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방법 논문

Pretargeted Radioimmunotherapy 역 전자 수요 Diels 오리 나무 반응에 따라

7.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59041

⸱

2019년 1월 29일

 ,  , 
1Department of Chemistry, Hunter College of the City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

이 논문에서

요약

이 프로토콜 합성 및 트랜스-cyclooctene (TCO)의 특성에 설명 합니다-항 체와 177루 표시 tetrazine (Tz) radioligand pretargeted radioimmunotherapy (PRIT)에 대 한 수정. 또한, 그것은 자세히 biodistribution vivo에서 및 colorectal 암의 murine 모델에 경도 치료 연구에 대 한 이러한 두 가지 구조를 사용 하 여를 설명합니다.

초록

Radioimmunotherapy (RIT) 암 치료에 대 한 유망한 접근은, 건강 한 조직에 높은 방사선 복용량 방사선된 항 체의 긴 pharmacokinetic 반감기 발생할 수 있습니다. 아마 당연한 일로, 여러 가지 다른 전략이 문제가 제한 우회 개발 되었습니다. 이러한 접근의 가장 유망한 중 하나입니다 pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). PRIT는 비보에 대상 조직에 결합 하는 면역 글로불린에서 방사성 핵 종 분리, 별도로, 그들에 게 주입 하 고 다음 있도록에 입각 한입니다. 이 이렇게 pharmacokinetic 그들의 단점을 굽 도리 널, 그로 인하여 비 표적 조직에 방사선 복용량을 낮추는 고 반감기를 가진 방사성 핵의 사용을 촉진 하는 동안 항 체의 뛰어난 종양을 대상으로 속성을 보여준다 전통적인 radioimmunoconjugates에 대 한 너무 짧은 사용으로 간주 됩니다. 지난 5 년 동안 우리의 실험실과 다른 비보에 트랜스-cyclooctene (TCO) 및 tetrazine (Tz) 사이 역 전자-수요 Diels 오리 나무 (IEDDA) 반응에 따라 pretargeting에 대 한 접근을 개발 했습니다. 이 전략을 성공적으로 pretargeted 양전자 방출 단층 촬영 (PET)에 적용 된 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT) 항 체-항 원 시스템의 다양 한 이미징 및. 최근 간행물의 쌍, 우리 IEDDA 기반 PRIT 췌 장 ductal 선 암과 대 장 암 murine 모델에서의 효능을 증명 하고있다. 이 프로토콜에서 177루 DOTA 라는 tetrazine radioligand를 사용 하 여 PRIT에 대 한 프로토콜 설명 ([177루] 루-DOTA-말뚝7-Tz)와 huA33 항 체 (huA33-TCO)을 대상으로 대 장 암의 TCO 수정 변종. 좀 더 구체적으로, 우리 huA33 TCO, 합성 [177루]의 radiolabeling 루-DOTA-말뚝7의 건설을 설명 합니다-Tz, vivo에서 biodistribution와 murine 모델에서 경도 치료 연구의 성과 대 장 암입니다.

서론

Radioimmunotherapy (RIT)-사용 항 체의 종양 치료 방사성의 배달에 대 한-긴 암1,2의 치료에 대 한 유혹 접근 되었습니다. 실제로,이 약속 했다 비-Hodgkin의 림프 종 치료에 대 한 두 개의 radioimmunoconjugates의 미국 식품 및 의약품 안전 청의 승인에 의해 강조 되었습니다: 90Y ibritumomab tiuxetan 및 131-tositumomab3 , 4. 초기 일에서 새끼의 임상 전망 중요 한 합병증에 의해 방해 되어 아직: 건강 한 조직이5,6높은 방사선 복용량 비율. 일반적으로 말하자면, 미 모에 대 한 radioimmunoconjugates 수명이 긴 방사성 표시 됩니다 (예: 131나 [t½ = 8.0 일] 90Y [t½ = 2.7 일]) 물리적 반감기와 잘 사 개 그와 면역 글로불린의 긴 pharmacokinetic 절반-삶입니다. 이것은 필수, 그 충분 한 방사능 항 체의 최적의 biodistribution 순환의 몇 일 후에 도달 되 면 남아 보장. 그러나,이 긴 거주 시간 혈액에 긴 물리적 반감기의 필연적 결과이 조합 하지 함으로써 치료 비율을 감소 하 고 제한 치료7의 효능 건강 한 조직에의 방사선 조사에. 여러 전략 잘린된 항 체 파편 팹, 팹 등의 사용을 포함 하 여이 문제를 회피 하 탐험 되어 ', F(ab')2, minibodies, 및 nanobodies8,,910. 한의 가장 유망 하 고 매혹적인, 아직 명백 하 게 복잡 한, 대체 접근에 vivo에서 11pretargeting입니다.

