이 프로토콜의 목적은 여러 셀 혈통으로 차별 하는 인간의 혈관 주위 지방 조직에서 파생 된 조상 세포의 능력을 테스트 하는. 체형, osteocyte, 및 chondrocyte 혈통으로 차별화 하는 데 알려져 있다 인간의 골 수에서 파생 된 중간 엽 줄기 세포 분화와 비교 되었다.
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이 논문에서
요약
초록
지방이 많은 직물은 다 강력한 중간 엽 줄기 세포 (MSC)로 분화의 능력의 풍부한 소스 osteogenic, adipogenic, 및 chondrogenic 계보. Adipogenic 조상 세포의 분화 응답 비만으로 지방 조직 확장 및 부전을 운전 하는 주요 메커니즘입니다. 혈관 주위 지방 조직 (PVAT)에 대 한 이해 변경 임상 관련 대사 질환에 따라서 이다. 그러나, 이전 연구는 주로 마우스와 다른 동물에서 수행 되었습니다 모델. 이 프로토콜은 관상동맥 바이패스 접목 수술 환자에서 인간의 흉부 PVAT 샘플을 사용 합니다. 오름차순 대동맥에서 지방 조직 수집 되었고 stromal 혈관 분수의 explantation에 대 한 사용. 우리는 이전을 포함 하는 지질으로 차별화 하는 수 용량을 가진 인간 PVAT에 많은 조상 세포의 존재 확인 adipocytes. 이 연구에서 우리가 더 분석 stromal 혈관 분수에서 세포의 감 별 법 잠재력 아마도 다 강력한 조상 세포를 포함 하. 우리는 인간의 골 수 MSC osteogenic, adipogenic 및 chondrogenic 계보에 차별화를 PVAT 파생 셀 비교. 차별화의 14 일, 다음 특정 얼룩 adipocytes (기름 빨간 O)에서 지질 축적을 감지 활용 했다 osteogenic 셀 (Alizarin Red), 또는 있다 chondrogenic 셀 (Masson의 Trichrome) 콜라겐에 calcific 예금. MSC는 효율적으로 모든 3 개의 계보에 분화 하는 골 수, 동안 셀 PVAT 파생 했다 adipogenic 및 chondrogenic 잠재적인, 하지만 강력한 osteogenic 잠재력 부족.
서론
지방이 많은 직물은 다 강력한 중간 엽 줄기 세포 (MSC)로 분화의 능력의 풍부한 소스 osteogenic, adipogenic, 및 chondrogenic 계보1. 이 조직을 통해 성숙한 adipocytes의 비 대와 드 노 보 차별화 adipocytes에 거주 MSC의 확장합니다. 혈관 주위 지방 조직 (PVAT) 혈관을 포위 하 고 조절 관 기능2,3. PVAT 확장 비만 유발 심혈 관 병 리 악화. 동안 인간의 피하 지방이 많은 저장소에서 MSC의 multipotent 잠재력 잘 공부4,5, 아니 연구 explanted 고로 인해 가능성이 인간 PVAT 파생 된 조상 세포의 분화 용량 평가 조달의 침입입니다. 따라서,이 작품의 목표 explant에서 심장 혈관 질병을 가진 환자에서 인간의 대동맥 PVAT 조상 세포를 전파 하 고 그들의 성향에 osteogenic 차별화, chondrogenic, 및 adipogenic 계보를 테스트 하는 방법을 제공 하는 것 이다. 관상동맥 바이패스 접목 수술 비만 환자의 대동맥 오름차순에 바이패스 ....
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프로토콜
이 연구에서 인간의 조직에의 사용 되었다 평가 하 고는 제도적 검토 보드의 메인 의료 센터에 의해 승인 모든 인사 실험 전에 적절 한 훈련을 받았다.
1입니다. 준비
- 버퍼를 분리 하 게 50 mg을 재구성 하 여 동물 무료 콜라/dispase 혼합 나 솔루션 nanopure H2o. 준비 1 mg/mL 작업 솔루션의 1 mL 높은 포도 당 1 %w / v BSA 재구성된 콜라에 포함 된 DMEM의 49 mL을 추가 하 여 / dispase 솔루션입니다. -20 ° C와 따뜻한 물 목욕 전에 사용 하 여 사용 하는 37 ° c에서 5 mL 작업 aliquots을 저장 합니다.
- HBSS, 49 mL를 100 x 항생제/antimycotic 솔루션 (최종 농도 200 단위/mL 페니실린, 200 단위/mL 스 및 0.5 µ g/mL fungizone)의 1 mL을 추가 하 여 항생제 솔루션을 확인 하 고 얼음에 저장.
- Nanopure H2o. 압력솥 20 분에 대 한 솔루션의 100 ml에서 소 피부에서 200mg 젤라틴 용 해 하 여 젤라틴 솔루션 (0.2 %w / v)을 준비 하 고 4 ° c.에 저장
- PVAT 성장 매체의 500 mL....
