방법 논문

곰 팡이의 준비 및 동적인 핵 분극 고체 NMR을 사용 하 여 구조 설명에 대 한 식물 재료

DOI:

10.3791/59152

⸱

2019년 2월 12일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Louisiana State University, 2National High Magnetic Field Laboratory, 3Departments of Pediatrics, and Microbiology, Immunology and Parasitology, Louisiana State University Health Sciences Center

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

다차원 고체 NMR 분광학 및 동적인 핵 분극 (DNP) 조사 13C,15N 표시 된 곰 팡이 및 식물 견본을 준비 하기 위한 프로토콜 제공 됩니다.

초록

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이 프로토콜 보여줍니다 얼마나 균일 하 게 13C, 15N 표시 된 곰 팡이 자료 수 생산과 실험 어떻게이 부드러운 소재 고체 NMR 및 감도 향상 DNP 진행 한다. 식물 바이오 매스의 샘플 처리 절차 또한 상세한입니다. 이 방법을 사용 하면 일련의 1d 및 2D 13C-13C의 측정 /15N 상관 관계 스펙트럼, 최소한의 섭 동으로 그들의 네이티브 국가에서 복잡 한 생체 재료의 고해상도 구조 설명 있습니다. 동위 원소 라벨 1d 스펙트럼의 강도 및 2D 상관 관계 스펙트럼에 분극 전송 효율을 측정 하 여 시험 될 수 있다. 동적인 핵 분극 (DNP) 샘플 준비의 성공 감도 향상 요인에 의해 평가할 수 있습니다. 다 당 류와 단백질의 구조적 측면을 검토 하는 추가 실험 3 차원 구조의 모델 이어질 것입니다. 이러한 메서드를 수정 및 탄수화물이 풍부한 재료, 식물, 균 류, 조류, 박테리아의 자연 세포 벽을 포함 하 여 뿐 아니라 합성 또는 탄수화물 중합체 및 다른 그들의 복잡 한 디자인의 넓은 범위를 조사 하기 위해 적응 수 있습니다. 분자입니다.

서론

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탄수화물은 에너지 저장, 구조 건물, 및 세포 인식 및 접착 등 다양 한 생물학 과정에서 중심 역할을 한다. 그들은 세포 벽에 식물, 균 류, 조류, 박테리아1,2,3의 기본적인 구성 요소는 농축 됩니다. 세포 벽 역할을 항균 요법4,,56,7,8 대 유망 대상으로 바이오 연료 및 바이오 소재의 생산에 대 한 중앙 소스 , 9.

이러한 복잡 한 자료의 현대 이해는 수 십년의 4 개의 주요 생 화 확 적인 또는 유전자 방법을 사용 하 여 구조적 특성에 전념 했다 노력에 의해 실질적으로 고급 되었습니다. 첫 번째 주요 방법 의존 순차적 치료 가혹한 화학 물질이 나 효소를 사용 하 여 다른 부분으로 세포 벽을 무 너 뜨 리는 뒤에 작곡 및 각 분수10에서 설탕의 연계 분석. 이 방법은 고분자, 도메인 배포에 광명 하지만 해석 생체의 화학 및 물리적 특성으로 인해 오해의 소지가 있을 수 있습니다. 예를 들어 알칼리 추출 물 분수 유래와 비교 해도 덜 구조화 된 분자의 단일 도메인에서 또는 공간적으로 분리 된 분자에서 여부를 결정 하기가 어렵습니다. 둘째, 추출 된 부분 또는 전체 세포 벽 또한 측정 될 수 있다 또한 다른 분자11,12,13, 사이의 가교 되 나 공유 결합을 솔루션 NMR을 사용 하 여 14,15. 이 방법에서는, 화학식 앵커의 상세한 구조를 탐색할 수, 있지만 제한 류, 상대적으로 적은 수의 가교 사이트 및 안정화 비 공유 효과의 무지의 낮은 용 해도 인해 있을 수 있습니다. 다 당 류 패킹, 수소 결합, 반 데르 발스 힘, 정전기 상호 작용 및 폴리머 녹 채를 포함 하 여. 셋째, 바인딩 선호도 결정 있다 생체 외에서 사용 하 여 절연된 류16,,1718,19, 정화 절차를 실질적으로 변경할 수 있습니다. 구조와 이러한 생체의 속성입니다. 이 메서드는 또한 정교한 증 착 및 생 합성 후 고분자의 어셈블리를 복제 하도록 실패 합니다. 마지막으로, 표현 형, 세포 형태학 및 특정 세포 벽 구성 요소의 감쇠 생산 유전 돌연변이의 기계적 성질 류의 구조 기능에 조명 하지만 더 분자 증거 이러한 다리 필요 단백질 기계20의 조작된 기능을 가진 거시적인 관측.

