전송 전자 현미경 검사 법 및 utero에서 변환의 조합을 개발 하는 동안 신경 시스템의 정밀한 열 대권 외의 형태학 적 변화를 공부에 대 한 강력한 접근 이다. 이 결합 된 메서드는 그들의 지형 표현에 관하여 neuroplasticity 기본 구조 세부 사항에 변화에 대 한 깊은 통찰력을 수 있습니다.
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방법 논문
평가의 개발 쥐의 뇌와 척수의 Utero 변환 후 Ultrastructural Neuroplasticity 매개 변수
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
현재 연구 관심사의 단백질에 의해 영향을 명확 하 게 확인 된 지형 구조에서 ultrastructural 매개 변수는 정확한 morphometrical 분석에 utero 변환 전송 전자 현미경 (TEM)와 결합 그 바이러스 전송을 통해 유기 체에 도입 되었습니다. 이 결합 된 접근 다음 지형 탐색 지도 조직 아틀라스에서 ultrastructural 식별 macrostructural에서 부드러운 전환에 대 한 수 있습니다. 에-utero-불리고 조직의 고해상도 전자 현미경 계시는 neuropil와 소성 매개 변수, cross-sectioned 시 냅 시스 bouton 지역, 시 냅 스 소포 내 미토 콘 드리 아의 수의 좋은 열 대권 외는 bouton 프로필, 시 냅 스 연락처, cross-sectioned axonal, 수 초 두께, myelin lamellae 수 및 미토 콘 드리 아 프로필의 cross-sectioned 분야의 길이. 이러한 매개 변수의 분석 유전자 구성의 바이러스 성 전송에 의해 영향을 받는 신경 영역에 ultrastructural가 소성의 변화에 대 한 필수적인 통찰력을 보여준다. 이 결합 된 방법만 사용할 수 없는 신경가 소성에 유전자 조작된 생체 약물의 직접 효과 공부 하지만 또한 가능성 (예를 들어, 컨텍스트에서 신경가 소성의 utero 구조 연구 신경 퇴행 성 질병)입니다.
서론
아니 광자는 전자의 깊이 학년에서 ultrathin 조직 표본을 침투 수 있습니다. 이 가벼운 현미경 검사 법 기술에 비해 미세 구조의 나노미터 해상도 이미지를 캡처에 가장 귀중 한 장점을 특성. 예를 들어 가장 미토 콘 드리 아, melanosomes, 등 다양 일 분 비과 립, microtubules, microfilaments, 섬 모, microvilli, 및 세포 접합 (세포 표면 세포내 세포의 시각화 수 있습니다. 전문화), 특히 신 경계1,2,,34synapses. 현재 방법론 연구의 전반적인 목표는 utero에서 변환의 가장 최신의 기술을 결합 하 여 태아 간섭에 따라 개발 하는 동안 신경가 소성에 변화의 ultrastructural 인식 이다. 관심의 virally 인코딩된 단백질 중앙 신 경계5,6,7,6척수 포함 하 여에 utero에서 불리고 되어 있다. 예를 들어, 함께 가장 utero에서 변환 사용 되었습니다 L1 및 핵 수용 체 단백질 사이 상호 작용에 관해서는 특히 L1 불충분 한 쥐에서 소성을 학습 하는 모터에 세포 접착 분자 L1의 효과 공부 하 고 소 뇌 신경7에서.
Neuroplasticity 매개 변수 분석 신 경계 내의 작은 지역의 지역화에 대 한 정확한 정보가 필요합니다. 따라서, 그것은 ultrastructural 세부 사항 및 다른 구조에 관하여 그들의 정확한 지형 방향을 설명 하기 위해 적절 한입니다. 현재 연구에서 특정 준비 방법 빛과 전자 현미경 검사 법에 따라 다른 형태학 분야의 상세한 조사에 제공 됩니다. 이 이렇게 결합 조직 조작, 마우스 뇌와 척수의 utero에 변환 시작 하 고 관류 고정, 다음의 몇 가지 기술을 몰드-포함, 그리고 가장에 대 한 처리 하는 조직. 포함 및 가장에 대 한 조직의 처리 사이 포함 하는 필수적인 단계는의 정확한 microphotographic 및 낮은 확대 설명서에 대 한 허용 간섭 빛 반사 기술을 사용 하 여 조직의 설명서 조직 표본8,,910. 현재 접근에 통합,이 기술은 신경 조직 표면 및 가장에 대 한 그들의 준비에 앞서 표본 조각 프로필의 지형 및 구조 정보를 검토 하는 연구를 수 있습니다.
