Zebrafish 배아는 화학 화합물의 독성을 평가하는 데 사용됩니다. 그들은 외부에서 개발하고 미묘한 자형기능 변화의 검출을 허용, 화학 물질에 민감하다. 실험은 배아를 함유하는 플레이트에 직접 첨가되는 소량의 화합물만을 필요로 하므로 테스트 시스템이 효율적이고 비용 효율적입니다.
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이 논문에서
요약
초록
제브라피쉬는 질병 및 표현형 기반 약물 발견을 위해 널리 사용되는 척추동물 모델 유기체이다. 얼룩말 물고기는 많은 자손을 생성, 투명 한 배아와 빠른 외부 개발. 따라서 Zebrafish 배아는 소중하고 소량으로 사용할 수 있는 약물의 독성을 신속하게 평가하는 데에도 사용할 수 있습니다. 본 기사에서는, 1-5일 후 수정 배아를 이용한 화학 화합물의 독성을 효율적으로 스크리닝하는 방법에 대해 설명한다. 배아는 화합물의 다른 농도에 노출에 기인한 현상형 결함을 조사하기 위하여 입체 현미경에 의해 감시됩니다. 화합물의 반 최대 치명적인농도 (LC 50)도 결정 됩니다. 본 연구는 억제제 화합물의 3-6 mg을 요구했으며, 전체 실험은 기본 시설을 갖는 실험실에서 개인에 의해 완료되기까지 약 8-10 시간이 소요됩니다. 현재 프로토콜은 약물 발견의 초기 단계에서 화합물의 참을 수 없는 독성 또는 오프 타겟 효과를 식별하고 세포 배양 또는 다른 동물 모델에서 놓칠 수 있는 미묘한 독성 효과를 검출하기 위해 임의의 화합물을 테스트하는 데 적합하다. 이 방법은 절차 지연 및 약물 개발 비용을 줄입니다.
서론
약물 개발은 비용이 많이 드는 과정입니다. 단일 화학 화합물이 식품 의약국 (FDA)과 유럽 의약품 기구 (EMA)에 의해 승인되기 전에 수천 개의화합물이 10 억 달러 이상의 비용으로 선별됩니다 1. 전임상 개발 동안, 이 비용의 가장 큰 부분은동물 실험에 필요한 2. 비용을 제한하기 위해, 약물 개발 분야의 연구자들은 화학 화합물의 안전성 스크리닝을위한 대체 모델이 필요합니다 3. 따라서, 약물 개발의 초기 단계에서, 적합한 모델에서 화합물의 안전성 및 독성을 신속하게 평가할 수 있는 방법을 사용하는 것이 매우 유익할 것이다. 동물 및 세포 배양 모델을 포함하는 화학 화합물의 독성 스크리닝에 사용되는 여러 프로토콜이 있지만 검증되고 공통사용되는단일 프로토콜은 없다 4,5. zebrafish를 이용한 기존 프로토콜은 길이가 다양하며 편의요건6, 7,8,
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프로토콜
탐페레 대학의 제브라피시 핵심 시설은 국립 동물 실험 위원회(ESAVI/7975/04.10.05/2016)에서 부여한 설립 허가를 받았습니다. 제브라피시 배아를 이용한 모든 실험은 핀란드 동부 지방 정부, 탐페레 지역 서비스 단위 프로토콜의 사회 보건부에 따라 수행되었다 # LSLH-2007-7254/Ym-23.
1. 하룻밤 얼룩말 짝짓기 탱크 의 설정
- 2-5 성인 수컷 얼룩말과 3-5 성인 암컷 얼룩말어를 하룻밤 짝짓기 탱크에 넣습니다. (사육은 밤새 자동 어둡고 가벼운 사이클에 의해 아침에 유도된다).
- 두 개 이상의 화학 화합물의 독성을 평가하기위한 충분한 배아를 얻기 위해 여러 십자가를 설정합니다. 독성평가를 위해, 각 농도는 최소 20개의 배아23을필요로 한다.
- 동물에게 스트레스를 받지 않으려면, 동물이 번식을 위해 동일한 개인을 사용하기 전에 2 주 동안 휴식을 취하도록 하십시오.