개발 및 응용 프로그램 다차원 고체 NMR 분광학의 최근 발전 구조 퍼즐을 해결 하기 위한 독특한 기회를 도입 했습니다. 2D/3D 고체 NMR 실험 구성의 고해상도 조사 및 주요 섭 동 하지 않고 기본 상태에서 탄수화물이 풍부한 재료의 아키텍처를 사용합니다. 1 차 및 2 차 세포 벽 식물, 촉매로 처리 바이오 매스의 구조 연구가 성공적으로 실시 되어 세균의 biofilm 안료 유령 버섯에 그리고, 최근에 작가, 병원 성 균 류에서 그대로 세포 벽에 의해 Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. 동적인 핵 분극 (DNP)32,33,34,35,36,,3738 의 개발 , 39 , 40 , 41 , DNP로 감도 향상 현저 하 게 단축에 이러한 복잡 한 생체 실험 시간 42 실질적으로 NMR 구조 설명을 촉진 한다. 여기에 설명 된 프로토콜 동위 원소 레이블 A. fumigatus 곰 팡이 및 곰 팡이 준비 절차 및 공장 샘플 고체 NMR 및 DNP 특성화에 대 한 자세히 설명 합니다. 유사한 라벨 절차 변경 된 매체와 다른 균에 적용 되어야 합니다 그리고 샘플 준비 절차 다른 탄수화물이 풍부한 생체 재료에 일반적으로 적용 되어야 합니다.

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프로토콜

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1. 13C, 15N 표시 Aspergillus fumigatus 성장의 액체 매체

  1. 레이블이 없는의 준비와 13C, 15N 표시 된 성장 매체
    참고: 모두 효 모 추출 물 펩 포도 당 매체 (YPD)와 향상 된 최소한의 중간43 곰 팡이 문화 유지 관리를 위해 사용 되었다. 압력가 마로 소독 후 모든 단계는 오염을 최소화 하기 위해 층 류 후드에서 수행 됩니다.
    1. 레이블이 없는 액체 매체의 준비: 6.5 g 100 mL의 증류수 그리고 134 ° c.에 25 분 압력솥에 YPD 분말의 분해
    2. 레이블이 없는 단단한 매체의 준비
      1. 100 mL의 증류수에 한 천의 YPD 분말 6.5 g 1.5 g을 추가 합니다.
      2. 고압 121 ° C 그리고 멋진 약 50 ° c.까지 25 분 매체
      3. 각 미리 살 균 플라스틱 페 트리 접시에 매체의 13-15 mL을 전송 하 고 즉시 뚜껑을 사용 하 여 요리를 커버.
    3. 13C, 15N 표시 된 액체 매체의 준비
      참고: 동위 원소 라벨, 13를 포함 하는 최소 매체에 대 한 성장 솔루션을 준비 하 C-포도 당 및 15N-나트륨 질산염 및 추적 요소 솔루션은 별도로 준비와 다음 혼합 사용 하기 전에.
      1. 표 1에 나열 된 동위 원소를 포함 하는 최소 매체의 100 mL를 준비 합니다. 6.6 NaOH (1 M) 또는 HCl (1m) 솔루션을 사용 하 여에 pH를 조정 합니다.
      2. 고압 121 ° c.에 25 분에 대 한 최소한의 매체
      3. 100 mL를 준비 (1, 000 x) 성분 솔루션의 분해는 증류수에 표 2 에 나열 된 소금. 오토 클레이 브 134 ° c.에 25 분을 위한 솔루션 진정 하 고 단기 사용을 위한 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다. PH 약 6.5 되며 pH 미터를 사용 하 여 확인할 수 있습니다.
      4. 사용 하기 전에 표 2 에 나열 된 성분 솔루션의 0.1 mL 13C, 15N 표시 된 최소 매체의 100 mL를 추가 합니다.
  2. 곰 팡이 재료의 성장
    1. 층 류 두건에 inoculating 루프를 사용 하는 YPD 접시에 저장소에서 버섯의 작은 금액을 전송 합니다. 인큐베이터에 2 일 동안 30 ° C에서 문화를 유지.
    2. Inoculating 루프를 사용 하 여 전송 13C에 활성 성장 균 가장자리, 층 류 두건에서15N 라벨링 솔루션. 떨고 인큐베이터에서 220 rpm에서 3-5 일에 30 ° C에서 문화를 유지.
    3. 4000 x g 20 분 제거는 상쾌한에 centrifuge 고 펠 릿을 수집 합니다.
    4. 트위터를 사용 하 여 수집 잘 수 화 된 펠 릿의 ~0.5 g (> 50 wt % 수 화) NMR 연구. 어떤 시점에서 수 분의 손실을 실질적으로 스펙트럼 분해능을 악화 됩니다.
      참고: 필요한 경우, 수산화 사체의 소량 (0.1 g) 구분 고 후드 또는 수 화 수준 예측 하 고 건조 질량 백분율을 계산 하는 lyophilizer에서 N2 가스 흐름에서 완전히 건조. 일반적으로, 포함 하는 ~0.3 g 펠 렛 건조 질량 3 일 후에 얻어질 수 있다. NMR 실험 실시 긴 경우 (> 7 일) 또는 추가 처리 전에 곰 팡이 자료 10-20 분 동안 액체 N2 에 깊이 얼 수 있다 곰 팡이의 상태를 수정 하는 경우. 실험은 짧은 될 것입니다 (3-6 일), 동결 건너뛸 수 있습니다 샘플 신선한 남아 있을 수 있도록.
    5. 원심 분리기 튜브에 글리세롤의 20% (v/v) 초과 소재를 믹스 하 고 장기 저장을 위한-80 ᵒC 냉동 실에 보관.