전체 두뇌를 단면에 대 한 특별 한 프레임 stereotaxic 좌표에 해당 합니다. 이 프레임과 신경 조직에서 영역의 형태 3 차원 (3D) 재건 혜택 형태학 분석에 사용할 수 있습니다. 시각화 된 섹션의 macrographs 지형 좌표를 할당 빌드하고를 순차적으로 번호가 매겨진된 섹션 조직 아틀라스에 지도.
수 지 처리, 후 포함 된 조직 ultrathin 섹션으로 구분 됩니다 (< 70 nm) 위에서 언급 한 조직 아틀라스의 지도 따라 선택된 영역을 포함. 그들의 내용의 및 단지 내에 인접 구조에 연락처의 소성 매개 변수 (예: 횡단면 프로필 영역 시 냅 스 boutons 또는 axonal 섬유)의 고해상도 이미지를 얻기 위해 가장 ultrathin 섹션 대상이 됩니다. neuropil입니다.
여기에 설명 된 방법으로 마이크로-그리고 nanostructures 시각화 된 macrostructures에서 부드러운 전환 utero에서 변환 개발의 긴장 후 형태학 신경가 소성의 비교 심층 연구를 허용 시스템입니다.
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프로토콜
동물 주제에 모든 절차는 함부르크와 노르 트 베스트 팔 렌, 독일의 연방 국가의 기관 동물 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다. 사용 하 여 살 균 기기, 보호 장갑 및 전체 수술을 통해 무 균 코트.
1.에 Utero 변환
- PH 7.4에 인산 염 버퍼 염 (PBS)에 원하는 대상 (4 x 1011 바이러스 성 입자 / µ L AAV1의)에 대 한 코딩 adeno 관련 바이러스 타입 1 (AAV1)를 준비 합니다. 빠른 녹색 µ 0.1 mg/L을 추가 하 고 37 ° c.에 AAV1-빠른-녹색 혼합물을 유지
- 원하는 모양으로 얇은 모 세관 팁 준비 (길이 80 µ m와 안쪽의 외부 직경 8 m m 50 µ m의 직경), micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 (설정: 압력 = 500, 열 700, 풀 = = 0, 속도 = 80, 시간 = 200, 테이블의 자료를 참조 하십시오 < / c1 >). 그것은 4-5 m m 되도록 모 세관의 끝을 휴식.
- 모 세관 팁 흡 인기 튜브 (44 cm x 0.7 cm)를 조립 하십시오 그리고 모 세관으로 AAV1-빠른-녹색 혼합물의 15 µ L 발음.
- 동물 주제 전체 절차 동안 37 ° C의 일정 한 생리 적 체온 유지.
- Preincubation 챔버로 임신 C57Bl/6 마우스 (배아 일 14.5)를 배치 하 고 기체 4 %isoflurane 마우스 anesthetize (0.6-0.8의 체적 공기 흐름 속도와 L/분).
- 피하, buprenorphine (몸 무게의 0.1 mg/kg) 주사.
- Prewarmed 수술 플레이트 (37 ° C)에 마 취 마우스를 놓습니다.
- 윤활제와 함께 눈을 커버.
- 마 취 마스크와 마우스에 맞게 (0.6-0.8의 체적 공기 속도로 가스 1.5% isoflurane L/min) 수술 판과 면도 복 부 피부 영역에. 면도 지역을 그리고 betadine 솔루션 3 X 75% 에탄올을 닦아냅니다.
참고: 마 취 마우스의 호흡 동작을 지속적으로 모니터링 합니다. 마우스의 흡입-증발 기 패턴에 따라 isoflurane 가스의 농도 조정 합니다. - 마우스의 뒷 발 골을 압박 하 여 발바닥의 반사의 부재를 확인 합니다.
- 곡선된 톱니 모양의 아이리스 포 셉 (10 cm)와 피부를 재 밌 고 직선 텅스텐 카바 이드가 위 (10 cm), 교육 년 따라 피부를 절단 한 다음, 바로 Dumont 핀셋 (12 c m, 0.2 m m으로 복 벽을 댔 지에 의해 복 부 구멍을 열으십시오 0.12 m m) x (8 cm)가 위 직선 바와 교육 알바 따라 벽을 절단 하 고.