Vivo에서 pretargeting 핵 영상과 치료 그들의 pharmacokinetic 단점11,,1213를 굽 도리 널 하면서 절묘 한 선호도 및 항 체의 선택도 활용 하고자 하는 접근 이다. 이 위해, 전통적인 radioimmunotherapy에서 이용 된 방사선된 항 체는 두 가지 구성 요소에 deconstructed: 작은 분자 radioligand와는 immunoconjugate 종양 항 원 및 상기 radioligand 모두 바인딩할 수 있습니다. immunoconjugate 먼저 주입 하 고 주어진 ' 시작 ', 종종 몇 일 동안 그것은 대상 조직에 축적 하 고 혈액에서 지웁니다. 그 후, 작은 분자 radioligand 관리 하 고 종양에 immunoconjugate와 결합 하거나 빠르게 시체에서 지웁니다. 본질적으로, vivo에서 pretargeting radiochemistry 본문 자체 내에서 수행 시 사용 합니다. 방사능의 순환을 줄임으로써,이 이렇게 동시에 건강 한 조직에 방사선 복용량을 감소 하 고 방사성 핵의 사용을 용이 하 게 (예를 들어, 68가 t½ = 68 분211; 로, t½ = 7.2 h) 일반적으로 항 체 기반 벡터와 호환 되지 않는 여겨진다 절반 생활.

1980 년대 후반에 시작, vivo에서 pretargeting에 다른 접근의 개발 되었으며, bispecific 항 체, streptavidin 비타민 b 복합체, 사이 상호 작용에 따라 전략을 포함 하 여 및 보완의 교 잡 oligonucleotides14,15,,1617,18. 아직 각 개최 되었습니다 다시 다양 한 각도에 합병증, 항 체 streptavidin 수정19,20의 가장 고 명 하 게 강력한 immunogenicity 여. 지난 5 년 동안, 우리의 그룹 및 다른 사람 vivo에서 pretargeting는 급속 및 bioorthogonal 역 전자 수요 Diels 오리 나무 결 찰 트랜스-cyclooctene (TCO) 및 tetrazine (Tz) 사이 기반에 대 한 접근을 개발 했습니다. 21,22,,2324. 이 전략의 가장 성공적인 고용 했다 TCO 수정 항 체 및 Tz 베어링 radioligand, TCO는 일반적으로 더 안정 된 vivo에서 Tz 파트너 (그림 1)25,26보다. 다른 pretargeting 방법론에서 mAb TCO immunoconjugate 먼저 관리 하 고 순환에서 하 고 종양 조직에 축적 하는 시간을 주어진. 그 후, 작은 분자 Tz radioligand은 주입 후 대상 조직 내의 immunoconjugate와 함께 클릭 하거나 시체에서 급속 하 게 지웁니다. 이 비보에 전략 pretargeting 입증 되었습니다 매우 효과적인 애완 동물 SPECT 여러 다른 항 체/항 원 시스템 이미징, 지속적으로 높은 콘트라스트 이미지를 생산 및 같은 수명이 짧은 방사성 핵의 사용을 활성화 18 F (t½ = 109 분)와 64Cu (t1/2 = 12.7 h)21,,2224. 더 최근에, 클릭에 기초를 둔 pretargeted radioimmunotherapy (PRIT)의 효능 췌 장 ductal 선 (PDAC) 암 및 대 장 암27,28murine 모델에서 증명 되었습니다. 이 위해 치료 방사성 핵 종 177루 (β최대 498 = 케빈, t1/2 = 6.7 일) 두 개의 서로 다른 항 체와 함께에서 고용 되었다: 5B1, 탄수화물 항 원 19.9 (CA19.9) 편 PDAC 표현 대상 huA33, A33, 대상 막 횡단 당단백질 표현 > 대 장 암의 95%. 두 경우 모두, 177Lu PRIT를이 이렇게 종양 조직에 높은 활동 농도 굴복, 복용량-의존 치료 효과 만들고 동시에 전통에 비해 건강 한 조직에 활동 농도 감소 직접 표시 된 radioimmunoconjugates입니다.

이 문서에서는, 우리는 177루 DOTA 라는 tetrazine radioligand를 사용 하 여 PRIT에 대 한 프로토콜을 설명 ([177루] 루-DOTA-말뚝7-Tz)와 huA33 항 체 (huA33-TCO)의 TCO 수정 변종. 좀 더 구체적으로, 우리는 huA33-TCO (그림 2), 합성 및 [177루]의 radiolabeling 루-DOTA-말뚝7의 건축 설명-Tz (그림 3 및 그림 4), 그리고 에 비보 의 성능 biodistribution 고 대 장 암의 murine 모델에 경도 치료 연구. 또한, 대표적인 결과에 토론, 우리 샘플 데이터 집합,이 방법의 최적화에 대 한 주소 가능한 전략을 제시 하 고 vivo에서 pretargeting 및 PRIT의 넓은 맥락에서이 전략을 고려 하십시오. 마지막으로, 우리 huA33-TCO와 [177루]를 사용 하 여 pretargeting에 초점을 선택 하는 동안 루-DOTA-말뚝7이 프로토콜,이 전략에서에서-Tz 높은 모듈식 이며 다양 한 항 체에 맞게 적용할 수 있습니다 중요 하다 고 방사성 핵 종입니다.

