인간의 대동맥 혈관 주위 지방 조상 세포의 분화 능력

요약

이 프로토콜의 목적은 여러 셀 혈통으로 차별 하는 인간의 혈관 주위 지방 조직에서 파생 된 조상 세포의 능력을 테스트 하는. 체형, osteocyte, 및 chondrocyte 혈통으로 차별화 하는 데 알려져 있다 인간의 골 수에서 파생 된 중간 엽 줄기 세포 분화와 비교 되었다.

초록

지방이 많은 직물은 다 강력한 중간 엽 줄기 세포 (MSC)로 분화의 능력의 풍부한 소스 osteogenic, adipogenic, 및 chondrogenic 계보. Adipogenic 조상 세포의 분화 응답 비만으로 지방 조직 확장 및 부전을 운전 하는 주요 메커니즘입니다. 혈관 주위 지방 조직 (PVAT)에 대 한 이해 변경 임상 관련 대사 질환에 따라서 이다. 그러나, 이전 연구는 주로 마우스와 다른 동물에서 수행 되었습니다 모델. 이 프로토콜은 관상동맥 바이패스 접목 수술 환자에서 인간의 흉부 PVAT 샘플을 사용 합니다. 오름차순 대동맥에서 지방 조직 수집 되었고 stromal 혈관 분수의 explantation에 대 한 사용. 우리는 이전을 포함 하는 지질으로 차별화 하는 수 용량을 가진 인간 PVAT에 많은 조상 세포의 존재 확인 adipocytes. 이 연구에서 우리가 더 분석 stromal 혈관 분수에서 세포의 감 별 법 잠재력 아마도 다 강력한 조상 세포를 포함 하. 우리는 인간의 골 수 MSC osteogenic, adipogenic 및 chondrogenic 계보에 차별화를 PVAT 파생 셀 비교. 차별화의 14 일, 다음 특정 얼룩 adipocytes (기름 빨간 O)에서 지질 축적을 감지 활용 했다 osteogenic 셀 (Alizarin Red), 또는 있다 chondrogenic 셀 (Masson의 Trichrome) 콜라겐에 calcific 예금. MSC는 효율적으로 모든 3 개의 계보에 분화 하는 골 수, 동안 셀 PVAT 파생 했다 adipogenic 및 chondrogenic 잠재적인, 하지만 강력한 osteogenic 잠재력 부족.

서론

지방이 많은 직물은 다 강력한 중간 엽 줄기 세포 (MSC)로 분화의 능력의 풍부한 소스 osteogenic, adipogenic, 및 chondrogenic 계보¹. 이 조직을 통해 성숙한 adipocytes의 비 대와 드 노 보 차별화 adipocytes에 거주 MSC의 확장합니다. 혈관 주위 지방 조직 (PVAT) 혈관을 포위 하 고 조절 관 기능^2,3. PVAT 확장 비만 유발 심혈 관 병 리 악화. 동안 인간의 피하 지방이 많은 저장소에서 MSC의 multipotent 잠재력 잘 공부^4,5, 아니 연구 explanted 고로 인해 가능성이 인간 PVAT 파생 된 조상 세포의 분화 용량 평가 조달의 침입입니다. 따라서,이 작품의 목표 explant에서 심장 혈관 질병을 가진 환자에서 인간의 대동맥 PVAT 조상 세포를 전파 하 고 그들의 성향에 osteogenic 차별화, chondrogenic, 및 adipogenic 계보를 테스트 하는 방법을 제공 하는 것 이다. 관상동맥 바이패스 접목 수술 비만 환자의 대동맥 오름차순에 바이패스 이식의 문 합의 사이트에서 PVAT의 우리의 소스가입니다. 갓 격리 PVAT 효소 해리 이며 stromal 혈관 분수 격리 및 생체 외에서, 처음으로 인간의 PVAT 파생 된 조상 세포의 분화 능력 테스트를 전파.