- 복 부 오프닝에 한 조각의 fenestrated 파라핀 영화를 놓고 마이크로-모기 hemostatic 집게 (12.5 c m, 곡선)의 양쪽 끝에 영화를 해결 합니다.
- 자 궁 뿔 안에 태아 손상을 방지 하려면 숟가락 모양의 장치 자 궁 뿔을 노출 합니다. 자 궁 뿔에 PBS (37 ° C)의 몇 방울 똑 하 고 손해 또는 기형 자 궁 골목 안에 대 한 태아 검사.
- 순서와 자 궁 뿔에는 태아의 위치를 문서화 합니다. 주입을 위한 원하는 위치에 도달할 때까지 배아를 자 궁 골목 안에 신중 하 게 설정 합니다.
- 시각적으로 검사 하는 사출 사이트 (예를 들어, 뇌 심)와 염료 침투는 stereomicroscope에서 AAV1-빠른-녹색 혼합물의 1-2 µ L를 주사.
- 주입 된 배아를 문서화 하 고 복 부 구멍으로 다시 주입된 태아와 자 궁 뿔 장소.
- 복 부 구멍으로 PBS (37 ° C)의 몇 방울 똑. 복 벽 (사용 폴 리아 미드 6 0 크기의 봉합)과 피부 (사용 폴 리아 미드 3 0 크기의 봉합), Halsted의 모기 hemostatic 집게 (12.5 c m, 곡선)를 사용 하 여 봉합 하 여 캐비티를 닫습니다. 또는 사용 하 여 간단한 중단된 패턴 또는 스테인리스 봉합/스테이플 복 부 구멍 그리고 피부를 닫습니다.
2입니다. 격리 된 조직 Telemacrophotography
-
버퍼의 준비
- 녹이는 14.95 g Na2HPO4 의 KH2포4 감동 200 rpm에서 증류수 1 L의 2.18 g Sörensen의 버퍼 (1 리터)를 준비 합니다. 관류의 임신 강아지 및 새끼는 출생에서 기간 사용 바늘의 적절 한 크기 복 부 또는 intragastric 주입에 대 한 하 고 터미널 나트륨 pentobarbital 마 취 농도 180 mg을 초과 하지 않는 다는 것을 확인 / 몸 무게의 킬로그램입니다.
- 75 ° C에 증류수 500ml를가 열 하 여 Mugnaini의 고정 솔루션 (5 L)를 준비 하 고 200 rpm, 5의 200 µ L 추가의 감동 아래 paraformaldehyde 분말 50 g을 추가 N NaOH, Sörensen의 버퍼의 추가 1, 500 mL, 1750 mL의 증류수 그리고 25%도 500 mL. 최대 5000 mL 증류수에 채우십시오. 이 마지막 버퍼를 사용 하 여 재 관류에 대 한.
참고: 후드 Mugnaini의 고정 솔루션을 준비, 보호 안경을 착용 하 고 연기를 피하십시오. 관류의 더 나은 시각화에 대 한 메 틸 렌 블루 (0.05 g/L)를 추가 합니다.
-
마우스 관류 및 조직 분리
- Transcardially perfuse (배아 연구)의 경우 transduced 배아 또는 표준 절차6,7에 따라 원하는 나이 (예를 들어, 출생 후 하루 24)에 태어난된 transduced 술집 임신 쥐 11,12,13,14,15,,1617, 복 터미널 sodium pentobarbital을 사용 하 여 마 취 (200 mg/kg의 몸 무게).
- 마우스 transcardially 주입 덤플링 솔루션 (500 U) 쥐를 고취 26 G, 바늘으로 하 고, 고정, 전에 1을 사용 하 여 시체에서 피를 제거 하 고 그들에 게 40 ° C prewarmed Mugnaini의의 30 mL와 함께 transcardially를 perfuse에 PBS의 10 mL와 함께 transcardially 고정 솔루션입니다.
참고: 성인 쥐에 대 한 복 부 대동맥14를 통해 대체 역행 관류를 수행 합니다. - (예를 들어, 뇌 또는 척수)의 perfused 조직 분리 하 고 후 위 4 ° c.에 다른 24 h에 대 한 Mugnaini의 고정 솔루션의 적어도 10 mL에 조직
- 조직을 실 온에서 3 h에 대 한 PBS의 10 ml 씻으십시오.