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프로토콜

모든 vivo에서 동물 실험이이 작업에 설명 된 승인 된 프로토콜에 따라 수행 되었고 기념 슬로 안 Kettering 암 센터, Weill 코넬 의료 센터, 그리고 사냥꾼 대학의 윤리 지침에 따라 실행 제도 동물 보호와 사용 위원회 (IACUC)

1. huA33-TCO의 준비

참고: huA33 TCO의 합성 이전에 보고 된29되었습니다. 그러나, 독자의 용이성, 그것은 복제 여기 최적의 조건에 대 한 조정.

  1. 1.7 mL microcentrifuge 튜브에서 준비 (E)-cyclooct-4의 125 μ 솔루션-enyl 2, 5-dioxo-1-pyrrolidinyl (0.15 M) 40 mg/mL의 농도에서 건조 디 메 틸 formamide (DMF)에서 (TCO-보 건국) 탄산염. 이 솔루션은 aliquoted 미래 실험에 사용 하기 위해-80 ° C에서 냉동 수 있습니다.
  2. 별도 1.7 mL microcentrifuge 튜브에서 버퍼링 하는 인산 염 (PBS, 2.7 m m 염화 칼륨, 염화 나트륨 137 m m, 및 11.9 mM 칼륨 인산 염, pH 7.4)의 1 mL에 huA33의 5 mg/mL 해결책을 준비 합니다.
  3. 작은 aliquots를 사용 하 여 (< 5 μ) 0.1 m M 나2CO3, 단계 1.2에서 8.8-9.0에 대 한 항 체 해결책의 pH를 조정. PH 모니터링 및 pH 9.0을 초과 하지 않도록 조심 하는 microelectrode와 pH 종이 또는 pH 미터를 사용 합니다.
  4. 1.3 단계에서에서 설명한 항 체 솔루션을 천천히 TCO-항 체의 양 기준으로 NHS의 40 어 금 니을 해당 볼륨을 추가 합니다. 예를 들어 huA33의 5 밀리 그램 (30 nmol) 솔루션에 경우에, TCO NHS의 40 mg/mL (0.15 M) 솔루션의 9.0 μ (1.20 μmol)을 추가 합니다.
    참고: TCO NHS는 소수. 항 체 해결책에 그것을 추가할 때 천천히 그리고 강 수를 방지 하기 위해 동요와 함께 그것을 추가 합니다. 10%를 초과 하지 않도록 최종 반응 솔루션에서 볼륨으로 DMF.
  5. 온화한 동요 (500 rpm)와 함께 1 시간에 대 한 thermomixer에 25 ° C에서 품 어에 반응을 수 있습니다.
  6. 1 시간 후 사전 포장된 일회용 크기 제외 염 열을 사용 하 여 huA33-TCO immunoconjugate 정화.
    1. 어떤 부식 방지 제는 열에 저장 하는 동안 제거 하는 공급자에 의해 설명 된 대로 크기 제외 열을 equilibrate. 전형적인 절차 5 열 세척 포함 열의 볼륨에 해당 하는 PBS의 볼륨 x: 5 x 2.5 mL PBS의.
    2. 지적 반응 혼합물의 볼륨 크기 제외 열에 반응 혼합물을 추가 합니다.
    3. 반응 혼합물이 열을 입력 한 후 추가 열에 추가 솔루션의 전체 볼륨을가지고 PBS의 적절 한 금액 최대 2.5 mL. 예를 들어 활용 반응 1.3 mL의 전체 볼륨에 있는 경우, 열에 추가 PBS의 1.2 mL를 추가 합니다.
    4. Eluent는 PBS의 2 개 mL를 사용 하 여 제품을 수집 합니다.
      참고:이 단계는 최종 구성 huA33-2 ml PBS, pH 7.4의 TCO를 얻을 것입니다.
  7. 280 nm 파장 모니터링 대 일 분 광 광도 계를 사용 하 여 huA33 TCO의 농도 측정 합니다. 대부분 IgGs (ε280)에 대 한 어 금 니 소멸 계수 210000 M-1c m-1이다.
  8. Immunoconjugate의 높은 농도 가진 해결책을 원하는 경우 집중 50000 분자량 컷오프와 원심 필터 단위를 사용 하 여 huA33-TCO 솔루션 제조업체 지침에 따라.
    참고: 많은 항 체는 집계 하거나 집중 하는 동안 침전 알려져 있습니다. 새로운 항 체로이 절차 때, 연구원 문학 또는 그들의 자신의 경험에 항 체를 처리 지연 해야 합니다.
  9. 즉시 필요한 경우에 어둠 속에서 4 ° C에서 완료 된 huA33-TCO immunoconjugate를 저장 합니다. 나중에 4 일 이상 사용할 경우, 어둠 속에서-80 ° C에서 그것을 저장 합니다.
    참고:이 절차에서 허용 중지 지점입니다. 완성 된 huA33-TCO immunoconjugate 어둠 속에서-80 ° C에 적어도 6 개월 저장 안정 해야 합니다.