2. 솔리드 스테이트 NMR 및 DNP 연구 A. fumigatus 의 준비

  1. 고체 NMR 실험 A. fumigatus 의 준비
    1. 13C, 15N 표시 된 곰 팡이 샘플 (단계 1.2.4.) 총 3 일 동안 성장 매체에서 작은 분자를 제거 하는 3.5 kDa 분자량 컷오프와 투 석의 가방을 사용 하 여 4 ° C에서 10 m m 인산 버퍼 (pH 7.0)의 1 L에 대 한 dialyze 매일 두 번 버퍼를 변경 합니다.
      참고: 또는 샘플 수 세척 될에 대 한 6-10 시간 잔여 작은 분자를 제거 하는 이온된 수를 사용 하 여.
    2. 15 mL 튜브 및 벤치탑 원심 분리기를 사용 하 여 5 분 (10000 x g) 원심 분리기 샘플을 전송 합니다. 상쾌한을 제거 하 고 나머지 균 자료를 수집.
    3. 70-80 밀리 그램을 팩은 4 mm ZrO2 회전자 또는 NMR 실험에 대 한 3.2 m m로 터에 30-50 밀리 그램으로 균일 하 게 13C 표시 하 고 잘 수 화 된 샘플 붙여넣기. 반복적으로 부드럽게 금속 막대를 사용 하 여 샘플을 짜 내 고 종이 사용 하 여 초과 물을 흡수.
    4. 단단히 터 모자 고 고체 NMR 특성화에 대 한 분석기에 샘플을 삽입 합니다.
      참고: 새로운로 터는로 터 충돌의 가능성을 최소화 하 고 샘플 NMR 분 광 기에서 유출 하는 제안입니다. 필요한 경우, 씰링 나사와 일회용 켈리 F 삽입으로 터 내부 보조 컨테이너 역할을 사용할 수 있습니다.
  2. DNP 실험 A. fumigatus 샘플의 준비
    1. 13C,15N 표시 된 곰 팡이 샘플에 대 한 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 DNP 용29,44 (DNP 매트릭스 라고도 함)의 100 µ L를 준비 합니다. D8의 혼합물을 포함 하는이 DNP 매트릭스-글리세롤/D2O/H2O (60/30/10 Vol %).
      참고: 레이블이 없는 샘플 하는 경우 조사, 준비 13C 고갈 d8을 사용 하 여 DNP 매트릭스-글리세롤 (12C3, 99.95%; D8, 98%)을 피하기 위해 13C D2O 및 H2O 신호는 용 매에서 기여.
    2. AMUPol45 양식 10 mM 급진적인 재고 솔루션 DNP의 100 µ L의 0.7 mg을 디졸브. 래 디 칼은 솔루션에 완전히 용 해 되도록 2-3 분 동안 소용돌이.
    3. AMUPol 솔루션의 50 µ L로 (2.1.1, 2.1.2 단계) 이전 단계에 설명 된 대로 dialyzed 13C, 15N 표시 된 곰 팡이 재료의 10 mg을 흡수 하 고 약간 혼합 사용 하는 유 봉과 박격포에 래 디 칼의 침투를 갈기 다공성 세포 벽입니다.
      참고: 수 분 손실의 속도 줄이기 위해, 연 삭 수 있습니다 또한 개최는 micropestle를 사용 하 여 microcentrifuge 튜브.
    4. 곰 팡이 샘플 추가 수화물에 grinded 펠 릿에 급진적인 솔루션의 또 다른 30 µ L을 추가 합니다.