기본 교양된 인간 PVAT stromal 혈관 분수를 사용 하 여, 줄기/뿌리 세포 osteogenic, adipogenic 또는 chondrogenic 계보 차별화를 유도 하도록 설계 된 3 개의 분석 테스트. 우리의 이전 연구 식별 CD73 +, CD105 + 및 PDGFRa + (CD140a) 튼튼하게 adipocytes⁶, 차별화 수 있는 세포의 인구 그들의 multipotency 테스트 하지는 않지만. PVAT는 직접 혈관 음색 및 염증⁷을 통제 한다. 이 새로운 세포 인구의 차별화 가능성을 테스트 하기 위한 근거 혈관 기능에 PVAT의 특수 영향 및 비만 중 PVAT 확장의 메커니즘을 이해 하기 시작 하는. 이 방법론은 지방 조직 파생된 조상 세포의 기능에 대 한 우리의 이해를 강화 하 고 식별 하 고 유사점과 다른 조직 소스에서 조상 세포의 차이점을 비교할 수 있습니다. 우리는 분리 하 고 다른 혈통으로 MSC 차별화에 대 한 설립 및 검증 된 방법에 따라 구축 하 고 인간 PVAT 파생 된 조상 세포의 생존 능력을 극대화 하는 절차를 최적화. 이러한 기술은 줄기와 조상 세포 연구와 지방 조직 개발의 분야에서 광범위 한 응용 프로그램 있다.

프로토콜

이 연구에서 인간의 조직에의 사용 되었다 평가 하 고는 제도적 검토 보드의 메인 의료 센터에 의해 승인 모든 인사 실험 전에 적절 한 훈련을 받았다.

1입니다. 준비

1. 버퍼를 분리 하 게 50 mg을 재구성 하 여 동물 무료 콜라/dispase 혼합 나 솔루션 nanopure H₂o. 준비 1 mg/mL 작업 솔루션의 1 mL 높은 포도 당 1 %w / v BSA 재구성된 콜라에 포함 된 DMEM의 49 mL을 추가 하 여 / dispase 솔루션입니다. -20 ° C와 따뜻한 물 목욕 전에 사용 하 여 사용 하는 37 ° c에서 5 mL 작업 aliquots을 저장 합니다.
2. HBSS, 49 mL를 100 x 항생제/antimycotic 솔루션 (최종 농도 200 단위/mL 페니실린, 200 단위/mL 스 및 0.5 µ g/mL fungizone)의 1 mL을 추가 하 여 항생제 솔루션을 확인 하 고 얼음에 저장.
3. Nanopure H₂o. 압력솥 20 분에 대 한 솔루션의 100 ml에서 소 피부에서 200mg 젤라틴 용 해 하 여 젤라틴 솔루션 (0.2 %w / v)을 준비 하 고 4 ° c.에 저장
4. PVAT 성장 매체의 500 mL를 준비: 높은 포도 당 DMEM/F12 글루타민 보충, 나트륨 pyruvate와 나트륨 중 탄산염, 보충 10 %FBS 100 µ g/mL 항균 에이전트 ( 재료의 표참조).
5. 50 mL adipogenic 유도 미디어 준비: 40.8 mL 높은 포도 당 DMEM, 7.5 mL PVAT 성장 매체, 500 µ L 항생제/antimycotic 솔루션 (최종 농도 100 단위/mL 페니실린, 100 단위/mL 스 0.25 µ g/mL fungizone), x 100의 보충 0.5 m m IBMX (0.1 M NaOH의 주식 500 m m), 1 µ M dexamethasone (에탄올의 주식 1 m m), 5 μ rosiglitazone (DMSO의 주식 5 m m), 33 µ M biotin (DMSO에 66 m m 재고), 100 nM 인슐린 (200 µ M 주식 0.1% 초 산), 그리고 20 µ M 판토텐산 (100 m m H₂ 에서 재고 O)입니다.
6. Adipogenic 계보에 대 한 제어 유도 미디어의 50 mL를 준비: 40.8 mL 높은 포도 DMEM 7.5 mL PVAT 성장 매체와 펜-strep (100 x 주식)의 500 µ L 보충.
7. 50 mL adipogenic 유지 보수 미디어 준비: 41.5 mL 높은 포도 DMEM 7.5 mL PVAT 성장 미디어 단계의 1.3, 500 µ L 펜 strep (100 x 사진), 1 µ M dexamethasone (EtOH에 1 m m 재고), 33 µ M biotin (DMSO에 66 m m 재고), 100 nM 인슐린 (0.1 %ac 200 µ M 재고 보충 etic 산), 그리고 20 µ M pantothenic 산 (H₂O의 주식 100 m m).
8. 성장 매체의 500 mL osteogenic 및 chondrogenic 계보에 대 한 준비: 높은 포도 당 αMEM 보충 10 %FBS, 1 x 글루타민 보충 ( 재료의 표참조), 펜-strep (100 x 사진)의 5 ml.
9. 유도 미디어의 50 mL osteogenic 혈통에 대 한 준비: 50ml 10 nM dexamethasone와 10 m m β-glycerophosphate 보충 골 MSC 성장 매체의.
10. Chondrogenic 계보에 대 한 유도 미디어의 50 mL를 준비: 100 nM dexamethasone, 50 µ g/mL 하는데-2-인산 나트륨, 그리고 10 ng/mL TGFβ1 보충 골 MSC 성장 매체의 50 mL. Osteogenic chondrogenic 조건에 대 한 기저 골 MSC 성장 매체 비 유도 미디어 될 것입니다.