2. Tz 말뚝7-NHBoc의 합성

  1. 1.7 mL microcentrifuge 튜브, tetrazine Nhydroxysuccinimidyl-에스테 르 (Tz-보 건국, 12.6 μmol) 무수 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 0.15 ml의 5 mg을 디졸브.
  2. 별도 1.7 mL microcentrifuge 튜브에서 Boc 보호 아미노 못 폴리머, 무수 DMSO의 0.15 ml에서 O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene 글리콜 (NHBoc-PEG7-NH2; 17.1 μmol)의 8 mg을 디졸브.
  3. Tz-NHS의 솔루션 triethylamine (차)의 3 μ (21.3 μmol, 1.7 어 금 니 동등 물)를 추가 하 고 철저 하 게 혼합.
  4. 2.2 단계에서에서 핑크 tetrazine 솔루션 NHBoc 말뚝7-NH2 솔루션을 추가 하 고 온화한 동요와 함께 실 온 (RT)에서 30 분 동안 반응 혼합물을 품 어.
  5. 30 분 후 반응 H2O에서에서 1:1 희석 하 고 Tz 말뚝7에서 어떤 unreacted Tz-보 건국을 반대 상 C18 -고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용 하 여 반응 정화-NHBoc. 산 하지 않고 용 매를 사용 하 여 Boc 그룹 보호의 조기 제거를 방지 하기 위해. 모두 Tz 말뚝7모니터링-NHBoc 및 Tz-보 건국에 525의 파장 nm.
    참고: 보존 회는 분명히 매우 (펌프, 열, 튜브 등),각 연구실의 HPLC 장비에 의존 하 고 적절 한 컨트롤 정화 하기 전에 실행 해야 합니다. 그러나, 만약과 MeCN/H2O의 그라데이션 예제를 제시 (두 없이 어떤 첨가물) 95:5 MeCN/H2O 30 분 이상, 1 mL/min의 유량과 분석 4.6 mm x 250 m m C18칼럼을 사용 Tz NHS와 Tz 못7의 정체 시간-NHBoc는 16 분 및 18 분, 각각.
  6. 액체 질소를 사용 하 여 수집 된 HPLC eluent 동결 하 고 지금 냉동 컬렉션 튜브 알루미늄 호 일에 포장. 장소는 lyophilizer에 언된 컬렉션 튜브 HPLC 모바일 단계를 제거 하려면 하룻밤. 제품 특성 밝은 핑크 솔리드 될 것입니다.
    참고: 액체 질소를 사용할 수 없는 경우 드라이 아이스에서 수집 된 HPLC eluent 동결 또는-80 ° C 냉장고에 하룻밤.

3. Tz 말뚝7-NH2 의 합성

  1. Tz-말뚝7단계 2.6에서 제품-NHBoc, dichloromethane (DCM)의 1.5 mL를 추가 하 고 작은 둥근 바닥 플라스 크에이 솔루션을 전송.
  2. Trifluoroacetic 산 (TFA)의 0.25 mL dropwise 핑크 솔루션에서 추가할 단계 3.1.
  3. 온화한 동요와 RT에 30 분 동안 품 어에 반응을 수 있습니다.
  4. 30 분 후 용 매 를 통해 로타리 증발 증발. 물 목욕 온도 37 ° c를 초과 하지 않는
  5. 물 0.5 mL에 분홍색 점성 제품 reconstitute
  6. Boc 보호 전조에서 Tz 말뚝7-NH2 분리 반대 상 C18 HPLC를 사용 하 여 제품을 정화. 모두 Tz 말뚝7모니터링-NHBoc 및 Tz 말뚝7-NH2 525의 파장 nm.
    참고: 보존 회는 분명히 매우 (펌프, 열, 튜브 등),각 연구실의 HPLC 장비에 의존 하 고 적절 한 컨트롤 정화 하기 전에 실행 해야 합니다. 그러나, 만약과 MeCN/H2O의 그라데이션 예제를 제시 (모두 0.1 %TFA) 95:5 MeCN/H2O 30 분 이상, 1 mL/min의 유량과 분석 4.6 mm x 250 m m C18칼럼을 사용 보존 시간 Tz 말뚝7-NHBoc 및 Tz 말뚝7-NH2 는 약 18 분 및 13 분, 각각.
  7. 액체 질소를 사용 하 여 수집 된 HPLC eluent 동결 하 고 지금 냉동 컬렉션 튜브 알루미늄 호 일에 포장. 장소는 lyophilizer에 언된 컬렉션 튜브 HPLC 모바일 단계를 제거 하려면 하룻밤. 제품에는 밝은 핑크 솔리드 될 것입니다.
  8. Tz-말뚝7-NH2와 DMSO 및 1.7 mL microcentrifuge 튜브에 150 μ 단계 3.7에서 제품 reconstitute
  9. Tz-말뚝7-NH2 525 nm 파장 모니터링 대 일 분 광 광도 계를 사용 하 여 농도 측정 합니다. Tz-말뚝7-NH2 (ε525)에 대 한 어 금 니 소멸 계수 535 M-1c m-1이다.

