방법 논문

Overexpressing 긴 Noncoding RNAs 유전자 활성화 CRISPR를 사용 하 여

DOI:

10.3791/59233

⸱

2019년 3월 1일

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1Vatche and Tamar Manoukian Division of Digestive Diseases, Department of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Vatche and Tamar Manoukian Division of Digestive Diseases, Integrated Molecular Technologies (IMT) Core, Department of Medicine, University of California, Los Angeles, 3Division of Hematology and Oncology, Department of Medicine, University of California, Los Angeles

이 논문에서

요약

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전통적인 cDNA 기반 overexpression 기법 때문에 잠재적인 기능을 가진 그들의 여러 결합 형태 긴 noncoding RNAs의 overexpression에 대 한 제한 적용을 했습니다. 이 리뷰 긴 noncoding RNA의 여러 스플라이스 변종 overexpress CRISPR 기술을 사용 하 여 프로토콜을 보고 합니다.

초록

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긴 noncoding RNA (lncRNA) 생물학 연구, 2007 년 이후 기 하 급수적으로 성장 하는이 분야에서 간행물의 수의 새롭고 흥미로운 분야 이다. 이러한 연구는 lncRNAs 거의 모든 질병에 변경 되는 것 확인 했습니다. 그러나, 질병의 맥락에서 lncRNAs에 대 한 기능적 역할을 공부 하 고 단백질 제품, 조직의 특정 식, 낮은 식 레벨, 결합 한 형태로, 복잡 한의 부족 종 가운데 보존의 부족으로 어려운 남아 있다. 감안할 때 종의 식, lncRNA 연구는 종종 인간의 연구 컨텍스트 제한 질병 과정 공부를 할 때. LncRNAs는 분자 수준에서 작동, 이므로 lncRNA 생물 해 부 방법 중 하나는 lncRNA를 제거 하거나 overexpress lncRNA 및 측정 세포 효과. 이 문서에서는, 생체 외에서 lncRNAs overexpress을 작성 하 고 시각화 된 프로토콜 제공 됩니다. 대표적인 실험으로는 lncRNA 선 동적인 장 질병, 인터페론 감마 Antisense 1 (IFNG-AS1)와 관련 된 Jurkat T 세포 모델에 overexpressed에 표시 됩니다. 이 위해 활성화 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 기술은 overexpression 생 게놈 loci에서 사용할 수 있도록 사용 됩니다. 활성화 CRISPR 기술 대상 transcriptional 시작 사이트 여러 lncRNA 결합 형태의 강력한 overexpression를 활성화 한 유전자의 녹음 방송 요인의 집합. 이 절차 3 단계, 즉 (i) 가이드 RNA (gRNA) 디자인 및 벡터 건설, (ii) 바이러스 생성 및 변환, 및 (iii) 식민지 심사 overexpression에 대 한으로 세분화 될 것 이다. 이 대표적인 실험에 대 한 20-fold 향상 IFNG-AS1 Jurkat T 세포에서에서 관찰 되었다 보다는.

서론

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가장 생물 의학 연구는 단백질 코딩 성적표를 중점적으로, 베낀된 유전자의 대다수는 실제로 noncoding RNAs (합 자료 93)의 구성 됩니다. 현재 연구는 2007 년과 20171사이 기 하 급수적으로 상승 하는 질병 과정에서 lncRNAs에 간행물의 수와 함께이 필드를 탐험 시작 됩니다. 이 간행물은 많은 lncRNAs 질병와 관련 된 보여 줍니다. 그러나,이 lncRNAs의 분자 메커니즘은 mRNAs에 비해 그들의 다양 한 기능으로 인해 공부 하기가 어렵습니다. LncRNAs 질병에서의 역할 이해의 문제를 다중, lncRNAs 주로 코딩 RNAs2보다 하위 수준에 표시 됩니다. 또한, lncRNAs는 가난 하 게 보존, 인간의 세포 라인 기반 기술3기능 연구를 제한 하. 이 비 발한 유전자의 메커니즘을 연구 한 방법은 endogenously 경작된 한 세포에 overexpress 것입니다. Overexpression 학문 특정 한 유전자의 기능으로 중요 한 정보를 제공 하 고 연구원은 주요 분자 경로 해 부를 수 있도록 수 있습니다.

LncRNA 유전자의 전사를 활성화 하는 새로운 방법은 게르 바흐 연구소....

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프로토콜

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참고: 이 프로토콜에서는 복제 불충분 한 lentiviruses 중요 하다. 적절 한 실험실 안전 훈련 후에 바이러스 처리를 수행 합니다. 모든 항목 및 표면 처리 후 최소 10 분에 대 한 라이브 바이러스 접촉에 표 백제. 사용 일회용 랩 코트와 얼굴/눈 보호로 이중 장갑, 항상. Biosafety 수준 2 + 실험실 바이러스 인증 바이러스 작업을 수행 합니다. 바이러스 성 일 조직 문화 후드와 인큐베이터를 칩니다.