2. 프로토콜 1: 문화 인간 PVAT 셀 Stromal 혈관 분수에서

참고: PVAT는 마 취 환자 관상동맥 우회 이식 절차의 오름차순 대동맥에 문 합 이식의 사이트에서 잘라냅니다. 대동맥 PVAT는 15 mL 원뿔 포함 10 mL 얼음 차가운 높은 포도 당 DMEM F12에에서 배치 하 고 수술 실에서 절제의 2 h 이내 실험실으로 전송 됩니다. 대동맥 PVAT 우회 절차 동안 폐기 조직 이며 메인 의료 센터의 내부 검토 위원회에 의해 비 인간 대상 연구로 간주 되었습니다.

1. 이 프로토콜의 인간 PVAT (약 0.5 c m³x 1 x 3) ~ 500 mg 조각입니다. DMEM의 신선한 인간의 PVAT 25 mL 항생제 솔루션을 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 전송. 락을 4 ° c.에 20 분을 품 어 항생제 솔루션에는 PVAT를 실행 하는 동안 37 ° c.에 분리 버퍼의 약 수를 녹여
2. 5 mL 분리 버퍼에 100 x 항생제/antimycotic 솔루션의 50 µ L을 추가 하 고 필터 주사기 0.22 μ m를 사용 하 여 소독. 1 24-잘 접시의 젤라틴 해결책의 1 mL를 추가 합니다. 층 류 두건에 멸 균 페 트리 접시에 항생제 솔루션에서 PVAT를 전송 소독 집게와가 위를 사용 합니다. 조직에 미리 데워 진된 분리 버퍼의 1 mL을 추가 하 고 잘게 (조각 ~ 2 x 2 m m²보다 더 큰) 슬러리에 전체 조직을 말하다 소독 집게와 해 부가 위를 사용 하 여.
3. 4 mL 분리 버퍼에 1 mL 슬러리를 전송 하 고 1 시간에 200 rpm에서 37 ° C에 미리 데워 진된 궤도 통에서 옆에 튜브를 품 어. 1 시간 후 아니 보이는 조직 조각 있을 것입니다, 그리고 솔루션 흐린 세포 현 탁 액으로 표시 됩니다.
4. 50 mL 원뿔 튜브 위에 설정 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 솔루션을 필터링 합니다. 가능한 많은 셀을 캡처하는 추가 10 mL 항생제 솔루션 여과기를 헹 구 십시오. 스 트 레를 짠 다 하지 않습니다.
5. 300 x g 스윙 양동이 원심 분리기에서 12 분에 대 한 셀 작은
   참고: 원심, 후 튜브 adipocytes를 interphase 및 펠 릿의 지방 상위 계층으로 구분 됩니다. 펠 릿은 내 피 세포, 면역 세포, 혈액 세포, 및 조상 세포를 포함 하는 실질 혈관 분수.
6. HBSS 300 x g에 5 분 동안 원심 분리기의 10 mL에 펠 릿을 resuspend. HBSS 2 세척의 총에 대 한이 단계를 반복 합니다. 최종 세척 후 붉은 혈액 세포를 lyse 하지 마십시오. 여러 상용 버퍼와 보육 시간 반복된 시도 조상 세포 부착 및 생존에서 표시 된 감소에 들어서있다.
7. 24-잘 접시에서 젤라틴 발음 부드럽게 씻어 HBSS 언바운드 젤라틴을 제거 하는 잘 1 x.
8. 성장 매체와 젤라틴 코팅에 씨의 1 mL에 그대로 적혈구와 펠 릿 stromal 혈관 분수 resuspend 잘. 문화 매체에 25 ng/mL의 최종 농도에 인간 FGF2 (0.01% BSA w/v로 보충 하는 PBS에 resuspended)를 추가 합니다. 5% CO₂와 37 ℃에서 24 h에 대 한 품 어.
9. 다음 날, 제거 성장 미디어와 세척 적혈구 세포와 죽은 세포를 제거 하는 HBSS 5 x 우물. 25 ng/mL FGF2 보충 하는 신선한 성장 매체의 1 mL에 추가 합니다.
10. 미디어 25 ng/mL로 보충을 확인 하 고 모든 48 h 변경 신선한 FGF2 각 시간.
11. 셀은 일반적으로 도달 100% 합류 explant; 후 7-10 일 다음 통로 셀:
    1. 성장 미디어와 세척 단층 2 발음 1 ml HBSS x. 우물에서 모든 HBSS 발음 하 고 세포 분리 솔루션의 몇 방울을 추가 합니다.
    2. 그리고 소용돌이 격판덮개 여러 번 누르고 5% CO₂ 셀 리프트 5-7 분 동안 37 ° C에서 품 어. 분리 된 세포에 신선한 문화 매체의 ~ 1 mL을 추가 하 고 24-잘 접시, 각 포함 500 µ L 성장 매체 및 25의 2 웰 스에 500 µ L를 배포 FGF2 ng.
12. 이전 단계에 표시 된 대로 인간의 PVAT 파생 셀 확장을 계속 합니다. 각 통로 1:2 분할 보다 더 큰 되어야 합니다. 세포 감 별 법 분석에 대 한 할당 하기 전에 5-7 번 passaged는.