4. Tz 말뚝7-DOTA의 합성

  1. DMSO의 0.15 ml에서 Tz 말뚝7-NH2 (4.5 mg, 6.9 μmol) 해산 (또는 단순히 진행 단계 3.8에서 만든 솔루션).
  2. 차 (21 μ, 0.15 mmol)의 22 어 금 니 동등을 단계 4.1에서 tetrazine 포함 된 솔루션에 추가할.
  3. P-SCN-Bn-DOTA 고체와 소용돌이 약 2 분 또는 물자 완전히 해산 때까지 솔루션의 10 mg (14.2 μmol)를 추가 합니다.
  4. 온화한 동요와 RT에 30 분 동안 품 어에 반응을 수 있습니다.
  5. 30 분 후 반응 H2O에서에서 1:1 희석 하 고 반전 단계 C18 HPLC를 사용 하 여 unreacted p-SCN-Bn-DOTA를 제거 하는 제품을 정화. P-SCN-Bn-DOTA 254의 파장에서 모니터링할 수 있습니다 동안 Tz 말뚝7nm-DOTA는 525의 파장에서 가장 모니터링 nm.
    참고: 보존 회는 분명히 매우 (펌프, 열, 튜브 등),각 연구실의 HPLC 장비에 의존 하 고 적절 한 컨트롤 정화 하기 전에 실행 해야 합니다. 그러나, 경우과 MeCN/H2O의 그라데이션 예제를 제시 (모두 0.1 %TFA)에 95:5 MeCN/H2O 30 분 이상 및 분석 4.6 x 250 m m C18칼럼, 이용 된다 Tz 말뚝7및 p-SCN-Bn-DOTA-DOTA의 정체 시간을가지고 약 15.6 분 및 16.1 분, 각각.
  6. 액체 질소를 사용 하 여 수집 된 HPLC eluent 동결 하 고 지금 냉동 컬렉션 튜브 알루미늄 호 일에 포장. 장소는 lyophilizer에 언된 컬렉션 튜브 HPLC 모바일 단계를 제거 하려면 하룻밤. 제품 밝은 핑크 파우더를 될 것입니다.
  7. DMSO의 0.15 mL에 제품을 다시 구성 하 고 모니터링 525 nm 파장 대 일 분 광 광도 계를 사용 하 여 농도 측정 한다. 어 금 니 소멸 계수 Tz 말뚝7-DOTA (ε525) 535 M-1c m-1이다.
  8. 핵 자기 공명 (NMR)에 의해 최종 화합물을 분석 하 고 고해상도 질량 분석 (HRMS) 그 합성을 확인 하는 성공적 이었다. 실험적 결정 화학 변화와이 작품에서 설명 하는 모든 화합물의 분자 무게에 대 한 표 1 을 참조 하십시오.
  9. -80 ° c.에 어둠 속에서 순화 Tz 말뚝7-DOTA 솔루션 저장
    참고:이 절차에서 허용 중지 지점입니다. 완성 된 Tz 말뚝7-DOTA 전조가이 조건 하에서 1 년 이상에 대 한 안정적입니다.

5. 177루 Radiolabeling Tz 말뚝7-DOTA의

주의:이 단계는 프로토콜의 처리와 방사능의 조작 포함 됩니다. 이러한 단계를 수행 하기 전에-방사능으로 다른 작업을 수행 하는 또는-연구원은 그들의 가정 기관 방사선 안전 부서와 상의 해야 한다. 이온화 방사선에 노출을 최소화 하기 위해 모든 가능한 조치를 취해야.

참고: radiometals의 적은 양을 작업할 때는 모든 버퍼 조정 사이트 바인딩에 간섭을 방지 하기 위해 추적 금속에서 자유로울 것이 좋습니다.

