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방법 논문

꼬마 선 충 의 프로 파일링 Phenotypic 자동화 하 여 화학 독성의 예측에 대 한 높은 처리량 분석 결과

6.6K 조회수

DOI:

10.3791/59082

2019년 3월 14일

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

양적 방법 확인 하 고 자동으로 꼬마 선 충의 phenotypic 프로 파일링 분석 하 여 화학 물질의 급성 독성 예측 개발 되었습니다. 이 프로토콜 384-잘 접시에 화학 물질과 웜 치료, 비디오, 캡처 및 독물학 관련된 고기를 계량 하는 방법을 설명 합니다.

초록

쥐 또는 쥐와 같은 더 높은 주문 유기 체에 화학 물질의 독성 시험 적용 시간과 비싼, 그들의 긴 수명 및 유지 보수 문제 때문입니다. 선 충 류 꼬마 선 충 (C. 선 충) 독성 시험을 위한 이상적인 선택 있도록 장점이 오히려: 짧은 수명, 쉽게 경작, 및 효율적인 복제. 여기, 우리는 자동 phenotypic 프로 파일링 C. 선 충 의 384-잘 접시에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 선 충 벌레 액체 매체 및 화학 치료, 384-잘 접시에 교양 있으며 동영상 33 웜 기능에 화학적 영향을 계량 하기 각 잘 찍힌다. 실험 결과 계량된 형 기능 분류 및 다른 화합물에 대 한 급성 독성을 예측 하 고 설정할 수 더 전통적인 화학 독성 평가 시험에 대 한 우선 순위 목록을 설치류 모델에서을 보여 줍니다.

서론

산업 생산 및 사람들의 일상 생활에 적용 하는 화합물의 급속 한 발전, 함께 그것은 독성 화학 물질에 대 한 모델을 테스트를 공부 하는 것이 중요. 대부분의 경우, 설치류 동물 모델 건강에 다른 화학 물질의 잠재적 독성을 평가 하기 위해 채택 된다. 일반적으로, 치명적인 농도 (즉, assayed 50% 치 사 량 [LD50] 다른 화학 물질의) 결정 시간이 소요 되 고 매우 비싼 vivo에서, 설치류 (쥐/마우스) 모델에서 전통적인 매개 변수로 사용 됩니다. 또한, 감소, 수정, 또는 교체는 동물 복지 및 윤리 중심 (3R) 원리, 더 높은 동물의 교체는 과학 연구1,2,3 가치를 허용 하는 새로운 방법 . C. 선 충 은 토양에서 격리 되어 자유 롭 살아있는 선 충 류 이다. 그것은 널리 사용 되었습니다 실험실에서 연구 유기 체로 짧은 수명, 쉽게 재배, 효율적인 복제 등의 유익한 특성 때문에. 또한, C. 선 충 에 기본적인 생리 적 프로세스 및 스트레스 응답을 포함 하 여 많은 기본적인 생물 학적 경로 높은 포유류4,

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프로토콜

프로토콜 질병 예방 및 중국에 있는 컨트롤에 대 한 베이징 센터의 동물 윤리 위원회의 동물 보호 지침을 따릅니다.

1. 화학 준비

  1. 화학 물질을 (표 1표의 재료)를 가져옵니다.
  2. 100% 치 (LC100, 24 h)의 최소 농도 웜 100 %nonlethality (LC0, 24 h)의 최대 농도 대 한 개별 화학 물질의 최고 및 최저 복용량을 결정 합니다. (표 1)의 높은 농도의 6 희석 사용 합니다.
    참고: LC100와 LC0는 새로운 화학 물질에 대 한 복용량을 결정 하기 위해 예비 웜 치 테스트9 실시 합니다.
  3. 필요한 농도 x 2 K-중간 (자료 테이블)과 각 화학 물질을 희석. 컨트롤 K-매체를 사용 하 여 화학 물질에 의해 발생 하는 표현 형 변경 비교.
    1. 예를 들어 카드뮴 염화 (CdCl2)의 7 그라데이션 농도 준비 (표 1). 2 배를 준비 하 높은 집중 된 수성 해결책 (4.64 mg/mL), K-중간의 8 ml에서 CdCl2

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결과

10 개 이상의 화학 물질12의 다른 농도에 노출 하는 벌레의 고기 테스트 했습니다. 테스트에서 33 가지 기능 (0 h, 12 h, 그리고 24 h) 3 시간 시점에 각 화합물에 대 한 정량 했다. 이전에 매뉴얼 및 수명 분석 결과의 자동 분석 비교11,12이루어졌다. 이 분석 결과에서 우리는 화학 물질과 농도 영향을 미칠 수 웜 고기 발견. 이 방법의 개요는 그림 2에 표시 됩니다.