2. 배아 수집 및 화학 화합물에 대한 노출을위한 플레이트 준비
- 배아를 수집, 다음날 정오, 미세 메쉬 여과기를 사용하여 E3 배아 배지 [5.0 mM NaCl, 0.17 mM KCl....
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결과
독성 평가의 중요한 부분은 단일 실험에서 하나 또는 여러 화학 화합물의 서로 다른 농도를 테스트하는 것입니다. 처음에는, 독성평가를 위한 화합물을 선택하고, 각 화합물에 대해 시험할 농도의 수를, 그에 따라, 차트를 만든다(도 3). 우리는 샘플을 구성하기 위해 각 화합물에대한 고유 한 색상을 사용했다 (그림 3). 나중에 혼합을 피하기 위해 용매 내성 마커의 사용과 플레이트의 바닥 이나 측면에 라벨링하는 것이 중요합니다. 화합물이 억제제의 상이한 농도에 노출된 유충내의 어떤 현상형 결함을 유도하는 경우에, 결함은 1-5 dpf의 기간 동안 매 24 시간마다 기록된다 (그림4A,B, C,D). 500 μM의 농도에서 공지된 CA IX 억제제로 처리된 배아는 화학 화합물에 노출된 1.......
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토론
배양된 세포를 이용한 시험관내 독성 시험은 시험 화합물에 의해 유도된 독성에 대한 제한된 정보를 제공하는 세포의 생존 및 형태학적 연구를 검출할 수 있다. 제브라피시 배아를 이용한 화학 화합물의 독성 스크리닝의 장점은 관련 모델 유기체에서 배아 개발 동안 전체 동물에서 화학적으로 유도된 현상형 변화를 신속하게 검출하는 것이다. 단백질 코딩 인간 유전자의 약 70%는 제브라피시 게놈25에서직교 에 대응되어 있다. 신호 전이 및 발달을 제어하는 유전적 경로는 인간과 제브라피시(26) 사이에 고도로 보존되며, 따라서, 화학화합물은 인간25에서유사한 독성 효과를 가질 가능성이 있다.
Zebrafish는 독성 연구의 최전선에 있으며 이미 물 샘플에서 독소를 검출하고 환경 독소의 작용 메커니즘과 동물27에.......
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공개 사항
저자에 의해 잠재적 인 이해 상충이보고되지 않았습니다.
감사의 글
이 작품은 시그리드 주셀리우스 재단(SP, MP), 핀란드 문화 재단(AA, MH), 핀란드 아카데미(SP, MP), 오리온 파노스 재단(MH), 탐페레 결핵 재단(SP, MH 및 MP), 제인 과 아토스 에르코 재단(SP 및 MP)의 보조금으로 지원되었습니다. ). 우리는 항결핵 및 항암 제 개발 목적을 위한 안전성 및 독성 평가를 위한 탄산 아수드라아제 억제제를 제공한 이탈리아와 프랑스 협력자, 수푸란 교수 및 Winum 교수에게 감사드립니다. 아울릭키 레무스와 마리안 쿠슬라티에게 기술 지원에 감사드립니다. 우리는 또한 제브라피시 사육과 배아 수집에 도움을 준 리나 메키넨과 한날리나 피포에게 감사를 표합니다. 우리는 진심으로 원고와 통찰력있는 의견의 비판적 평가 할란 바커에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 24웰 플레이트 | Nunc | Thermo Scientific | |
| 저울(저울) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| 저울(저울) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT. Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, 독일 | D4540 | |
| Falcon 튜브 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| 고분자량 메틸셀룰로오스 | Sigma Aldrich, 독일 | M0262 | |
| 제브라피쉬 유충 인큐베이터 | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브 | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| 파라핀 히스토플라스트 IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| 파스퇴르 피펫 | Sarstedt | 86.1171 | |
| 페트리 접시 | Thermo Scientific | 101R20 | |
| 페트리 플레이트 | Sarstedt | 82.1473 | |
| 피펫 (1 mL 및 200 μ L) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| 플레이트 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 컬러 | |
| 바이알 (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| 제브라피쉬 AB 균주 | ZIRC | ZL1 |
참고문헌
- Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes. Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).
- Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A.....
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