-
Agarose, 문서에 포함 하 고 단면
- 재현할 수 단면 각도8,,910특별 한 프레임에 고립 된 조직 (예를 들어, 뇌)를 조정 합니다. 또는, 조정 가능한 절단 두께 vibratome를 사용 합니다.
- 신경 조직 프레임에 배치 하 고 telemacrography에 대 한 조직 조정 좌표를 문서화 합니다.
- 3% 낮은 녹는 agarose 포함 매체 준비: Sörensen의 버퍼의 100 ml에서 agarose의 3 세대를 추가 하 고 90 ° c 물 욕조에 섞어가 열
- 조직을 포함 하는 프레임에 3 %agarose (30 ° C)를 붓는 다. 따뜻한 금속 블록과 프레임을 커버 하 고 경화 될 때까지 기다립니다. 경화, 동안 포함 된 조직 및 그것의 좌표 프레임 내에 이미지를 telemacrographic 장치를 사용 합니다.
- 절단 간격에 해당 하는 첫 번째 프레임의 좌표와 agarose 임베디드 조직 프레임으로 전송.
- 원하는 두께 (예를 들어, 1.5 m m)의 섹션으로 얇고 진동 면도날으로 장치 내장된 조직 컷 ( 재료의 표참조).
참고: 면도날의 활공을 높이기 위해 내장된 조직에 글 리세 린 몇 방울 똑. - PBS의 각 조직 섹션 이미지와 폴더에 이미지를 수집 합니다.
3. 전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 격리 된 조직 준비
참고: 후드 아래 떨고 플랫폼에 단단히 closable 뚜껑 유리 접시에 외피의 모든 추가 단계를 수행 합니다.
- PBS에서 2 x 30 분 조직 단면도 씻어. 실 온에서 2 h의 2% 수성 오스뮴 tetroxide 솔루션 (OsO4) 섹션을 품 어.
주의: 오스뮴 tetroxide 독성 이며 그것은 피부와 접촉할 때 유해할 수 있습니다. - PBS에서 2 x 30 분 osmicated 섹션을 씻어.
- 10-15 분 동안 실 온에서 30%, 50%, 70% 에탄올에 섹션을 품 어 (옵션: 4 ° C에서 70% 에탄올에서 밤새 품 어).
- 이미지 왼쪽 및 45 °의 각도로 오른쪽에서 샘플에 적용 되는 LED RGB 빛8,9,10 (2 x 15w)에서 70% 에탄올에 osmicated 표본. 검은 요리와 지루한 검은 백그라운드를 사용 하 여 산란 하 고 조명 하는 동안 빛의 반사를 최소화 하기 위해.
주의: 이미징 동안 건조 섹션을 허용 하지 않습니다. - 시리즈는 폴더에서 이미지를 수집 하 여 좌표 섹션 이미지의 아틀라스를 만듭니다.
- 100% 에탄올 (2 x 30 분)과 상 온에서 100% 프로필 렌 산화물 (2 x 30 분)에서 표본 품 어.
주의: 솔루션을 변경 하는 동안 건조 섹션을 허용 하지 않습니다. - 부드럽게 유리 바 교 반 하면서 수 지의 260 mL 유리 용기 무수 물 dodecenylsuccinic의 240 mL 믹스. 이질성, 거품, 및 얼룩에 대 한 정기적으로 확인 합니다. 아주 부드럽게, 적어도 45 분 동안 손으로 저 어.
- 수 지/프로필 렌 산화물 1: 2와 1: 1의 비율로 준비 하 고 추가 3% 가속기 (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).
- 1:2 단계에서 3.8 2 h를 누른 1:1 포함 솔루션에서 단계에서 3.8 2 h에 대 한 실 온에서 회전 바퀴에 솔루션을 포함 조직 품 어.
- 조직 평면 폴 리 프로필 렌 요리에서, 신선한 수 지 3% 가속기를 포함 하는 조직 커버 놓고 12 24 h에 대 한 65-85 ° C에서 임베디드 조직 치료 합니다.
- 포함 된 조직 실내 온도에 아래로 냉각 하 고 폴 리 프로필 렌 요리에서 수 지 포함 견본을 제거.
4. 정량 분석에 대 한 Ultrastructural Neuroplasticity 매개 변수 선택
-
관심의 영역을 매핑
- 관심 (예를 들어, 해 마 또는 소 뇌)의 영역을 선택 하 고이 지역에 있는 아틀라스 (3.5 단계)에서 이미지를 선택 하 여 섹션 아틀라스에서 영역을 지역화.