3. 프로토콜 2: 문화 인간 골 MSC 식민지

참고: 인간의 골 MSC 설명된⁸ 로 고립 되 고 초기 통로 주식을 냉동으로 저장 액체 N₂~ 100000 셀/mL에서 미디어 (70% FBS 20% 기저 DMEM과 10 %DMSO)를 고정 합니다.

1. 빠르게 MSC 성장 매체의 3 mL를 포함 하는 6-잘 문화 접시의 한 잘에 37 ° C 물 목욕 및 격판덮개에 액체 N₂ 에서 골 수 MSC의 유리병을 해 동 하 고 37 ° C, 5% CO₂에서 밤새 품 어.
2. 다음 날, MSC 문화 미디어를 발음 하 고 3 세포를 씻어 HBSS 2 mL에 x. 100% 합류에 성장 매체를 발음 하 고 3 세포를 씻어 HBSS 2 mL에 x. 500 µ L/잘 세포 분리 솔루션을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO₂ 5 분 모든 셀 수 있도록 접시 dislodged 탭에서 품 어 2 웰 스 2 mL MSC 성장 매체를 포함 하는 6-잘 접시의 내용을 균일 하 게 배포.
3. 인간의 골 수 및 PVAT 파생 MSC 병렬 약 5-7 구절 또는 테스트에 대 한 충분 한 수량 달성 되었습니다 때까지 확장 합니다.

