여기에 제시된 프로토콜은 체외 신경 내피 공동 배양 시스템과 sialoglycan의 대사 통합을 생체 장태 작용기와 결합하여 1 차적인 신경 줄기 및 전구 세포를 확장하고 그들의 표면에 레이블을 붙이는 프로토콜입니다 세포 표면 마커의 화상 진찰 또는 질량 분광분석을 위한 sialoglycoproteins.
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방법 논문
Sialoglycan의 신진 대사 표지에 의하여 1 차적인 신경 줄기 및 전구 세포의 세포 표면 마커를 확인
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
신경 줄기와 전구 세포 (NSPC)는 뇌의 복잡한 구조와 기능에 대한 세포 기초입니다. 그들은 생체 내에서 전문 틈새 에 위치 하 고 분리 하 고 생체 외에서확장 될 수 있습니다., 뇌 손상을 복구 하는 세포 이식에 대 한 중요 한 자원 으로 봉사. 그러나, NSPC는 이질적이며 분자 수준에서 명확하게 정의되지 않거나 특정 세포 표면 마커의 부족으로 인해 정제된다. 이전에 보고된 프로토콜은, 1 차적인 NSPC의 표면 sialoglycoproteome를 확인하기 위하여 신진 대사 글리칸 표지 방법과 신경 내피 공동 배양 시스템을 결합합니다. NSPC-내피동 공동 배양 시스템은 체외에서1차 NSPC의 자가 갱신 및 확장을 허용하며, 충분한 수의 NSPC를 생성합니다. 생체 오르토고그나 작용그룹. 신경 배양과 분화한 신경 배양과 내피 공동 배양에서 확장된 자가 갱신 NSPC의 sialoglycoproteome를 비교하여, 우리는 NSPC에서 풍부하게 되는 막 단백질의 목록을 확인합니다. 구체적으로, 프로토콜은 다음과 관련된다: 1) NSPC 내피 공동 문화 및 NSPC 차별화 문화의 설정; 2) 아세틸화 N-아지도아세틸만노사민 당 아지도슈가체(Ac4ManNAz)로 라벨링; 및 3) 비오토틴 컨쥬게이션은 질량 분석 분석을 위한 신경 배양 또는 단백질 추출의 고착 후 이미징을 위한 변형된 시로글리칸이다. 이어서, NSPC 농축 표면 마커 후보기는 확장된 NSPC 및 차별화된 신경 배양 모두에서 질량 분석 데이터의 비교 분석에 의해 선택된다. 이 프로토콜은 시작 물질에서 낮은 풍부의 막 단백질을 식별하기 위해 매우 민감하며 적절한 수정을 통해 다른 시스템에서 마커 발견에 적용 할 수 있습니다.
서론
신경 줄기 세포는 줄기 세포 풀을 유지하고 뉴런과 glia로 분화하기 위하여 자기 갱신할 수 있는 다능한 세포 인구로 정의됩니다. 그(것)들은 신경계에 있는 중요한 세포 모형이고 병에 걸린 및 상해한 두뇌로 세포 이식을 통해 재생 의학에 있는 중대한 치료 잠재력을 제안할 수 있습니다1,2. 발달이 진행됨에 따라, 신경 줄기 세포 집단은 이질적인된다 3,4,뇌의 신경 줄기 세포의 비율은 점차 감소5. 일반적으로 말하자면, 배아 신경 줄기 세포 및 다른 신경 전구 세포는, 총칭하여 신경 줄기 및 전구 세포(NSPC)라고 불리며, 마우스6의발아 지역, 심실 영역 및 심실 영역에 위치한다. 배아 뇌에서, 신경 줄기 세포는 중간 전구 세포 (IPC)를 통해 직간접적으로 뉴런을 생성하고, 일부 종에서는 외부 심실 영역 전구 (oRGs)7,8. 특정 분자 시그니처, 형태, 줄기 세포 틈새 시장 내의 위치, 및....
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프로토콜
이 연구에 사용된 모든 동물 프로토콜은 칭화 대학의 IACUC(기관 동물 관리 및 사용 위원회)에 의해 승인되었으며 IACUC의 지침에 따라 수행되었습니다. 칭화대학의 실험실 동물 시설은 AAALAC(실험실 동물 보호 국제 평가 및 인증 협회)의 인증을 받았습니다. 배아의 발판을 위해, 확인된 질 플러그의 정오는 배아일 0.5(E0.5)로 계산되었다.
참고: 모든 세포는 37°C 및 5%CO2의조건하에서 세포 인큐베이터에서 배양된다.
1. 투과성 지원 삽입에서 마우스 내피 문화의 준비
참고: BEND3 셀은 제조업체의 지침에 따라 유지됩니다.
- FBS 50 mL과 페니실린 스트렙토마이신 5 mL을 DMEM 500 mL에 추가하여 BEND3 세포 배지 (BM)를 준비하고 잘 섞습니다.
- 접시에서 배지를 흡인하고 BEND3 세포 배양을 PBS 1 mL로 1회 세척한다. 0.25% 트립신-EDTA의 1 mL을 세포에 넣고 37°C에서 4분 동안 세포를 배양합니다.
- Bm 1 mL을 세포에 추가하여 트립신-EDTA를 중화시키....