    5. 3.2 m m 사파이어로 터에 펠 릿을 포장 하 고 약간 짜 초과 DNP 용 매를 제거. 3.2 m m 실리콘 플러그 수 분의 손실을 방지 하기 위해 추가 합니다. 일반적으로, 샘플의 5-30 mg로 터에 포장 될 수 있다 정확한 금액은 실시 NMR 실험의 감도 요구에 의해 결정 될 필요가 있다.
    6. 삽입 및 DNP 분석기에서 샘플을 회전 마이크로파 방사선에서 DNP 강화 된 스펙트럼을 측정 하 고 전자 레인지에서 스펙트럼과 비교. 이 이어질 것입니다 한 향상 계수 ε온/오프는 20-40이 복잡 한 재료 이어야 한다. 세포 벽 구조를 결정 하는 설계 된 실험을 실행 합니다.

3. NMR 및 DNP 연구를 위한 식물 바이오 매스의 준비

  1. 고체 NMR에 대 한 식물 재료의 준비
    1. 13C 라는 식물 성장 챔버 또는 13C-포도 당 매체에서 앞에서 설명한46,47 13CO2 공급을 사용 하 여 내부를 균일 하 게 생산 또는 직접 레이블된 자료 구입 동위 원소 라벨 기업입니다.
      참고: 13C-포도 당만 사용할 수 있습니다 어두운 성장에 12C의 소개를 피하기 위해 광합성에 의해.
    2. 잘라는 13C 작은 조각 (차원에서 일반적으로 1-2 m m)으로 식물을 분류 하는 균일 하 게 실험실 면도날을 사용 하 여.
      참고: 목적에 따라 추출 된 세포 벽은 가끔 사용 구조 특성화 고 상세한 프로토콜 이전 연구21,46에서 보고 됩니다.
    3. 샘플은 이전 건조, 물 100 µ L 1.5 mL microcentrifuge 튜브, 식물 재료의 30 밀리 그램에 추가 소용돌이, 1 일 실 온에서 equilibrate. 4000 x g 10 분에 centrifuge 고를 피 펫을 사용 하 여 초과 물을 제거 합니다.
    4. 샘플은 언제 든 지 결코 건조, 경우 직접 추가 치료 없이 샘플을 사용 합니다.
    5. 고체 NMR 실험에 대 한 3.2 m m 또는 4mm ZrO2 로 터로 결과 식물 재료를 포장 하십시오.
  2. DNP 연구에 대 한 식물 재료의 준비
    1. 10 mm AMUPol 설명된 단계 2.2.1을 2.2.2로 급진적인 60 µ L 재고 솔루션을 준비 합니다.
    2. 잘라는 균일 하 게 13C 라는 작은 조각 (차원에서 1-2 m m)으로 공부 될 식물 재료 실험실 면도날을 사용 하 여 및 식물 재료의 20 밀리 그램의 무게.
    3. 손 갈기 식물 조각 작은 입자 (~ 1-2 m m 크기)에 박격포 및 방 앗 공이 사용 하 여. 최종 분말 동질적인 외관이 있다.
    4. 40 µ L DNP 재고 솔루션의 준비 이전 단계 (2.2.2) 공장 설비 재료를 추가 하 고 약간 균질 급진적인 혼합 되도록 5 분에 대 한 갈기.
    5. 더 연 삭 후 공장 설비 재료를 수 화를 재고 솔루션의 또 다른 20 µ L를 추가 합니다.
    6. DNP 실험에 대 한 3.2 m m 사파이어로 터에 equilibrated 공장 샘플 팩을. 수 분의 손실을 방지 하기 위해 실리콘 플러그를 삽입 합니다.

