방법 논문

평가의 개발 쥐의 뇌와 척수의 Utero 변환 후 Ultrastructural Neuroplasticity 매개 변수

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DOI:

10.3791/59084

2019년 2월 26일

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

전송 전자 현미경 검사 법 및 utero에서 변환의 조합을 개발 하는 동안 신경 시스템의 정밀한 열 대권 외의 형태학 적 변화를 공부에 대 한 강력한 접근 이다. 이 결합 된 메서드는 그들의 지형 표현에 관하여 neuroplasticity 기본 구조 세부 사항에 변화에 대 한 깊은 통찰력을 수 있습니다.

초록

현재 연구 관심사의 단백질에 의해 영향을 명확 하 게 확인 된 지형 구조에서 ultrastructural 매개 변수는 정확한 morphometrical 분석에 utero 변환 전송 전자 현미경 (TEM)와 결합 그 바이러스 전송을 통해 유기 체에 도입 되었습니다. 이 결합 된 접근 다음 지형 탐색 지도 조직 아틀라스에서 ultrastructural 식별 macrostructural에서 부드러운 전환에 대 한 수 있습니다. 에-utero-불리고 조직의 고해상도 전자 현미경 계시는 neuropil와 소성 매개 변수, cross-sectioned 시 냅 시스 bouton 지역, 시 냅 스 소포 내 미토 콘 드리 아의 수의 좋은 열 대권 외는 bouton 프로필, 시 냅 스 연락처, cross-sectioned axonal, 수 초 두께, myelin lamellae 수 및 미토 콘 드리 아 프로필의 cross-sectioned 분야의 길이. 이러한 매개 변수의 분석 유전자 구성의 바이러스 성 전송에 의해 영향을 받는 신경 영역에 ultrastructural가 소성의 변화에 대 한 필수적인 통찰력을 보여준다. 이 결합 된 방법만 사용할 수 없는 신경가 소성에 유전자 조작된 생체 약물의 직접 효과 공부 하지만 또한 가능성 (예를 들어, 컨텍스트에서 신경가 소성의 utero 구조 연구 신경 퇴행 성 질병)입니다.

서론

아니 광자는 전자의 깊이 학년에서 ultrathin 조직 표본을 침투 수 있습니다. 이 가벼운 현미경 검사 법 기술에 비해 미세 구조의 나노미터 해상도 이미지를 캡처에 가장 귀중 한 장점을 특성. 예를 들어 가장 미토 콘 드리 아, melanosomes, 등 다양 일 분 비과 립, microtubules, microfilaments, 섬 모, microvilli, 및 세포 접합 (세포 표면 세포내 세포의 시각화 수 있습니다. 전문화), 특히 신 경계1,2,,34synapses. 현재 방법론 연구의 전반적인 목표는 utero에서 변환의 가장 최신의 기술을 결합 하 여 태아 간섭에 따라 개발 하는 동안 신경가 소성에 변화의 ultrastructural 인식 이다. 관심의 virally 인코딩된 단백질 중앙 신 경계5,6,7,6척수 포함 하 여에 utero에서 불....

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프로토콜

동물 주제에 모든 절차는 함부르크와 노르 트 베스트 팔 렌, 독일의 연방 국가의 기관 동물 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다.  사용 하 여 살 균 기기, 보호 장갑 및 전체 수술을 통해 무 균 코트.

1.에 Utero 변환

  1. PH 7.4에 인산 염 버퍼 염 (PBS)에 원하는 대상 (4 x 1011 바이러스 성 입자 / µ L AAV1의)에 대 한 코딩 adeno 관련 바이러스 타입 1 (AAV1)를 준비 합니다. 빠른 녹색 µ 0.1 mg/L을 추가 하 고 37 ° c.에 AAV1-빠른-녹색 혼합물을 유지
  2. 원하는 모양으로 얇은 모 세관 팁 준비 (길이 80 µ m와 안쪽의 외부 직경 8 m m 50 µ m의 직경), micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 (설정: 압력 = 500, 열 700, 풀 = = 0, 속도 = 80, 시간 = 200, 테이블의 자료를 참조 하십시오 < / c1 >). 그것은 4-5 m m 되도록 모 세관의 끝을 휴식.
  3. 모 세관 팁 흡 인기 튜브 (44 cm x 0.7 cm)를 조립 하십시오 그리고 모 세관으로 AAV1-빠른-녹색 혼합물의 15 µ L 발음.
  4. 동물 주제 전체 절차 동....

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결과

쥐의 안정적이 고 빠른 마 취에 대 한 수많은 안전 매개 변수 고려 되었다, 하 고 마 취 단위의 최적화 된 작업 영역 적절 한 (그림 1A)으로 판명. 단위는 쥐와 쥐와 같은 작은 동물에 성공적인 수술에 필요한 정밀 액체 isoflurane 및 주위 공기의 혼합을 제어 하도록 설계 되었습니다. 공기와 isoflurane 원하는 설정에 따라 기화 기에 혼합 하 고 동물 (그림 1A)에 상자에 또는 마스크를 통해 전달 됩니다. 폐품 수집 및 생성 될 수 있습니다 어떤 잉여 isoflurane 가스는 안전한 작업 환경을 제공 합니다. 가스는 수집 하 고 카트리지 (그림 1A)에 있는 활성 탄을 통과.

