방법 논문

건설 기계 3-차원으로 2 차원 Electrospun Nanofiber 매트의 확장

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DOI:

10.3791/58918

⸱

2019년 1월 7일

 ,  ,  , 
1Department of Surgery-Transplant and Mary & Dick Holland Regenerative Medicine Program, University of Nebraska Medical Center

이 논문에서

요약

이 문서에서는 덜한 CO2 의 depressurization 통해 3 차원 (3D) 비 계에 전통, 2 차원 (2D) electrospun nanofiber 매트를 확장 하는 기술을 보여 줍니다. 이러한 증강된 건설 기계는 3D, 밀접 하 게 모방 세포 nanotopographic 신호, 고는 nanofibers 캡슐화 하는 생물 학적 분자의 기능을 보존 한다.

초록

전기 생산 하는 합성, 기능성 비 계 세포 외 기질을 구성, 구조 및 섬유의 직경의 용이성 제어 biomimicry 때문에 선호 기술 되었습니다. 그러나, 이러한 장점에도 불구 하 고 건설 기계와 함께 제한 등 전통적인 electrospun nanofiber 무질서 nanofiber 방향, 낮은 다공성, 작은 숨 구멍 크기 및 주로 2 차원 매트. 따라서, 위의 한계를 극복할 수 있는 electrospun nanofiber 건설 기계 조작에 대 한 새로운 프로세스를 개발 하기 위한 훌륭한 필요가 하다. 여기, 소설 하 고 간단한 방법 설명입니다. 전통적인 2D nanofiber 매트는 원하는 두께, 간격 거리, 다공성와 셀 시드 및 덜한 CO2 의 depressurization 통해 확산에 대 한 허용 하도록 nanotopographic 신호 3D 발판으로 변환 됩니다. 발생 조직 재생에 대 한 비 계를 제공 하,이 메서드는 또한 지역 약물 전달에 대 한 항균 성 펩 티 드 등 생리 활성 분자를 캡슐화 하 기회를 제공 한다. CO2 확장 nanofiber 건설 기계 조직 재생, 상처 치유, 3 차원 조직 모델링 및 국 소 약물 전달에 큰 잠재력을 보유.

서론

조직 수리 및 재생에 도움 환자에 이식 될 수 있는 합성 비 계 개발의 개념은 수십 년 동안 재생 의학 분야를 침투 하는 것 이다. 이상적인 합성 비 계 주변의 건강 한 조직에서 세포 이동 유도 하는 역할 셀 시드, 접착, 신호, 확산, 및 차별화, 지원 vascularization에 대 한 아키텍처를 제공, 적절 한 산소에 대 한 수 고 영양 공급, 성공을 보장 하기 위해 이식1후 호스트 면역 활동을 촉진 하는 고. 또한, 그것은 사용할 수 있습니다 캐리어로 항균 분자를 포함에 대 한 상처 치유1,3,6,7,,89을 지원 하기 위해. 합성 비 계에서이 생물 학적 분자의 임시 릴리스를 제어 하는 능력은 공학1를 투어 하는 때 간주 되는 또 다른 바람직한 특성입니다.

전기 생산 nanofiber 건설 기계1,2,,34,,56정상적 기술 되었습니다. 여기서 설명 하는 나와 같은 nanofiber 발판을 만들려고 이전 시도 성공의 다양 한 각도에 수행 되었습니다. 그러나, 전통적인 nanofiber 건설 기계는 이러한 목표를 달성 하는 능력을 제한 했다. 전통적인 nanofiber 건설 기계는 주로 2 차원 매트1,3되었습니다. 이러한 nonexpanded 건설 기계는 밀도가 작은 기 공 크기; 가득한 이 세포 침투, 마이그레이션, 그리고 차별화 vivo에서1,7,,89그 만큼 유사한 환경 홍보 하지 않습니다로 제한 합니다. 이러한 이유로, 3D electrospun nanofiber 비 계 준비의 더 새로운 기술은 2D nanofiber 매트와 함께 제공 되는 고유의 결함을 수정 설립 되었습니다. 이러한 기술의 결과 3D 건설 기계; 그러나, 그들은 수성 해결책을 요구 하 고 절차 동결 생산 방법으로 적용을 제한 했다. 이 처리 없이 제한 된 조직, 적절 한 두께 및 셀 마이그레이션 및 확산에 필요한 적절 한 nanotopographic 신호를 제공 하기 위해 원하는 다공성 nanofibers의 무작위 분포에서 발생 합니다. 이러한 요인 결과 부족 생활의 적절 한 흉내 이전 3D electrospun nanofiber 건설 기계 조직1,7,,89.