4. 탄수화물이 풍부한 생체 재료의 초기 특성 표준 고체 NMR 실험

참고: NMR 실험의 간략 한 개요는이 섹션에서 제공 됩니다. 그러나, 구조 설명에는 일반적으로 광범위 한 전문 지식이 필요합니다. 따라서, NMR spectroscopists와 공동 노력 것이 좋습니다.

  1. 측정 1 D 13C 교차 편광 (CP), 35-s 2-s와 13C 직접 분극 (DP) 재활용 지연과 1H-13C 무능48,49 스펙트럼은 동역학의 일반적인 이해를 세포 구성 요소 (그림 1a)의 분포. 세포 벽은 일반적으로 상대적으로 단단한 부분 하 고 CP 스펙트럼에서 지배적인 신호를 전시.
  2. 일련의 표준 2D 13C-13C 상관 관계 실험 공명 할당 13C 신호를 측정 합니다. 일련의 1.5 ms RFDR52 (그림 1b) 등 50 ms 코드 공간을 통해 실험에 의해 지원 될 필요가 refocused 부적당 한50,51 탄소 연결을 얻기 위해 시작/DARR53 실험.
    참고: 기본 또는 보조 세포 벽, 풍부한 특정 구성 요소, 예를 들어 샘플을 찾을 수 관심의 경우 다음 여러 세그먼트 또는 여러 식물 해야 최적의 구성으로 샘플을 찾을 수 별도로 측정 되어야 합니다.
  3. 단백질과 nitrogenated 탄수화물의 공명 할당을 촉진 하기 위하여 측정 될 수 있는 2D 15N-13C 상관 관계 실험을 실시 합니다.
    참고: 공명 할당은 일반적으로 시간이 많이 걸리는. 메서드는 현재 탄수화물 신호 사전 경험 없이 그 과학자의 공명 지정을 촉진 하기 위하여 개발 되 고 있습니다.
  4. 보다 전문적인된 실험 공간 근거리 (그림 1 c, d), 수 화 및 mobilities로 탄수화물이 풍부한 재료의 3 차원 구조를 결정 하는 복잡 한 생체의 결정을 측정합니다 체계적으로 기술 이전2922,.

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결과

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실질적으로 NMR 감도 강화 하 고 2D 13C-13C와 13C-15N 상관 관계 스펙트럼 분석 구성, 수 화, 이동성을 일련의 측정 및 포장의 가능 하 게 동위 원소 라벨 중합체 세포 벽 구조 (그림 1)의 3 차원 모델을 생성 하는 통합 된 것입니다. 성공 하면 균일 한 라벨 1 D 13C와 15N 스펙트럼의 완전 한 세트는 1 시간 이내 수령 하실 수 없습니다 그리고 각 표준 2D 스펙트럼 측정의 24 시간 보다 더 이상 걸릴 해야 합니다.

잘 준비 된 샘플은 일반적으로 모두 높은 NMR 농도 기대 하 고 날카로운 라인. 변수 매개 변수의 손상 되지 않은 최적화 된 샘플 준비를 나타냅니다....