4. 3 프로토콜: 접시 그리고 Osteogenic, Adipogenic 및 Chondrogenic 계보를 일으킬

1. 골 고 잘 12-잘 접시 및 적절 한 당 PVAT 파생 셀의 플레이트 적절 한 숫자는 각 실험 조건에 대 한 복제합니다. Adipogenic 및 osteogenic 조건, ~ 200, 000-225000 셀/잘 필요, chondrogenic 조건, 150000-175, 000 셀/잘 필요 합니다.
   참고: 우리는 N의 최소 실행 제어를 위한 3 복제 우물 = 고 2 독립의 총 실행 각 실험 혈통에 대 한 조건을 유도 (N = 총 6 복제).
2. PVAT 조상 세포 인구를 사용 하 여 셀 분리 솔루션 및 부 화 37 ° C, 5% CO₂ 별도 15 mL 원뿔 튜브로 5 분 풀 인구에 대 한 인간의 골 MSC 인구 세포 연결이 해제 됩니다. 500 x g 7 분 작은 셀에서 아래로 유리병을 회전 합니다. PBS의 1 mL에 resuspend를 사용 하는 hemocytometer 셀 번호를 예상.
3. 4.1 단계에서 표시 된 대로 셀 12 잘 요리에서 접시. 비 유도 상태 유발된 상황의 문화를 계속 방해 하지 않고 이전 시간에서 고정 될 수 있도록 유도 및 유도 비 adipogenic, osteogenic, 그리고 조건에 대 한 별도 요리를 제공 합니다.
4. 각 잘 유발 조건에 adipogenic 및 osteogenic 유도 미디어의 1.5 mL를 추가 합니다. 각 잘 유도 되지 않은 상태를 adipogenic 및 osteogenic 비 유도 미디어의 1.5 mL를 추가 합니다. Adipogenic 및 osteogenic 유도 및 비-유도 세포 인구 37 ° C, 5% CO₂의 부 화를 시작 합니다.
5. 500 x g7 분에 대 한 인간의 골 MSCs 및 인간 PVAT 조상 세포의 나머지 볼륨 아래로 회전 합니다.
6. 나머지 골 및 100, 000 셀/10 µ L (10⁶ 셀/mL)의 밀도 달성 하기 위해 펠 릿 PVAT 파생 셀 resuspend 하는 데 필요한 볼륨을 결정 합니다. Chondrogenic 계보 유도 MSC 성장 매체의 계산된 볼륨에 펠 릿을 resuspend. 부드럽게 위아래로 피펫으로 균일 분포를 사용 하 여 셀의 볼륨을 이동 합니다.
7. 각 잘 100, 000 셀의 micromass를 중심으로 집중된 셀 솔루션의 10 µ L 드롭릿 플라스틱. 증발을 방지 하기 위해 인접 한 잘에 살 균 H₂O의 1 mL를 배치 합니다. 2 h 37 ° C, 5% CO₂ 는 micromass를 허용에 대 한 micromass 문화를 품 어 집계에.
8. 2 시간 후, 신중 하 게 chondrogenic 차별화 미디어 10 ng/mL와 함께 아군을 추가 유발 조건 우물의 각 인간 TGFβ1. 신중 하 게 비 유도 조건 우물에 비 유도 미디어 (골 MSC 성장 미디어)의 1.5 mL를 추가 합니다. 유도 및 유도 비 조건에 대 한 별도 12-잘 접시를 사용 하 여 비 유도 조건 이전 시간에서 고정 될 수 있도록.

5. 프로토콜 4: 문화 Adipogenic, Osteogenic, 그리고 14 일에 대 한 Chondrogenic 계보

1. 37 ° C, 5% CO₂, 상쾌한 미디어 매 2 일에서 4 일 동안 모든 3 개의 계보의 유도 및 비 유도 조건 문화. 하루에 4, 분석 결과의 나머지 부분에 대 한 유지 보수 미디어 사용 유도 미디어에서 유도 adipogenic 계보 조건을 변경 합니다.
2. 12 헤 포 르 말린의 Dispose에 대 한 10% 포 르 말린에 비 유발 조건을 모두를 해결 하 고 세척 모든 고정 포 르 말린의 모든 흔적을 제거 하는 PBS에 2 x 우물. 처리까지 4 ° C에서 PBS에 접시 저장 합니다.
3. 14 일, 2 일 마다 미디어를 새로 고침의 총 유도 조건 문화. 10 ng/mL 최종 농도에서 각 새로 고침으로 chondrogenic 유도 미디어의 신선한 TGFβ1를 추가 합니다. Adipogenic 유지 보수 미디어와 osteogenic 혈통 유도 미디어, 2 일 마다 상쾌한 adipogenic 혈통 문화를 계속 합니다. 14 일에 얼룩에 대 한 10% 포 르 말린에 12 h에 대 한 모든 유도 조건 수정.
4. 긁어 또는 포함을 위한 카세트에 유도 chondrogenic 조건에는 micromass를 부 어. 5 분, 70%, 80%, 95%에서 두번 그리고 두번 절대 알코올에 더에서 시작 점점 더 집중된 알코올의 시리즈에서 micromass를 탈수. Dealcoholization 에이전트에 카세트를 놓고 마지막으로 파라핀 왁 스 단면 및 얼룩에 카세트를 포함 합니다.