세포 외 기질 (ECM)의 더 나은 biomimicry와 확장, 3D 비 계 개발에 최근 시도의 더 나은 제어에 도움이 수성 나트륨 borohydride (NaBH4) 솔루션 처리 및 미리 금형을 사용 하 여 수행 되었습니다 있는 그 결과의 모양 발판7,8. 그러나,이 방법은 고분자와 수용 성 있는 어떤 캡슐된 쓰이므로 방해할 수 있는 수성 해결책, 화학 반응 및 동결의 사용을 필요로 적합 하지 않습니다. 사용 되는 첨가제 조직 재생8,9동안 부작용을 일으킬 수 있습니다. CO2 확장 방법 크게이 문서에 설명 된 처리 시간, 수성 솔루션에 대 한 필요성을 제거 및 금액 및 생물학적 활성 분자 보다 더 큰 범위를의 기능을 유지는 이전 설립된 방법9.

이전 연구, 항생제, 실버, 1α, 25 dihydroxyvitamin D3및 항균 성 펩 티 드에 LL-37 로드 nanofiber 건설 기계에 개별적으로 및 에이전트를 해제 이러한 장비의 잠재력을 조사 하는 조합 더 상처 치유9,10,,1213에 도움이. 시연 nanofiber 비 계 확장의이 방법, 목적 Coumarine 6, 형광 염료, 원하는 다양 한 화합물과 발판을 포함의 가능성을 입증을 발판으로 로드 됩니다. 캡슐화 된 생리 활성 분자와 함께에서 확장된 nanofiber 비 계 제조의이 방법은 조직 재생, 상처 치유, 3 차원 조직 모델의 생성 그리고 약물의 국 소 전달에 큰 잠재력을 보유 하고있다.

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프로토콜

아래에 설명 된 모든 vivo에서 절차는 네브라스카 대학 의료 센터에 IACUC 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 표준 전기에 대 한 솔루션을 준비 합니다.

  1. 20 mL 유리 튜브에 해산 poly(ε-caprolactone)의 2 세대 (PCL, Mw = 80 kDa) dichloromethane (DCM)의 용 매 혼합물에와 N, N-dimethylformamide (DMF) 10% (w/v)의 농도에 4:1 비율 (v/v)와 함께.
    주의: 핸들 DCM와 DMF 통풍이 잘되는 후드에서 가스에 노출을 피하기 위해. 플라스틱 재료에 DCM을 노출 하지 마십시오.
  2. 솔루션 취소 될 때까지 실험실 회전에 유리 튜브를 놓습니다. 솔루션 하룻밤 혼합 수 있습니다.
  3. 발판에 펩 티 드 또는 마약 같은 생리 활성 물질을 포함 하는 것을 예정 하는 경우 별도 솔루션을 만들고 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 저장 합니다.
    1. PCL 솔루션의 20 mL를 사용 하 여 형광 염료 솔루션 (50 mg/mL)를 준비 합니다.