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

생 화 확 적인 방법에 비해, 고체 NMR 장점이 아닌-파괴 및 고해상도 기술로. NMR 작곡 분석, 양적 이며 또한 대부분의 다른 분석 방법과 달리 않습니다는 불확실성에 의해 소개 되지 biopolymers의 한정 된 가용성. 현재 프로토콜의 탄수화물이 풍부한 바이오 소재 및 기능성된 고분자에 대 한 미래의 연구를 촉진 한다. 그러나, 그것은 유의 공명 할당 및 데이터 분석 시간이 많이 소요 될 수 있습니다 및 일반적으로 체계적인 훈련을 요구 하십시오. 저자는 현재 개발 도구가이 장애물을 극복 하기 위해 사전 경험 없이 과학자 수 있도록 데이터베이스.

13C의 자연 동위 원소 풍부 1.1%만 이기 때문에, 관찰 하는 13C-13C 피크 재료 레이블 없음 사용 하 여 크로스 확률이입니다만 0.012% (1.1 x 1.1%)를 사용 하 여 균일 하 게 샘플을 표시. 따라서, 실질적으로이 프로토콜을 사용 하 여 달성 하는 동...

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공개 사항

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공개 하는 것이 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 국립 과학 재단 NSF OIA-1833040를 통해 지원 되었다. 국가 높은 자기장 실험실 (NHMFL) DMR 1157490와 플로리다의 상태를 통해 국립 과학 재단에 의해 지원 됩니다. NHMFL에서 매스 DNP 시스템 S10 OD018519 NIH와 NSF 체-1229170에 의해 일부 자금입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
암모늄 몰리브덴 데이트 테트라하이드레이트Acros Organics12054-85-2
AMUPolCortecnetC010P002
분석 계량 저울OhausB730439218모델 PA84C
Bioclave 16 LVWR470230-598
Biosafety CabinetLabconco corporation302319100
Boric acidVWRBDH922215-30 °에 매장; C
코발트 (II) 염화물 육수화물Honeywell|플루카60820≥ 98 %
구리 (II) 황산염 5 수화물BDHBDH9312≥ 98 %
코닝 LSE 진탕 인큐베이터Thermo Fisher Scientific7202152
D2O시그마 Aldrich15188299.9 원자 % D
d6-DMSO시그마 Aldrich15187499.9 원자 % D
d8-glycerol시그마 Aldrich447498≥ 99 원자 % D
투석 튜빙 3.2 kDa시그마 AldrichD2272132724
인산 디칼륨VWRBDH9266≥ 98 %
글리세롤시그마 AldrichG5516≥ 99.5 %
Heraus Megafuge 16R 원심분리기Thermo Fischer Scientific750004271Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS 일회용 인서트 키트BrukerB4493Kel-F
Iron(II) Sulfate HeptahydrateAlfa Aesar14498≥ 99+ %
황산 마그네슘 헵타 하이드레이트VWR1003499818-26 °에 저장; C
망간 (II) 염화물 테트라 하이드레이트Alfa Aesar11563≥ 99 %
모노포타슘 포스페이VWR470302-254≥ 99 %
pH 미터Mettler ToledoB706689216
Tetrasodium EthylenediaminetetraacetateAcros Organics13235-36-9≥ 99.5 %
아연 황산염 헵타하이드레이트알파 에자르33399≥ 98 %
12C3, d8-glycerol케임브리지 동위원소 연구소CDLM-866012C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-포도시그마 Alrdrich364606≥ 99 % (CP)
15N-질산나트륨시그마 알드리치364606≥ 98 % 15N, ≥ 99 (cp)
3.2mm 사파이어 NMR 로터CortecnetB6939
3.2mm 실리콘 플러그BrukerB7089
4mm MAS 로터 키트BrukerH14355지르코니아
트 당

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Murrey, H. E., Hsieh-Wilson, L. C. The chemical neurobiology of carbohydrates. Chemical Reviews. 108 (5), 1708-1731 (2008).
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  3. Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 850-861 (2005).
  4. Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnology Journal. 12 (9), 1246-1258 (2014).
  5. Loqué, D., Scheller, H. V., Pauly, M. Engineering of plant cell walls for enhanced biofuel production. Current Opinion in Plant Biology. 25, 151-161 (2015).
  6. Latge, J. P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).
  7. Ragauskas, A. J., et al. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311 (5760), 484-489 (2006).
  8. Service, R. F. Cellulosic ethanol - Biofuel researchers prepare to reap a new harvest. Science. 315 (5818), 1488-1491 (2007).
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