  1. 1.7 mL 원심 분리기 튜브에서 200 μ 0.25 M 염화 아세테이트 버퍼의 pH 5.5에 1 M HCl의 aliquots 조정 추가.
    참고: 경우에 라벨에 대 한 활동의 미만 370 MBq을 사용 하 여, 사용 하는 버퍼의 볼륨 100 µ L를 감소 한다.
  2. 버퍼 솔루션에 [177루] LuCl3 의 원하는 금액을 추가. 추가 금액은 실험 및 관리 되 고 방사성 복용량의 수에 있을 것입니다. 정화 단계 동안 방사능의 잠재적인 손실을 보상 하기 위한 방사능의 가치 1-2 여분 복용량을 추가 하는 것이 좋습니다.
  3. Tz-말뚝7단계 5.2에서 방사성 혼합물에 DMSO에 DOTA-. Tz-말뚝7의 금액-DOTA 테스트 중인 과목의 수에 따라 달라 집니다. 6.2.2.2 단계에서이 주제에 더 많은 정보를 찾을 수 있습니다.
  4. 20 분 동안 37 ° C에서 품 어에 솔루션을 수 있습니다.
  5. 확인는 radiolabeling 50 mM EDTA, pH 5.5로 모바일 단계와 라디오 인스턴트 얇은 층 착 색 인쇄기 (라디오-iTLC)를 사용 하 여 완료 합니다. 레이블이 [177루] 루-DOTA-말뚝7-Tz 기준선에 남습니다-Rf = 0-무료 [177루] 동안 루3 + EDTA에 의해 조정 될 것입니다 및 용 매 전면 Rf 여행 = 1.0 (그림 3B).
  6. 양적 라벨은 달성 되지 않은 경우 무료 radiometal 조정 추가 ligand를 추가 합니다. 또는, 정화는 레이블이 [177루] 루-DOTA-말뚝7-Tz C18 카트리지를 사용 하 여. 사용에 대 한 제조 업체의 지침을 따릅니다. 샘플 프로시저는 아래 제공 됩니다.
    1. 큰 주사기 카트리지를 통해 에탄올 5 mL를 천천히 통과 하 여 카트리지를 프라임. 그럼, 이기의 5 mL 그리고 이온된 (DI) H2o.의 5 mL를 통과
    2. Radioligand 솔루션을 단계 5.3에서 작은 주사기에 그리고 C18 카트리지에 천천히 주입. 그런 다음 세척 디 H2O를 제거의 10ml와 카트리지 [177루] LuCl3언바운드.
    3. 에탄올의 500 µ L을 elute. 건조 질소 또는 아르곤 10-15 분의 낮은 유량과 그릇 전달 하 여 최종 제품에서 모든 에탄올을 제거 합니다. 그 후, 볼륨 단계 6.2.2.2에서에서 결정 염 분에는 radioligand resuspend.

6. vivo에서 연구

주의: 섹션 5에서이 단계는 프로토콜의 포함 한다 처리 및 방사능의 조작. 이러한 단계를 수행 하기 전에 연구자는 그들의 가정 기관 방사선 안전 부서와 상담 해야 한다. 이온화 방사선에 노출을 최소화 하기 위해 모든 가능한 조치를 취해야.