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결과
인간 PVAT에서 stromal 혈관 분수의 절연
그림 1A 는 오름차순 대동맥 overlying PVAT 획득 했다 해 부 지역의 회로도 보여준다. 우리는 이전 관상동맥 바이패스 접목에서이 샘플은 파생된6받고 환자 인구를 설명 합니다. 그림 1B 수술 후 얻은 인간 PVAT의 예를 보여 줍니다. 그림 1C Masson의 Trichrome 얼룩으로 얼룩이 대표 PVAT 조직 섹션을 보여 줍니다. 그림 1D 차별화 이전 확장 단계 동안 PVAT 파생 stromal 세포의 인구를 보여.......
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토론
다른 플랫폼에서 많은 조상 세포 표현 형 및 차별화 잠재적인9에서 넓게 변화 한다. 3 다른 계보 다운 동시 유도 단일 환자 기증자에서 PVAT 파생 창시자 경작, osteogenic, adipogenic 그리고 chondrogenic,이 소설의 만능 용량 잘 제어 조사에 대 한 수 수 조상 세포의 인구입니다. 인간의 PVAT에서 조상 세포의 분화 능력을 테스트 하 고 PVAT pathologies 및 혈관 음색 통제에 그들의 기능을 이해 하는 것이 보고서에 설명 된 방법론을 사용할 수 있습니다. 이 방법의 몇 가지 장점은 단순 하 고 관상 동맥에서 기본 인간 조직의 사용 환자, 심한 심장 혈관 질병을 가진 환자에서 PVAT 조상 세포 기능 조사 활성화를 우회. 그러나, explants는 500 mg 조직에서에서 일반적으로 항복 < 1000 점착 세포 및 따라서이 접근에 1 개의 중요 한 경고를 강조는 적절 한 숫자를 5-7 구절을 필요. 트라이-혈통 차별화 실험의 성공을 위한 중요 한.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리는 임상 조직, Histopathology 및 메인 의료 센터 연구에서 Histomorphometry 코어 (1P20GM121301, L. Liaw PI 지원)의 조달을 위한 메인 의료 센터에서 연구 탐색의 도움을 인정 단면화 및 얼룩에 대 한 연구소입니다. 이 작품은 NIH에 의해 지원 되었다 R01 HL141149 부여 (L. Liaw).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 동물성 성분이 없는 콜라겐 분해효소/디스파제 블렌드 I | Millipore-Sigma | SCR139 | 50mg |
| Alcian Blue | NewComerSupply | 1003A | 1% 수용액 pH 2.5 |
| Alizarin Red | Amresco | 9436-25G | |
| alpha-MEM | ThermoFisher | 12561056 | |
| Aniline Blue | NewComerSupply | 10073C | |
| 항생제/항진균제 | ThermoFisher | 15240062 | |
| Beibrich's scarlet acid fuchsin | Millipore-Sigma | A3908-25G | |
| b-글리세로인산 | Millipore-Sigma | G9422-10G | |
| Biebrich Scarlet | EKI | 2248-25G | |
| 비오틴 | Millipore-Sigma | B4501-100MG | |
| Bouin의 고정액 | NewComerSupply | 1020A | |
| 소 혈청 알부민 | Calbiochem | 12659 | 4 °에 저장됨; C |
| 세포 박리 용액 | Accutase | AT104 | |
| Bell strainer (70 mm) | Corning | 352350 | |
| Dexamethasone | Millipore-Sigma | D4902-100MG | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L 포도당, L-glut 및 피루브산 |
| DMEM/F12 매체 | ThermoFisher | 10565-042 | 고포도당, 글루타맥스, 나트륨 바이카르비네이 |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650 | |
| 태아 소 혈청 | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| 포르말린 | NewComerSupply | 1090 | |
| 젤라틴, 소 가죽 | Millipore-Sigma | G9391-500G | |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | 글루타민 보충제 |
| HBSS | Lonza | 10-547F | |
| IBMX | Millipore-Sigma | I5879-250MG | |
| 인슐린 용액 | Millipore-Sigma | I9278-5ML | |
| 오일 레드 O | Millipore-Sigma | O0625-100G | |
| 판토텐산 | Millipore-Sigma | P5155-100G | |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액 | ThermoFisher | 15240062 | 100ml |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| 포스포텅스탄/포스포모이브딕산 용액 | Millipore-Sigma | P4006-100G/221856-100G | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 배양 배지용 항균 시약. |
| Rosiglitazone | Millipore-Sigma | R2408-10MG | |
| TGFb1 | Peprotech | 100-21 | |
| Weigert의 헤마톡실린 | EKI | 4880-100G |
참고문헌
- Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).
- Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C.
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