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토론

Utero에서 변환의 중요 한 단계는 주입. 정확한 주입 뇌 심 또는 관심의 다른 영역으로 경험 및 실습 기술 필요합니다. 얇은 microcapillary 팁, 덜 조직 손상이 발생할 수 있습니다; 그러나,이 사출 압력을 증가 하는 비용입니다. Utero electroporation19,20,,2122, 달리 utero에서 변환 후 삽입 된 배아의 생존 율은 아주 높다. 자 궁 경적의 모든 배아 배아 자 궁 뿔의 뿌리에 위치 하 고 자 궁 낭 내에서 재조정 해야 하는 경우에 주입 수 있습니다. 사출 및 분석의 발달 단계는 과학적 질문에 적용할 수 있습니다.

뇌 심에 주입, AAV1 입자는 전체 심 실 시스템을 통해 척수를 통해 배포 됩니다. 해 마와 소.......

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자는 그들의 지원 및 동물 관리에 대 한 의료 학부, Ruhr 대학 보 훔에 동물 시설의 동료를 감사합니다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenolServa36975
26 G x 1'' 바늘Henke-Sass, Wolf GmbH
410 공기 펌프용 마취 장치생물 의학 기기(Univentor)8323102
아데노 관련 바이러스 혈청형 1(AAV1)UKE(Viral Core Facility)-AAV1의 참고 문헌 및 타겟 영역은 https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ 및 다음의 문헌을 참조하십시오: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. 권나, Schaffer DV. Pharm Res. 2008년 3월; 25(3):489-99. 혈청형 1, 2, 5의 바이러스 캡시드와 pseudotype된 재조합 AAV 바이러스 벡터는 중추신경계의 다른 부위로 전달된 후 차등 효율과 세포 영양성을 나타냅니다. 버거 C, 고르바튜크 OS, 벨라르도 MJ, 페덴 CS, 윌리엄스 P, 졸로투킨 S, 라이어 PJ, 만델 RJ, 무지츠카 N. 몰. 2004년 8월; 10(2):302-17. 자가 보완적 재조합 아데노 관련 바이러스(scAAV) 벡터는 DNA 합성과 독립적으로 효율적인 transduction을 촉진합니다. 맥카티 DM, 모나한 PE, Samulski RJ. 유전자 Ther. 2001 8 월; 8(16):1248-54.
AgaroseSigma-AldrichA9414저겔화 아가로스
에어 펌프생물 의학 기기(Univentor)Eheim 100
AralditeCIBA-GEIGY23857.9매립용 수지
Sigma-AldrichA5177-5EA
호흡 마스크 마우스 알루마이트 알루미늄생물 의학 기기(Univentor)-
부프레노르핀Temgesic앰플진통제
모세혈관Science-ProductsGB100TF-10충전재
Dodecenylsuccinic 무수물Fluka44160
Dumont 핀셋(#3, 12cm, 스트레이트, 0.2 x 0.12mm)FST11203-23
전기 면도기필립스-
Ethicon 봉합사(Ethilon, 6-0 및 3-0)Ethicon-폴리아미드
눈 윤활제Bepanthene-Fast
GreenSigma-AldrichF7252주입된 액체의 시각화를 위한
가스 라우팅 스위치 4/2 커넥터Biomedical Instruments(Univentor)8433020
홀스테드 모기 지혈 겸자(12.5cm, 직선)FST13011-12
Heparin-NatriumRatiopharm25 000 I.E./5
mL 마우스용 인덕션 박스
수평으로 움직이는 뚜껑이 있습니다.
내부 치수: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm.
벽 두께: 6 mm
Biomedical Instruments (Univentor)-
홍채 집게(10cm, 곡선, 톱니)FST14007-14
홍채 가위(11cm, 스트레이트, 텅스텐 카바이드)FST14501-14
Isofluran OP Tisch, 전기 가열, sm
외부 치수: 257mm x110mm x 18mm.
가열 면적: 190mm x 90mm
호흡 마스크 탈출
이소플루란 제거는
규정에 따라 하향
Biomedical Instruments (Univentor)-
isoflurane (Attane)JD medical흡입 마취
LED RGB 조명카메오CLQS15RGBWLED 2 x 15 W
광학 현미경 기본 DM ELeica-4x(N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 &ninf;/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) 대물렌즈
마이크로피펫 풀러Science-ProductsP-97
모기 지혈 겸자(12.5 cm, 곡선)FST13010-12
니켈 그리드, 200 메쉬Ted Pella1GC200
오스뮴 (VIII)-oxidDegussa73219
프로필렌 옥사이드Fluka82320
면도날Schick87-10489
펜토바르비탈 나트륨 (Narcoren)Merial GmbH-
TC01mR 1-Channal 온도 컨트롤러피드백 포함 생물 의학 기기 (Univentor)-
Technovit 4004 두 구성 요소 접착제Kulzer
TelemacrodeviceCanon-CanonSpiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f / 3.5-5.6 IS STM 대물, 확장 150 mm 미만, 수동 확장 튜브 7 mm 링, 14 mm 링, 28 mm 링, 매크로 리버스 링 (58 mm), 캐논 복사 스탠드.
Thermopuller P-97Sutter Instruments-
얇은 진동 면도날 장치Krup-Szabo얇은 블레이드
톨루이딘 블루Sigma-Aldrich89640
투과 전자 현미경 C20Phillips-최대 200 kV
Tygon 6/4 모든 부품 연결용 튜빙 재료
외경: 6 mm
내경: 4 mm
Wa
ll 두께: 1 mm
Biomedical Instruments (Univentor)-
Ultracut EReichert-Jung-ultramicrotome
Univentor ScavengerBiomedical Instruments (Univentor)8338001
Vannas 가위(8cm, 직선)FST15009-08
조직 흡입기 튜닝 어셈블리 조정됩니다. 년

참고문헌

  1. Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159(1961).
  2. Hamlyn, L. H.

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