2. 전기 장치 (그림 1A)를 설정

  1. 21 게이지 무딘 바늘 연결 20 mL 주사기를 PCL 솔루션을 추가 합니다. 주사기와 연결 된 튜브에 공기 확인 합니다.
  2. 지상 수집기 바늘 끝에서 12cm 회전 스틸 드럼을 배치 합니다.
  3. 악어 클립을 사용 하 여, 바늘을 직류 (DC) 고전압 전원 공급 장치를 연결 하 고 컬렉터 접지 확인 합니다.
    주의: 항상 모든 연결 된 자료를 처리 하기 전에 전원 공급 장치 해제.

3입니다. 전기

  1. PCL 솔루션의 20 mL에 대 한 다음과 같은 주사기 펌프의 매개 변수 설정: 직경 = 20.27 mm, 유량 바늘의 끝에 형성 되 고 작은 물방울 0.5 mL/h. 확인 =.
  2. 생리 활성 분자의 결합을 원하는 경우 공동 축 전기 (그림 1B)에 대 한 허용 하도록 장치를 설정 합니다. 피하 주사 바늘을 사용 하 여 사용자 지정 된 동축 노즐을 만듭니다.
    참고: 이러한 노즐 있습니다 또한 상업적 으로입니다. 참고 솔루션 염료의 추가 같은 분자 시뮬레이션을 준비 합니다.
    1. 준비 물에서 Coumarin 6 형광 염료의 1% 솔루션. 작은 주사기를 1% 염료의 3 mL를 추가 합니다. PCL 솔루션으로 동일한 동축 노즐에 주사기를 연결 합니다. 다시 한번, 아니 공기 방울 인지 확인 합니다.
    2. 이 3 mL 솔루션에 대 한 다음과 같은 주사기 펌프의 매개 변수 설정: 직경 9.49 m m, 유량 = = 0.02 mL/h. 검사 바늘의 끝에 형성 되 고 작은 물방울.
  3. 20의 전기 잠재력을 적용 kV spinneret (22-게이지 바늘)와 지상 수집기 사이의 위치는 spinneret에서 20 cm. 2000 rpm에 회전 드럼에 정렬된 nanofiber 매트를 수집 합니다. 그들은 ~ 1 m m의 두께 도달 PCL nanofiber 매트를 수집 합니다.

4. 세대의 PCL Nanofiber 매트 기준점과 구멍.

  1. PCL nanofiber 매트를 조작.
    1. PCL 구슬 DCM와 DMF의 10% (PCL) (w/v)의 농도에 4:1(v/v)의 비율로 구성 된 용 매 혼합물을 분해. PCL 솔루션 0.7 mL/h 20의 잠재력 동안 주사기 펌프를 사용 하 여의 유량에 펌프 kV spinneret (22-게이지 바늘) 사이 적용 되 고 접지 된 콜렉터는 spinneret 외 12 cm.
    2. Nanofiber 막 500 rpm 보다 더 큰 회전 속도와 회전 드럼을 사용 하 여 수집 합니다.
  2. PCL nanofiber 매트 액체 N2 5 분 동안 담가 (즉., 뻣 뻣 한 될). 액체 N2 에서 PCL nanofiber 매트를 유지 하 고 PCL nanofiber 매트는 0.5 m m 직경 펀치와 펀치.

5. 2D Nanofiber 확장 매트와 함께/없이 기준점과 구멍 통해 덜한 CO2 액체 (그림 2).

  1. 5 분 동안 액체 질소에 PCL nanofiber 매트를 놓고 가장자리의 변형 방지를 액체 질소에 빠져들 하는 동안 날카로운 수술가 위를 사용 하 여 1 cm x 1cm 사각형으로 잘라.
  2. 드라이 아이스의 ~ 1 g 30 mL 원심 분리기 튜브에서 컷된 매트를 놓습니다. 단단히 뚜껑 캡 그리고 액체 CO2로 변경 하는 드라이 아이스에 대 한 허용.
  3. 액체 튜브에 형성 했다, 일단 신속 하 게 분리 하십시오 압력 뚜껑을 열고.
    주의: 드라이 아이스와 액체 질소를 사용 하는 경우 적절 한 열 보호 장구를 사용 합니다. 얼굴을 향해 가압된 튜브를 열지 마십시오. 원심 분리기 튜브는 반복적으로 사용할 수 없습니다.
  4. 제거 하 고 관에서 부풀어 비 계를 관찰. 드라이 아이스와 함께 새로운 원심 분리기 튜브에 발판을 놓고 원하는 두께 얻을 때까지 반복 합니다. 에틸렌 산화물 세포와 부 화 이전에 확장된 nanofiber 건설 기계를 소독.