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결과
1 차적인 배아 NSPC의 시험관 내 확장 및 대사 표지에 대한 전체 절차는 6 일 걸립니다(그림 1A). BEND3 세포주 및 갓 분리된 1차 NSPC의 품질은 성공적인 실험의 핵심입니다. BEND3 세포는 NSPC의 자기 갱신 그리고 증식을 자극하는 수용성 요인의 근원입니다. BEND3 세포는 어떤 오염도 없고 신경 세포와 공동 배양하기 전에 최소한의 세포 사멸로 활발하게 분할된다는 것을 보장해야 합니다. 1차 NSPC는 해리 시 과도한 손상을 방지하기 위해 신중하게 준비해야 합니다. 손상된 NPC는 여전히 성장하고 차별화 할 수 있습니다. 그러나, 그들은 줄기를 유지 하 고 확장 내 피 자극에 잘 응답 할 수 없습니다. 프로토콜이 1 차 적인 배양 매체에 항생제의 추가를 건의하지 않기 때문에, 세포 배양 도중 무균되기 위하여 추가 주의를 취해야 합니다.
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토론
표면 마커는 일반적으로 시험관 내 및 생체 내 특정 세포 유형을 라벨화하고 정화하는 데 사용되며17,18. 표면 마커의 발견은 정상 또는 병리학 조직 및 배양 접시에서 줄기 세포 집단을 선택적으로 풍부하게하는 분자 도구를 제공함으로써 재생 의학 및 줄기 세포 연구에 크게 기여하고 정제 된 세포를 제공합니다. 생물학적 특성의 임상 적 사용 또는 연구를위한 자원. 그러나, 신경 줄기 세포 연구를 위한 표면 마커 개발에 있는 진행은 1 차적인 조직에서 줄기 세포를 분리에 있는 어려움 때문에 느렸습니다. 여기서 설명된 프로토콜은 단순화된 체외 플랫폼을 기반으로 합니다. 내피 동문화에 의해 확장된 1차 NSPC를 분화신경 배양에 비교함으로써, 확장된 NSPC에서 분과적으로 발현되는 단백질이 강조되고 추가 식별이 가능합니다. 우리의 프로토콜은 또한 생체 대각선 그룹으로 sialoglycan를 표시하는 본질적인 신진 대사 통로를 납치해서.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
그림 1B, 1C, 1E 및 1F는 바이에서 재현 외 . 10개 왕립 화학 협회의 허가를 받아야 합니다. X씨연구소의 이하오씨님에게 그림 편집에 감사드립니다. 이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (Q. S. 및 X.C.에 91753206, Q.S.에 31371093, 번호 21425204 및 21672013 X.C.)에 의해 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| BEND3 | ATCC | CRL-229 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| L-글루타민 | Gibco | 25030081 | 1% |
| 피루브산나트륨 | Sigma P5280 | 1% | |
| N2 보충제 | Gibco | 17502048 | 1-100 |
| N-아세틸-L-시스테인 | Sigma | A7250 | 1 mM |
| 파파인 | Worthington | LS003726 | 10 U/mL |
| B27 보충제 | Gibco | 17504044 | 1 to 50 |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Basic Fibroblast growth factor | Gibco | PHG0261 10 ng/mL | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 1% |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099141 | 10% |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| Tripsin-EDTA, 0.25% | Gibco | 25200056 | |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| Transwell | Corning | 3450 | |
| 파라포름알데히 | 드 시그마 | 158127 | 4% |
| 자 | 상곤 | A100335 | |
| DAPI | Gibco | 62248 | |
| RIPA 완충액 | Thermo Scientific | 89900 | |
| SDS-PAGE 로딩 완충액 2x | Solarbio | P1018 | |
| 6웰 플레이트 | Corning | 3335 | |
| Tris-Glycine 단백질 겔 | invitrogen | xp00100box | |
| 마우스 단클론 항 네스틴 | 개발 연구 Hybridoma Bank | Rat-401 | 1 to 20 |
| 마우스 단클론 항 베타 튜불린 III | 시그마 | T8860 | 1-1,000 |
| Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스 IgG1 | invitrogen | A-21121 | 1-1,000 |
| Alexa Fluor 546 염소 안티 마우스 IgG2b | invitrogen | A-21143 | 1-1,000 |
| 알부민 소 V | Amresco | 0332 | |
| 트리톤 X-100 | Amresco | 0694 | |
| BCA 분석 키트 | Thermo Scientific | 23225 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Brij97 | Aladdin | B129088 | |
| CuSO4 | Sigma | 209198 | |
| Alkyne-biotin | Click Chemistry Tools | TA105 | |
| BTTAA | Click Chemistry Tools | 1236 | |
| Ac4ManNAz | 클릭 화학 도구 | 1084 | 100 &마이크로; 실험실 |
| 에서 합성된 | 9AzSia | ||
| 아스코르브산나트륨 | 시그마 | A4034 | |
| 메탄올 | 시그마 | 34860 | |
| EDTA | 상곤 | A100322 | |
| NaCl | 상곤 | A100241 | |
| SDS | 상곤 | A100227 | |
| 알렉사 가루 647-공액 스트렙타비딘 | invitrogen | S21374 | 1 to 1,000 |
| Triethanolamine | Sigma | V900257 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | invitrogen | 60210 | |
| 중탄산암모늄 | 시그마 | 9830 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Thermo Scientific | 20278 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co. | 970-00026-00 | |
| DNase I | 시그마 | DN25 | 12 &마이크로; g/mL |
| 요소 | 시그마 | U5378 |
참고문헌
- Weissman, I. L. Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Gage, F. H., Temple, S. Neural Stem Cells: Generating and Regenerating the Brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
- Gal, J. S.
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재인쇄 및 허가