- 섹션 이미지에 관심 분야의 경계를 스케치 하 고 찾기/첨가 수 지 표본에 지역 경계.
- 스크래치 마크는 미세 바늘 게이지 (26 G, 1)를 사용 하 여 수 지 표본에 관심 (예를 들어, 해 마 또는 소 뇌)의 영역의 테두리.
- 트리밍에 대 한 수 지를 부드럽게 하거나, 또는 트리밍 장치를, 얇은 잎, 또는 사 포를 사용 하는 오븐에서 85 ° C를 수 지 표본 열.
- 면도날으로 수 지 표본에서 관심 영역을 삭제할 ( 재료의 표참조). 접착제 (직경 8 mm)와 1 cm의 길이 예를 들어, 필요한 구경의 아크릴 유리의 바에는 견본을 탑재 합니다. 세미-ultrathin 단면화 및 탑재 된 견본을 정돈 한다.
- Semithin (0.75 µ m) 준비와 ultrathin (70 nm)는 ultramicrotome를 사용 하 여 잘린된 영역 섹션: 0.75 µ m 두께 1.5 m m/s 및 70 nm 두께 0.7 m m/s에 그것을 설정.
- 유리 캐리어 semithin 섹션을 수집 하 고 1% 톨루이와 섹션 (4 분)에 대 한 PBS에 블루 얼룩.
- 섹션 이온된 수에 여러 번 씻는 다. 얼룩진된 섹션 4 x를 사용 하 여 가벼운 현미경 검사 (0.1 ∞의 나 /-), 10 (0.22 ∞/0.17의 없음), x 40 (0.65 ∞/0.17의 없음), x (1.25 ∞/0.17의 없음) 목표 x 100.
- 니켈 격자에 ultrathin 섹션을 수집 합니다. 180에 가장을 격자를 주제로 kV 및 3, 200 x, 6, 000 x, 및 8, 000 배 확대.
-
TEM 분석
- 양적 TEM 분석 (예를 들어, 소포 및 미토 콘 드리 아 또는 myelinated 및 nonmyelinated 축 삭 boutons)에 대 한 관심의 ultrastructural 매개 변수를 선택 하 고 이러한 매개 변수 3, 500 x, x 6000 및 8000 x 배율 TEM 이미지.
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결과
쥐의 안정적이 고 빠른 마 취에 대 한 수많은 안전 매개 변수 고려 되었다, 하 고 마 취 단위의 최적화 된 작업 영역 적절 한 (그림 1A)으로 판명. 단위는 쥐와 쥐와 같은 작은 동물에 성공적인 수술에 필요한 정밀 액체 isoflurane 및 주위 공기의 혼합을 제어 하도록 설계 되었습니다. 공기와 isoflurane 원하는 설정에 따라 기화 기에 혼합 하 고 동물 (그림 1A)에 상자에 또는 마스크를 통해 전달 됩니다. 폐품 수집 및 생성 될 수 있습니다 어떤 잉여 isoflurane 가스는 안전한 작업 환경을 제공 합니다. 가스는 수집 하 고 카트리지 (그림 1A)에 있는 활성 탄을 통과.
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토론
Utero에서 변환의 중요 한 단계는 주입. 정확한 주입 뇌 심 또는 관심의 다른 영역으로 경험 및 실습 기술 필요합니다. 얇은 microcapillary 팁, 덜 조직 손상이 발생할 수 있습니다; 그러나,이 사출 압력을 증가 하는 비용입니다. Utero electroporation19,20,,2122, 달리 utero에서 변환 후 삽입 된 배아의 생존 율은 아주 높다. 자 궁 경적의 모든 배아 배아 자 궁 뿔의 뿌리에 위치 하 고 자 궁 낭 내에서 재조정 해야 하는 경우에 주입 수 있습니다. 사출 및 분석의 발달 단계는 과학적 질문에 적용할 수 있습니다.
뇌 심에 주입, AAV1 입자는 전체 심 실 시스템을 통해 척수를 통해 배포 됩니다. 해 마와 소...
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자는 그들의 지원 및 동물 관리에 대 한 의료 학부, Ruhr 대학 보 훔에 동물 시설의 동료를 감사합니다.
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재료
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참고문헌
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