6입니다. 확장된 Nanofiber 장비의 특성

  1. 스캐닝 전자 현미경 (SEM)을 사용 하 여 확장된 nanofiber 장비의 구조와 형태를 특징.
    1. 금속 스 터 드, 40에 대 한 백 코트에 이중 면 전도성 테이프와 샘플 배치 s 40에서 스퍼터 coater를 사용 하 여 mA.
    2. 이전 연구9에 따라 SEM을 사용 하 여 섬유를 검사 합니다. 15의 가속 전압에서 이미지를 수집 kV.
  2. 생체 외에서 릴리스 프로필과 bioactivity 출시 된 펩 티 드의 특징.
    1. CO2확장 전후 nanofiber 막의 10 밀리 그램 무게.
    2. PBS 버퍼에서 샘플을 담가 고 상쾌한 다른 시간 포인트 (0-28 일)에서 10 μ를 수집 합니다.
    3. Enzyme-Linked 면역 매 분석 결과 (ELISA) 키트를 사용 하 여 수집 된 상쾌한에 LL-37 펩 티 드 농도 계량.
  3. 세포질 침투 vivo 및 호스트 응답을 검사 합니다.
    1. 9-주 오래 된 넣어 Sprague-Dawley (SD) 쥐를 마 취 챔버에 연결 isoflurane 증기 하 고 쥐를 anesthetize. 쥐 감정 없이 완전 한 마 취 후 쥐를 운영 테이블에 전송 합니다. 지속적으로 쥐 기화와 isoflurane 코 콘을 사용 하 여 수술 하는 동안 anesthetize. 동물의 면도기에 의해 쥐의 뒤의 머리를 면도 하 고 요오드와 알코올 피부 스크럽으로 소독. 메스를 사용 하 여 등에 supraspinal 사이트에서 1.5 c m 절 개를 통해 피하 주머니를 만듭니다.
    2. 각 절에 대 한 족집게를 사용 하 여 피하 포켓에 한 확장된 nanofiber 비 계 (1.5 m m 두께)를 삽입 합니다. 호치키스를 사용 하 여 절 개를 닫습니다.
    3. 1, 2, 및 4 주, 95% CO2쥐를 안락사. 부드럽게는 explant와 수술가 위를 사용 하 여 주변 조직의 해 부. 조직학 분석 전에 적어도 3 일 동안, 조직 포 르 말린에 담가 고 후 파라핀으로 포함. 톰, 조직 섹션 다음 수행 되며 (H & E), 오신 Masson의 trichrome 얼룩.

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결과

3D 건설 기계 덜한 CO2 유체의 depressurization 통해 전통적인 2D electrospun nanofiber 매트 확대의 효능 다른 용량에서 설명 되었다:는 장비의 두께 1 m m 2.5 m m 치료에서 증가 하 고 1 및 2 CO2 치료 19.2 m m 각각 (그림 3A-C). 셀 시드를 위한 중요 한 아키텍처의 다공성을 특징-해당 증가 두께 (그림 3C) 하는 방식에서 또한 증가 했다. 건설 기계 증가 치료 매트 79.5%에서 99.0%와 92.1 첫 번째와 두 번째 치료 후 각각 (그림 3D) 다공성. 이것이 중요 한 비 계 및 따라서 재생을 유도 하는 효능으로 세포 침투의 정도 다공성1