  1. 동물의 준비
    1. 여성 athymic 누드 마우스에 피하 임 플 란 트 5 x 106 SW1222 대 장 암 세포 세포 미디어와 매트릭스의 1:1 혼합물의 150 μ에서 일시 중단 (예., Matrigel)는 100-150 m m3 이 종이 식 (14-18 일에 성장 하는 것이 허용 하는 고 후 접종).
    2. Biodistribution 실험 동물의 분류
      1. 캘리퍼스 측정에 의해 결정으로 충분 한 크기의 종양은, 일단 각 코 호트가 대략 동일한 평균 종양 볼륨 동물을 정렬 합니다. 동물 꼬리 씻을 수 없는 잉크 (한 밴드, 두 밴드, 등)에 표시 하 여 각 장에 고유 수 있습니다.
    3. 경도 치료 연구를 위한 동물의 분류
      1. 일단 종양 캘리퍼스 측정에 의해 결정으로 충분 한 크기의, 각 실험을 통해 정확한 추적을 위해 동물의 귀 태그를 연결 합니다.
        참고: 숫자 귀 태그 실험의 과정을 통해 빠지다 수 있습니다. 그 결과, 체계적인 방식으로 이러한 실제 태그 귀 노치와 동반 것이 좋습니다 (즉., 오른쪽, 왼쪽, 양자, x 2, 오른쪽 왼쪽 x 2).
      2. 각 코 호트에서 평균 종양 볼륨은 대략 동일한 동물을 정렬 합니다. 동물 분류에 대 한 다음 메서드는 스프레드시트 프로그램을 사용 하 여 수행할 수 있습니다.
        1. 동물 식별 번호, 귀 노치 패턴, 및 3 개의 별도 열에 종양 볼륨을 나열 합니다.
        2. 작은에서 큰 종양 볼륨에 데이터를 정렬 합니다.
        3. 네 번째 열에서 케이지 번호와 사이클 snakelike 패턴에 연습장을 통해 각 동물을 할당 합니다. 예를 들어 5 연습장 인 경우이 열 것 "5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5..." 모든 동물 감 금 소 할당 될 때까지 가득.
        4. 감 금 소에 할당 되 면 케이지 번호로 데이터 정렬. 귀 노치는 사용 되 고, 각 동물에 주어진 독특한 귀 노치 패턴을가지고 확인 합니다. 주어진에 중복 (두 개 이상의 동일한 패턴의) 경우, 모든 새 장까지 누락 된 패턴으로 다른 장에서 한 스왑 한 마우스 독특한 귀 노치 패턴과 동물 있다.
  2. 공식 및 주사
    참고: biodistribution와 치료 연구에 대 한 주입의 순서는 다음과 같이 진행: huA33 TCO [177루] 루-DOTA-말뚝7다음 먼저, 주입은 미리 결정 된 간격 후-Tz.
    1. Immunoconjugate
      1. 0.9% 멸 균 식 염 수에 0.8 mg/mL의 농도에 단계 1.9에서 huA33-TCO 솔루션의 약 수를 희석.
      2. PBS에서 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 청소용된 주사기에 huA33-TCO 솔루션의 150 µ L (100 µ g)의 복용량 그리고 얼음이 주사기를 저장.
        참고: BSA 치료 주사기의 벽에 항 체의 비 특정 바인딩을 줄일 수 있습니다.
      3. 동물 꼬리 정 맥을 팽창에 3 분 동안 열 램프 아래 따뜻한.
      4. HuA33-TCO 솔루션이 종이 식 베어링 마우스의 꼬리 정 맥에 주사. 24 시간 (또는 다른 미리 정해진된 시간 간격) huA33-TCO는 마우스의 종양에 축적 수 있습니다.
    2. Radioligand
      1. Tz-말뚝7radiolabel-DOTA 섹션 5에 설명 된 대로.
      2. Tz-말뚝7의 1.1 어 금 니 동등을 포함 된 염 분 DOTA-huA33-TCO의 금액을 기준으로 관리 살 균 0.9%의 150 μ에 복용량을 그립니다. 예를 들어, huA33-TCO의 100 μ g (0.67 nmol) 동물에 주입 했다 고 [177루] 루-DOTA-말뚝7-Tz 반응 혼합물 12.4 GBq/μmol의 특정 활동으로 만들어진 다음 복용량 그려집니다 각 활동의 9.14 MBq 포함. 이 Tz (huA33-TCO를 1.1 어 금 니 식 상대)의 0.74 nmol에 해당합니다.
      3. 동물 꼬리 정 맥을 팽창에 3 분 동안 열 램프 아래 따뜻한.
      4. 이 종이 식 베어링 마우스의 꼬리 정 맥에 radioligand의 복용량을 주사. 주입을 활동의 금액은 연구원에 의해 결정 됩니다. 게시 된 데이터는 복용량-의존 치료 효과 7.4 55.5 MBq의 범위 내에서 종양 크기에 나타났습니다.
  3. Biodistribution
    1. radioligand의 후 원하는 시간 때에는 2% O2 를 사용 하 여 마우스의 각 코 호트를 안락사 / 6% CO2 가스 혼합물.
      주: 보조 실제 안락사 (예: 자 궁 경부 전위)를 위한 방법에 관한 어떤 제도적 요구 사항을 따릅니다.
    2. 각 동물에 대 한 관심의 모든 장기를 제거, 어떤 과잉 혈액을 제거 하는 물 목욕에서 그들을 씻어 및 제안 순서 대로 5 분 샘플 기관 목록에 대 한 오픈에 어에 종이 타월에 건조: 혈액, 종양, 심장, 폐, 간, 비장, 위, 작은 창 자 대 장, 신장, 근육, 뼈, 피부, 꼬리.
    3. 충분히 건조 되 면 미리 무게 일회용 문화 관에서 장기를 놓습니다. 각 기관 또는 직물의 질량을 다시 한 번 지금 채워진 튜브 무게.
    4. 감마 카운터를 사용 하 여 튜브의 각 활동을 측정 합니다. 보정 감마 카운터 그려진된 복용량을 측정 하는 데 사용 되는 검출기에서에서 측정 된 활동. 각 악기에 177루의 방사능 기준 세 고 활동 카운트 당 분 (cpm) 사이 interconversion에 대 한 보정 계수를 결정.
    5. 막대 그래프로 biodistribution 데이터 ( 그림 5참조)는 뜻으로 정규화는 바 표시 각 기관에 대 한 이해 한 표준 편차를 나타내는. 샘플 그룹 간의 이해에 통계적 차이 짝이 없는 t-검정, 의미를 달성 하 여 사정 될지도 모른다 때 p < 0.05.
  4. 치료 모니터링
    1. 캘리퍼스를 사용 하 여 수직 길이 폭 뿐만 아니라 직사각형 종양 (길이)의 가장 긴 측을 측정 합니다. 타원 면의 볼륨에 대 한 수식을 사용 하 여 볼륨 계산: (4/3) πL· W· H, ½L·에는 W2, 그 높이 약 너비 가정.
      참고: 그것은 또한 휴대용 종양 경우 제공 ( 테이블의 자료참조) 측정 장치를 사용 하 여.
    2. 시간이 지남에 따라 체중 증가 또는 체중 감소를 추적 하는 균형에 각 마우스 무게.
    3. 중요 한 것은, 각 동물의 외모 고민와 같은 다시 hunched 또는 파열된 피부 혈관 (haematotoxicity를 나타낼 수 있습니다)의 흔적에 대 한 모니터링 합니다.
      참고: 종양 측정 경도 치료 연구 과정 1-2 일 마다 수집 한다.
    4. 경도 치료에서 플롯 데이터 시간이 지남에으로 평균 종양 볼륨을 공부 하 고 원하는 경우 종양 볼륨 시작을 정상화. 샘플 그룹 사이 같은 날에 통풍 관에 통계적 차이 짝이 없는 t-검정, 의미를 달성 하 여 책정 때 P < 0.05. 더 광범위 한 통계 분석 및 수 있습니다 훈련 된 biostatistician에 의해 권장 하는 대로 실행 되어야 한다.