6. 프로토콜 5: Adipogenic 상태 기름 얼룩 빨간 O

1. 100% 소 프로 파 놀의 100 ml에서 기름 빨간 O의 350 mg를 용 해 하 여 기름 빨간 O 재고 솔루션을 준비 합니다. 0.2 µ m 필터를 통해 저 어 바와 진공 2 h에 대 한 믹스. 재고 솔루션 1 년 동안 실 온에서 어둠 속에 저장할 수 있습니다.
2. 기름 빨간 O 3 부품 2 부품 diH₂0 재고 솔루션 (예: 60 mL 40 mL diH₂0 재고 솔루션)를 혼합 하 여 솔루션을 작업을 준비 합니다. 작업 솔루션에 기름 빨간 O의 최종 농도 2.1 mg/mL 이다.
3. 우물에서 모든 액체를 제거 합니다. 워시 60% 소 프로 파 놀, 완전히 우물의 측면에서 모든 물을 제거 있는지와 각 잘 2 배. 60% 소 프로 파 놀을 발음 하 고 신속 하 게 표지 하단에 우물의 벽을 건드리지 않고도 기름 빨간 O 작업 솔루션을 추가 합니다. 그래서 우물 건조 하지 않습니다이 단계를 신속 하 게 수행이 중요 하다.
4. 일단 기름 빨간 O 추가 되 면 부드러운 락으로 실 온에서 10 분 동안 품 어.
5. 모든 기름 빨간 O를 제거 하 고 즉시 증류수 H₂o. 세척 증류수 H₂O 10 m 언바운드 기름 빨간 o.를 제거 하기 시작을 위한 추가 10 분 후 기름 빨간 O 발음 하 고 세척 절차 3 반복 x.
6. 세척 완료 되 면, PBS를 추가 하 고 셀을 이미지. 4 ° c.에 PBS에 얼룩진된 셀 저장

7. 프로토콜 6: 얼룩 알리자린 레드 Osteogenic 조건

1. 각 우물에서 모든 액체를 제거 합니다. 각 잘 (12-잘 접시 잘 당 1.5 mL)을 2% 알리자린 레드 얼룩 솔루션의 적절 한 볼륨을 추가 하 고 솔루션은 완전히 우물의 바닥을 커버 때까지 부드럽게 접시 측면을 기울기.
2. 실 온에서 15 분 동안 품 어. 우물에서 알리자린 레드를 제거 합니다. 부드럽게 증류수 H₂O, 주의 하지 칼슘 결정을 꺼내 려 복용 4 시간 각각 잘 린스. 건조를 허용 합니다.

8. 7 프로토콜: Trichrome Masson의 Chondrogenic 상태를 얼룩

1. 구워 30 분 동안 60 ℃ 건조 오븐에서 슬라이드 증류수를 Deparaffinize 및 수화물 섹션.
   1. Dealcoholization 에이전트, 이어서 다음과 같이 알코올 농도 하강에 5 분 외피와 3 5 분 외피에 슬라이드 rehydrate, 장소: 100% (절대 에탄올) 2, 95% 알코올에 2, 2에서 80%, 70%, 2 개 그리고 마지막으로 두에 소 주 H₂H₂O Bouin의 정착 제를 준비 하는 동안 유지 수 O. 슬라이드.
2. (발견) 플라스틱 microwavable coplin jar에 Bouin의 정착 액의 장소 40 mL. 55 ° c 온도가지고 높은 전자 레인지 장소 슬라이드 20 분;에 대 한 열 솔루션 카운터에 하자 스탠드 커버. 실행 10 분 동안 또는 노란 색의 모두 사라질 때까지 수돗물에 씻어.
3. 10 분 동안 수돗물을 실행에 10 분 세척에 대 한 Weigert의 hematoxylin에 섹션을 얼룩.
4. 10 분 씻어 수돗물에 3 x 10 분에 대 한 Beibrich의 스 칼 렛 산 fuchsin 솔루션 섹션을 얼룩. 슬라이드 10 분 phosphotungstic/phosphomolybdic 산 성 솔루션에 반 린스 하지 않습니다.
5. 10 분 린스 수돗물에 2 개의 짧은 딥으로 아닐린 블루 솔루션에 직접 슬라이드를 배치 합니다.
6. 5.4 단계 및 합성 수 지로 산에서 1 분 장소 1 분 Dehydrate에 대 한 95% 에탄올에 대 한 수도 물에 3 ~ 5 분 세척에 대 한 1% 초 산 용액에 슬라이드를 놓습니다.