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토론

확장 된 3D 건설 기계2 depressurization 통해 공동 조사에 전통적인 2D electrospun nanofiber 매트를 변환. 전통적인 2D nanofiber 매트는 덜한 CO2 유체 성공적으로 확장 을 통해 . 하는 중요 한 단계는 최적화 된 상태에서 2D nanofiber 매트를 조작 하 고 가장자리를 변형 하지 않고 매트를 잘라 (예. 사용 하 여 수술가 위 샤 프). 이 CO2-확장된 nanofiber 건설 기계 패킹 밀도 (그림 3D-H), 및 (그림 3D) 높은 다공성 적은 계층된 구조 (그림 3A-B), 포함 하 여 전통적인 2D 매트 위에 많은 장점을. 이 확장 메서드 또한 ...

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공개 사항

저자는 충돌의 관심은 선언 합니다.

감사의 글

이 작품은 지원으로 부여에서 국립 연구소의 종합 의료 과학 (NIGMS) (2 P 20 GM103480-06 및 J.X. 1R01GM123081), NIH에서 네브라스카 대학 의료에서 오티 스 글리브 의료 연구 재단, NE LB606 시작 자금 센터입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
폴리 카프로 락톤시그마 알드리치440744
N, N- 디메 틀리 포름 아미드피셔 화학D-199-1
디클로로 메탄피셔 화학AC61093-1000
쿠마린 6시그마 알드리치546283
회전 스틸 드럼사용자 정의이것은 전기 방사 중 수집기 역할을합니다.
주사기 펌프Fisher Scientific14-831-200동축 회전에는 두 개의 단일 주사기 펌프가 필요합니다.
RevolverLab Net InternationalH5600혼합 용액을 위한 조절 가능한 실험실 회전 장치
피하 주사 바늘 (27G x 1 1/2")EXCELINT International Co26426이것은 표시된 맞춤형 동축 노즐 예제의 일부입니다.
피하 주사 바늘 (21G x 1 1/2")EXCELINT International Co26416이것은 보여진 맞춤형 동축 노즐의 일부입니다.
고전압 DC 전원 공급 장치감마 고전압 연구ES30
주사 전자 현미경FEINova 2300
형광 현미경ZeissAxio Imager 2
LL 37 ELISA 키트Hycult BiotechHK321-02

참고문헌

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  3. Xie, J., Li, X., Xia, Y. Put electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromolecular Rapid Communication. 29 (22), 1775-1792 (2008).
  4. Xie, J., et al. Nanofiber membranes with controllable microwells and structural cues and their use in forming cell microarrays and neuronal networks. Small. 7 (3), 293-297 (2011).
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  6. Xie, J., et al. "Aligned-to-random" nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
  7. Jiang, J., et al. Expanded 3D Nanofiber Scaffolds: Cell Penetration. Neovascularization, and Host Response. Advanced Healthcare Materials. 5 (23), 2993-3003 (2016).
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  11. Dhand, C., et al. Bio-inspired crosslinking and matrix-drug interactions for advanced wound dressings with long-term antimicrobial activity. Biomaterials. 138, 153-168 (2017).
  12. Jiang, J., et al. Local sustained delivery of 25-hydroxyvitamin D3 for production of antimicrobial peptides. Pharmaceutical Research. 32 (9), 2851-2862 (2015).
  13. Jiang, J., et al. 1α, 25-dihydroxyvitamin D3-eluting nanofibrous dressings induce endogenous antimicrobial peptide expression. Nanomedicine (Lond). 13 (12), 1417-1432 (2018).
  14. Ma, B., Xie, J., Jiang, J., Shuler, F. D., Bartlett, D. E. Rational design of nanofiber scaffolds for orthopedic tissue repair and regeneration. Nanomedicine. 8 (9), 1459-1481 (2013).

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