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결과

HuA33에 TCO의 활용 아민 반응 TCO NHS와는 면역 글로불린의 표면에 리 진 잔류물 간의 결합에 입각 한입니다. 이 메서드는 매우 강력 하 고 재현할 수 하 고 안정적으로도-의-라벨 2-4 TCO/mAb의 생성 합니다. 이 경우, MALDI ToF 질량 분석 약 4.0 TCO/mAb;의 라벨의 정도 확인 하 고용 했다 비슷한 가치 기자24fluorophore 수정 tetrazine를 사용 하 여 얻은 했다. Tetrazine ligand의 합성은 3 단계에서 수행 됩니다: (1) 결합 Tz NHS의 모노 Boc 보호 못 링커가 항복 Tz 말뚝7-NH2, 중간의 deprotection (2) 및 (3) 사이 thiourea 결합의 형성 p-SCN-Bn-DOTA과 Tz 말뚝7-NH2. 이 절차는 상대적으로 손쉬운 고 Tz 말뚝

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토론

Vivo에서 pretargeting에이 방법의 장점 중 하나-bispecific 항 체에 입각 한 전략에 관하여 특히 고 haptens 방사선-그것의 모듈화는: 트랜스-cyclooctene moieties 어떤 항 체에 추가 될 수 있습니다 그리고 tetrazine radioligands 자신의 클릭 파트너와 함께 반응 하는 능력을 방해 하지 않고 방사성의 특별 한 다양 한 방사선 될 수 있습니다. 아직 다른 항 체/항 원 시스템에이 방법의 적응 하기만 하면 여기에 설명 된 프로토콜을 복제 되지 않습니다. 물론, 새로운 mAb TCO immunoconjugate 또는 소설 tetrazine 베어링 radioligand을 만드는 어떤 시도 든 지 안정성과 반응성에 대 한 테스트를 포함 하 여 적절 한 화학 및 생물 학적 특성 분석 실험에 의해 동반 해야 합니다. 그러나,이 외에 두 개의 변수를 특히 탐구 하 고 최적화 하는 것이 중요 있다: (1) 관리 하는 mAb TCO immunoconjugat...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자는 박사 야 곱 Houghton 도움이 대화 감사. 저자는 또한 그들의 관대 한 자금 (R00CA178205 및 U01CA221046)에 대 한 NIH를 감사 하 고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
(E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS)Sigma-Aldrich764523-80°C에 저장; C
2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS)Sigma-Aldrich764701-80 °에 저장; C
아세토니트릴 (MeCN)피셔 사이언티픽A998-4
암모늄 아세테이트(NH4OAc)피셔 사이언티픽A639-500
Boc-PEG7-아민(O-(2-아미노에틸)-O&프라임;-[2-(Boc-amino)에틸]헥사에틸렌 글리콜)Sigma-Aldrich70023-20°C에 저장; C
디클로로메탄(DCM)피셔 사이언티픽D143-1
디메틸설폭사이드(DMSO), 무수피셔 사이언티픽D12345
EMD 밀리포어 아미콘 울트라-2 원심 필터 유닛피셔 사이언티픽UFC205024
GE 헬스케어 일회용 PD-10 탈염 컬럼피셔 사이언티픽45-000-148
N, N-디메틸포름아미드 (DMF), 무수Fisher ScientificAC610941000
Buffered Saline (PBS)Fisher Scientific70-011-04410x Concentrated
p-SCN-Bn-DOTAMacrocyclicsB-205Store at -20 ° C
트리에틸아민(TEA)Fisher ScientificAC157911000
트리플루오로아세트산(TFA)Fisher ScientificA116-50
종양 측정 장치Peira TM900Peira TM900

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