(그림 3그림 4c, d) 결과 벌레 .......

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토론

C. 선 충 의 장점은 독극물9, 모두 기계 연구와 높은 처리량 검열 방법의 증가 사용에 이르렀다. 독물학 연구에서 다른 모델 시스템 보완에 C. 선 충 에 대 한 증가 역할은 최근 몇 년 동안, 특히 새로운 화학 물질의 급속 한 독성 평가 대 한 놀라운 되었습니다. 이 문서에는 자동 식별 및 화학 독성의 평가 대 한 384-잘 접시에 고기를 벌레의 높은 처리량, 양적 심사의 새로운 분석 결과 제공합니다. 이 분석 결과 24 시간 내 화학 물질의 급성 독성 시험 고 subacute 독성 테스트도 더 많은 시간 포인트 데이터 수집 및 벌레에 음식 소스 (OP50)을 제공 하는 경우에 적용할 수 있습니다.

화학 물질을 희석 사용 매체가 다를 수 있습니다; 우리는 소피외. 를 참조 하 여 분석 결과에 K-매체를 선택 13. 웜 제어 및 화학 치료 그룹 .......

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자는 친절 하 게 보내는 C. 선 충 CGC를 감사 합니다. 이 작품은 국가 주요 연구 및 개발 프로그램의 중국 (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705);에 의해 지원 되었다 중국 그랜트 (#31401025, #81273108, #81641184), 자본 건강 연구와 베이징 (#2011-1013-03), 환경 독물학 (# 베이징 주요 연구실의 오프닝 기금에에서 특별 한 프로젝트의 개발의 국가 자연과학 기초 2015HJDL03), 산 동성, 중국 (ZR2017BF041)의 자연 과학 재단.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-프로판올시그마-알드리치59300
384웰 플레이트Throme142761
AgarBacto214010
아트로핀 황산염시그마-알드리치PHL80892
표백제 완충액0.5mL 10M NaOH 0.5mL, 5% NaClO 0.5mL, 초순수
카드뮴 클로라이드9mL Sigma-Aldrich
염화칼슘Sigma-Aldrich21074
CCD 카메라ZeissAxioCam HRmZeiss 현미경 검사 GmbH
콜레스테롤Sigma-AldrichC8667
구리(II) 황산염 Sigma-Aldrich451657
에탄올Sigma-Aldrich24105
에틸렌 글리콜Sigma-Aldrich324558
글리세롤Sigma-AldrichG5516
K-Medium1 L 초순수 LB 국물에 NaCl 3.04 g과 KCl 2.39 g;
10  g/L  트립톤,  5  g/L  누룩  추출물,  5  g/L  나클 
마그네슘 황산염 헵타하이드레이트시그마-알드리치63140
NGM 플레이트초순수 1L에 NaCl 3g, 17g, 펩톤 2.5g, 오토클레이브 후 콜레스테롤 1mL(에탄올 5mg/mL), MgSO4 1mL(1M), CaCl2 1mL(1M), PPB 완충액 25mL
펩톤박토211677
염화칼Sigma-Aldrich60130
인산칼륨 이염기성시그마-알드리치795496
인산칼륨 일염기시그마-알드리치795488
PPB 버퍼35.6g, K2HPO4 108.3g, 1L 초순수 셰이커에 KH2PO4 108.3g
ZHICHENGZWY-200D
염화나트륨시그마-알드리치71382
불화나트륨시그마 알드리치s7920
수산화 나트륨시그마 알드리치71690
차아 염소산 나트륨 용액시그마 알드리치239305
트립톤프로그램
Y1625
Zeiss 자동 현미경 ZeissAXIO Observer.Z1Zeiss 독점 소프트웨어 Zen2012 및 CCD(Charge Coupled Device) 카메라가 있는 Zeiss 자동 마이크로스코
202908륨 성 https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate 링크 시그마 알드리치 T7293 효모 추출물 시그마 알드리치

참고문헌

  1. Anderson, G. L., et al. Assessing behavioral toxicity with Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 23 (5), 1235-1240 (2004).
  2. Boyd, W. A., et al. A high-throughput ....

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재인쇄 및 허가

태그

C elegans384