결과

인간 PVAT에서 stromal 혈관 분수의 절연

그림 1A 는 오름차순 대동맥 overlying PVAT 획득 했다 해 부 지역의 회로도 보여준다. 우리는 이전 관상동맥 바이패스 접목에서이 샘플은 파생된⁶받고 환자 인구를 설명 합니다. 그림 1B 수술 후 얻은 인간 PVAT의 예를 보여 줍니다. 그림 1C Masson의 Trichrome 얼룩으로 얼룩이 대표 PVAT 조직 섹션을 보여 줍니다. 그림 1D 차별화 이전 확장 단계 동안 PVAT 파생 stromal 세포의 인구를 보여...

토론

다른 플랫폼에서 많은 조상 세포 표현 형 및 차별화 잠재적인⁹에서 넓게 변화 한다. 3 다른 계보 다운 동시 유도 단일 환자 기증자에서 PVAT 파생 창시자 경작, osteogenic, adipogenic 그리고 chondrogenic,이 소설의 만능 용량 잘 제어 조사에 대 한 수 수 조상 세포의 인구입니다. 인간의 PVAT에서 조상 세포의 분화 능력을 테스트 하 고 PVAT pathologies 및 혈관 음색 통제에 그들의 기능을 이해 하는 것이 보고서에 설명 된 방법론을 사용할 수 있습니다. 이 방법의 몇 가지 장점은 단순 하 고 관상 동맥에서 기본 인간 조직의 사용 환자, 심한 심장 혈관 질병을 가진 환자에서 PVAT 조상 세포 기능 조사 활성화를 우회. 그러나, explants는 500 mg 조직에서에서 일반적으로 항복 < 1000 점착 세포 및 따라서이 접근에 1 개의 중요 한 경고를 강조는 적절 한 숫자를 5-7 구절을 필요. 트라이-혈통 차별화 실험의 성공을 위한 중요 한...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
동물성 성분이 없는 콜라겐 분해효소/디스파제 블렌드 I	Millipore-Sigma	SCR139	50mg
Alcian Blue	NewComerSupply	1003A	1% 수용액 pH 2.5
Alizarin Red	Amresco	9436-25G
alpha-MEM	ThermoFisher	12561056
Aniline Blue	NewComerSupply	10073C
항생제/항진균제	ThermoFisher	15240062
Beibrich's scarlet acid fuchsin	Millipore-Sigma	A3908-25G
b-글리세로인산	Millipore-Sigma	G9422-10G
Biebrich Scarlet	EKI	2248-25G
비오틴	Millipore-Sigma	B4501-100MG
Bouin의 고정액	NewComerSupply	1020A
소 혈청 알부민	Calbiochem	12659	4 °에 저장됨; C
세포 박리 용액	Accutase	AT104
Bell strainer (70 mm)	Corning	352350
Dexamethasone	Millipore-Sigma	D4902-100MG
DMEM	Corning	10-013-CV	4.5 g/L 포도당, L-glut 및 피루브산
DMEM/F12 매체	ThermoFisher	10565-042	고포도당, 글루타맥스, 나트륨 바이카르비네이
DMSO	Millipore-Sigma	D2650
태아 소 혈청	Atlanta Biologicals	S11550
FGF2	Peprotech	100-18B
포르말린	NewComerSupply	1090
젤라틴, 소 가죽	Millipore-Sigma	G9391-500G
Glutamax	ThermoFisher	35050061	글루타민 보충제
HBSS	Lonza	10-547F
IBMX	Millipore-Sigma	I5879-250MG
인슐린 용액	Millipore-Sigma	I9278-5ML
오일 레드 O	Millipore-Sigma	O0625-100G
판토텐산	Millipore-Sigma	P5155-100G
페니실린-스트렙토마이신 용액	ThermoFisher	15240062	100ml
Permount	Fisher	SP15-500
포스포텅스탄/포스포모이브딕산 용액	Millipore-Sigma	P4006-100G/221856-100G
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	배양 배지용 항균 시약.
Rosiglitazone	Millipore-Sigma	R2408-10MG
TGFb1	Peprotech	100-21
Weigert의 헤마톡실린	EKI	4880-100G