 마십시오.
2. 닫힌된 병으로 헬륨 가스 탱크에 연결 하는 바늘을 삽입 하 고 26 G 바늘 (그림 1)를 삽입 하 여 가스 콘센트를 확인.
3. 천천히 병을 실 온에서 소용돌이 친다.
   참고: 혈액 준비를 통해 거품을 그 가스를 허용 하지 않습니다. 느린 가스 흐름은이 절차를 그리고 증가 혈 지나치게 빠른 그 가스 흐름 리드. 그것은 매우 실험적인 체제의 형상에 따라 가장 효율적인 가스 흐름은 재판에 의해 결정 될 필요가 있다.
4. 정기적으로 공동 산소 농도계를 사용 하 여 부분적인 산소 압력 (포₂)를 측정 하 여 deoxygenation 프로세스를 따릅니다.
   참고: 우리의 손에서 deoxygenation 감소 포₂ 아 질산염 감소 Rbc. deoxygenation 계속 필요한 25 mmHg의 10 분 않았다 더 줄일 포₂ 10 mmHg; 그러나, 그것은 증가 혈을 증가 셀 무료 헤모글로빈 (그림 2)에 이르렀다.

3. 적혈구 아 질산염 감소

1. 나노₂ 아 질산염의 500 m m 재고 솔루션의 0.0345 g으로 1 mL의 PBS (pH 7.4)을 추가 합니다. PBS (pH 7.4)에 직렬 희석 하 여 500 m m 나노₂ 250 µ M 나노₂ (25 x)을 희석.
2. microsyringe을 사용 하 여, 샘플의 총 1 mL에 10 µ M의 최종 농도 달성 하기 위해 PRP와 Rbc deoxygenated 샘플으로 심장 통해 질산염 (40 µ L) 주사.
   참고: 이 실험에서 사용 하는 아 질산염의 최종 농도 10 µ M입니다.
3. 37 ° C 10 분 이상에서 샘플을 품 어.
   참고: 아 질산염 최대 아 질산염 감소 실험의 다른 유형에 대 한 필요와 RBC 외피의 정확한 기간을 조정 합니다.
4. Microcentrifuge 튜브에 스 토퍼와 피 펫 샘플의 1 mL를 제거 합니다.
5. 실 온에서 3 분 200 x g 에서 원심.
6. 플라스틱은 상쾌한의 상단 부분에서 혈소판의 서 스 펜 션의 300 µ L 고 ACD (pH 6.5) 1:9 비율로 혼합. RBC 펠 릿을 삭제 합니다.
7. 실 온에서 4 분 동안 500 x g 에서 혈소판 정지 원심
8. 얼음 처럼 차가운 세포의 용 해 버퍼 (150 m m NaCl, 50 mM Tris, 0.5 %NP-40, pH 7.4)의 80 µ L 추가 펠 릿 프로 테아 제 억제제를 포함 하는 혈소판에 칵테일 III (1: 500).

4. 서 부 럽 VASP의

1. 각 샘플의 단백질의 15 µ g 2 별도 10 %SDS-PAGE 젤에 로드 합니다.
   참고: B-mercaptoethanol을 포함, 가혹한 스트립 버퍼 막;에서 P-VASP^Ser239 와 VASP 항 체를 제거할 수 없습니다. 따라서, P-VASP ^Ser239 와 VASP 실행 되어야 합니다 별도로.
2. 니트로 막에 120 V 1.30 h와 전송에는 젤을 실행 합니다.
3. 블록 비 특정 바인딩 5% 비 지방 건조 우유와 함께.
4. 4 ° c.에 하룻밤을 위해 P-VASP^Ser239 (1: 500), VASP (1:1, 000)와 GAPDH (1:1, 000) 멤브레인을 품 어
5. 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 실 온에서 45 분 막으로 이차 항 체를 품 어.
6. 영상 기계 막 하 고 계량 ImageJ를 사용 하 여 밴드 밀도.

결과

정 맥 혈액 샘플 50-80 mmHg 사이 포₂ 값을 가질. 헬륨에 의해 deoxygenation는 급속 하 게 포₂ 10 분 증가 deoxygenation 시간 약간 더 감소 포₂이내 25 mmHg 감소합니다. 그러나, deoxygenation의 시간을 증가 또한 셀 무료 헤모글로빈 (시각적으로 플라즈마의 점점 붉은 채색으로 그림 2 에서 본 공동 속도도 결정)의 크게 증가 수준에 연결 (그림 2A-B). 증가 된 혈은 감동 감동 deoxygenation 없이 혈 (그림 2C)을 유도 하지 않습니다 때문에 연관 된다.

토론

혈소판은 쉽게 활성화 하 고, 이후 부드러운 처리 포함 하는 혈소판의 샘플은 필요. 빠른 pipetting 및 활기찬 동요는 피해 야 한다. Prostacyclin (PGI₂) 같은 혈소판 억제제는 혈소판 활성화;을 방지 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그러나,이 혈소판 내의 일부 신호 경로 영향을 수 있습니다. 혈소판 펠 릿의 준비에 대 한 우리 혈소판 정지에 ACD를 추가 하 고 낮은 속도 원심 분리를 사용 하 여.

PRP에 갓된 혈소판, 최대 2 시간에 걸쳐 제한 된 생활을 했습니다. 높은 재현성을 달성 하기 위해 모든 실험 할 수만 신선한 혈소판 및 2 시간 이내 혈 후. 표시 데이터는 씻어 혈소판 보다 더 생리 적인 것으로 간주 됩니다 PRP의 혈소판으로 획득 했다. 수명 및 순도 씻어 혈소판 증가, 비록 씻어 혈소판의 준비 하는 동안 반복된 원심 그들의 자발적인 활성화를 이어질 수 있습니다 그리고이 혈소판 준비의 일관성 없는 품질에서 발생할 수 있습...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
NIH 혈액 은행			Tri-sodium citrate
구연산	NIH 혈액 은행
Glucose	Sigma	G7528-250G
NaCl; 염화나트륨	Sigma	S-7653 1kg
NaH2PO4; 인산나트륨 monobasic, monohydrate	Mallinckrodt Chemical	7892-04
KCl; 염화칼	Mallinckrodt Chemical	6858
NaHCO3; 중탄산나트륨	Mallinckrodt Chemical	7412-12
HEPES; N- [2- 하이드 록시 에틸] 피페 라진 -N'- [-에탄 술폰산]	시그마	H3375-500g
MgCl2 < / sub > (1 M); 염화 마그네슘	품질 생물학	351-033-721
CaCl2< / sub>; 염화 칼슘	시그마	C5080-500G
Nalgene 좁은 입 HDPE 이코노미 병	Nalgene	2089-0001
Red septum 스토퍼 NO.29	Fisherbrand	FB57877
NaNO2-; 아질산나트륨	시그마	S2252-500G
TRIZMA 베이스; 트리스 [하이드 록시 메틸] 아미노 메탄	시그마	T8524-250G
NP-40; 4- 노닐 페닐 폴리에틸렌 글리콜	시그마	74385-1L
프로테아제 억제제 칵테일 세트 III	Calbiochem	539134
Phospho-VASP (Ser239)	항체 세포 신호 기술	3114
VASP 항체	세포 신호 전달 기술	3112
GAPDH (14C10) 토끼 mAb	세포 신호 전달 기술	2118
2-메르캅토에탄올	시그마	M-6250-10ml
과산화효소 Affini순수 염소 안티 토끼 IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Laboratories	111-035-003
Clarity Western ECL Substrate	BIO-RAD	1705060-200ml
CO-oximeter (ABL 90 flex)	복사계