1. 벡터 디자인 및 생성

참고: GRNA 시퀀스를 식별 하는 가장 좋은 방법은 온라인 설계 도구 (예: http://crispr-era.stanford.edu)을 사용 하는 것입니다 (보충 그림 1: gRNA 디자인). 함께 대표적인 실험에 대 한 회사는 설계 및 대표 실험에 사용 된 gRNA 벡터를 만든. DCas9 플라스 미드 또한 온라인 구입 했다.

  1. GRNA 순서는 뉴클레오티드 순서 "NGG", 여기서 "N"은 또한 transcriptional 시작 사이트의 100의 기본적인....

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결과

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Overexpress lncRNA IFNG-AS1 듀얼 벡터 시스템
이 원고에 예제 실험 lncRNA IFNG AS19표현 Jurkat T 세포 모델 시스템의 overexpression입니다. IFNG-AS1 인터페론 감마10규제를 본 선 동적인 장 질병과 관련 된 하는 lncRNA입니다. IFNG-AS1 유전자는 모두 동일한 transcriptional 시작 사이트 (그림 1A)를 사용 하는 3 개의 결합 이체를 포함 합니다. 따라서, transcriptional 시작 사이트에서 10와 100 bp와 상류 "NGG" 시퀀스를 했다 gRNA 시퀀스 감독 Cas9 활성화 복잡 한 transcriptional 로커 스의 IFNG-AS1 (그림 1A).......

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토론

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이 원고는 생체 외에서 lncRNAs overexpress를 CRISPR를 활성화 사용 하 여 프로토콜을 선물 한다. 이 긴 noncoding RNAs transcriptomic 제품 기능 단위는 공부를 할 때 특히 중요 한 기술입니다. Overexpression, 후 연구원 수, 다음, 사용 하 여 이러한 셀 바인딩 파트너를 공부를 할 때 신호 대 잡음 비율을 증가 하 여도 세포 lncRNAs의 증가 수준 결과 측정. 또한, lncRNAs 자주 독립-유전자, 행동으로이 생 overexpression 기술을 공부11,12되도록 이러한 이벤트 가능 합니다.

이 원고 gRNA 창조 및 lentivirus 생성, 변환, 및 선택, 일반화 된 프로토콜을 강조 하 고 말 초 혈액 T 세포 라인에에서 lncRNA overexpression의 대표적인 예를 들어 설명 했다. 또한,이 기술.......

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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C.P.는 RO1 DK60729 및 P30 DK 41301-26에 의해 지원 됩니다. D.P.는 크 론 & Colitis 재단 (CCFA) 경력 개발 상, 치료에 의해 지원 됩니다: 소화기 질환 연구 센터 (DDRC) DK41301, 그리고 UCLA 임상 및 변환 과학 연구소 (CTSI) UL1TR0001881. Ucla의 바이러스학 코어로는 센터의 에이즈 연구 (CFAR) 투자 되었다 5 P 30 AI028697를 부여. 핵심 치료/P30에 의해 지원 되었다 UCLA 통합 분자 기술 DK041301를 부여 합니다. 이 작품 또한 UCLA 에이즈 연구소에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AmpicillinFisher ScientificBP1760-5
CaCl2Sigma AldrichC1016
cDNA 합성 키트 (iScript)BioRad1708891
dCas9 포워드 프라이머통합 DNA 기술n/a5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA 
dCas9 리버스 프라이머통합 DNA 기술n/a5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT
dCas9 벡터Addgene50918
DMEMCorning10013CM
에탄올아크로스 유기물61509-0010
FBS시그마 AldrichF2442
gRNA 플라스미드VectorBuilderVB180119-1195QXV
HEK293T 셀ATCC  CRL-1573
HEPES시그마 AldrichH3375
HPRT1 포워드 프라이머통합 DNA 기술n/aGACCAGTCAACAGGGGACAT 
HPRT1 리버스 프라이머통합 DNA 기술n/aGCTTGCGACCTTGACCATCT
Hygromycin BCorningMT3024CR
IsopropanolFisher ScientificBP2618-500
Jurkat 세포ATCC  TIB-152클론 E6-1
L-글루타민코닝25005Cl
LB 한천Fisher ScientificBP1425-500
LB 육수Fisher ScientificBP1426-2
Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit)Qiagen12362
Na2HPO4Sigma Aldrich
Optimem I 감소 혈청 미디어 Gibco31985070
p24 elisaPerkin ElmerNEK050B
PBSCorning21-040-CMR
페니실린 및 스트렙토마이신Corning30-002-Cl
pMDG2.GAddgene  #12259
pMDLg/pRRE애드진 #60488
폴리-L-라이신시그마 알드리치P-4832
폴리브레인EMD 밀리포어TR-1003
pRSV-REV애드진#12253
퓨로마이신 디하이드로클로라이드시그마 알드리치P8833
RNA 정제 키트(Aurum RNA mini)BioRad7326820
부티르산나트륨시그마 알드리치B5887
SYBR 그린(iTaq 유니버설)BioRad1725122
트리톤 X-100시그마 알드리치X100
NIST2186II

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miao, Y., et al. Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis. Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).
  2. Derrien, T., et al. The GENCODE v7 catalog of human long no....

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CRISPR ActivationGuide RNA DesignLentivirus ProductionViral TransductionColony ScreeningQuantitative PCRIFNG AS1 OverexpressionJurkat T CellsdCas9 SystemLong Noncoding RNA

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