방법 논문

포유류 세포에서 미세 Coccal 뉴클레아제사용 염색질 면역침전 분석

DOI:

10.3791/59375

⸱

2019년 5월 10일

 , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Beckman Research Institute of City of Hope

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

크로마틴 면역 침전 (ChIP)은 유전자 조절의 분자 메커니즘을 이해하는 강력한 도구입니다. 그러나, 이 방법은 기계적 전단에 의한 재현가능한 크로마틴 단편화를 얻는 데 어려움을 수반한다. 여기서, 우리는 효소 소화를 사용하여 ChIP 분석에 대한 향상된 프로토콜을 제공한다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

유기체에서 세포 표현형을 표현하기 위해 살아있는 세포는 그에 따라 유전자 발현을 실행하고 전사 프로그램은 유전자 발현에서 중심적인 역할을 합니다. 세포 전사 기계 및 그것의 염색질 수정 단백질은 전사를 조절하기 위하여 조정합니다. 분자 수준에서 전사 조절을 분석하기 위해 전기 동이동성 이동, 과도 리포터 및 크로마틴 면역 침전(ChIP) 분석과 같은 여러 실험 방법을 사용할 수 있습니다. 우리는 이 문서에서 수정된 ChIP 분석법(ChIP) 분석법(ChIP)을 자세히 설명하며, 이는 히스톤 수정과 세포내 의 단백질과 DNA 간의 상호 작용을 직접 보여주는 이점 때문입니다. 성공적인 ChIP 분석의 주요 단계 중 하나는 염색질 전단입니다. 초음파 처리는 일반적으로 크로마틴 을 깎는 데 사용되지만 재현 가능한 조건을 식별하기는 어렵습니다. 초음파 처리에 의한 크로마틴 전단 대신, 우리는 더 재현 가능한 결과를 얻기 위해 소각뉴클레아제(MNase)를 사용하여 효소 소화를 활용했습니다. 이 문서에서는 MNase를 사용 하 여 간단한 ChIP 분석 프로토콜을 제공 합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

포유류 세포에서 유전자 발현은 단단하고 동적으로 조절되며, 전사는 주요 단계 중 하나입니다. 유전자 전사는 주로 전사 인자와 히스톤에 의해 조절됩니다. 전사 인자는 특정 DNA 서열에 결합하고 유전자 전사를 제어하는 단백질입니다. 이러한 인자는 유전체 DNA로부터 mRNA 합성을 템플릿으로 개시하는 RNA 폴리머라제 II(PolII)의 모집을 촉진하거나 억제한다1. 히스톤 변형은 히스톤 꼬리 잔기의 아세틸화 및 메틸화와 같은 염색질 구조를 변화시킴으로써 유전자 전사에긍정적이고 부정적인 영향을 미친다 2. 유전자 발현에 있는 변경이 세포 문맥에 영향을 미치기 때문에, 전사가 통제되는 분자 기계장치를 검토하는 것이 필수적입니다.

현재까지 유전자 전사의 조절을 조사하기 위한 여러 가지 방법이 있습니다. 겔 시프트 분석이라고도 하는 전기영동 이동성 시프트 분석(EMSA)은 단백질-DNA상호작용 3을 분석하는데 사용된다. 관심 있는 세포로부터의 핵 추출물은 방사성 동위원소(예를 들어, 32P)로 배양되고 폴리아크릴아미드 겔상에 DNA 프로브및 전기환동된다. 그것의 autoradiogram는 DNA 단백질 복합체가 젤에 있는 탐사기 보다는 더 느리게 이동한다는 것을 보여줍니다. 단백질에 대하여 항체의 존재에서, DNA 단백질 항체 복합체는 DNA 단백질 복합체 보다는 더 느리게 젤에서 이동합니다. 이 수퍼 시프트 밴드는 DNA와 단백질 사이의 특정 결합을 밝혀. 그러나, EMSA는 무세포 시스템에서 특정 DNA-단백질 상호작용을 결정하고, 따라서 상호작용이 살아있는 세포에서 전사를 제어하는지 여부는 알려지지 않았다. 일반적으로 루시퍼라제 리포터 분석이라고 불리는 일시적인 기자 분석은 세포에서 유전자 발현 조절을 해결하기 위해 개발되었습니다. 전형적으로, 관심 있는 유전자의 상류 게놈 영역은 리포터 플라스미드내로 삽입되고, 세포내로 과도하게 형질전환되고, 리포터 활성이 측정된다. 다양한 결실 돌연변이체는 유전자 조절을 담당하는 영역의 식별을 허용한다. 리포터 분석법은 전사 인자를 식별하고 전사를 제어하는 결합 DNA 서열을 식별하는 데 유용한 도구이지만,이 방법은 리포터 플라스미드가 염색질 구조가 없고 "실제"를 반영하지 않는다는 점에서 큰 단점이 있습니다. 전사 기계. 또한, 히스톤 수정의 변화는 시스템에 의해 결정될 수 없다.

염색질 면역침전(ChIP) 방법의 개발은 포름알데히드가 보존된 염색질 구조4,5를가진 "전체 세포" 고정이 잭슨과 Chalkley의 보고에 근거하였다. 그 이후로, 많은 관련 기술이 개발및 개선되었다6. ChIP 분석에서, 세포는 DNA와 단백질을 가교하기 위하여 포름알데히드로 고정됩니다. 염색질은 단편화되고 관심있는 항체로 면역 침전됩니다. 면역 복합체는 세척되고 DNA는 정제됩니다. 게놈의 특정 영역을 표적으로 하는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭은 게놈에 관심 있는 단백질의 점유를 제시합니다.

ChIP는 DNA를 가진 전사 인자 및 수정한 히스톤과 같은 단백질의 상호 작용을 확인하는 강력한 도구이지만, 이 방법은 실제로 염색질 단편화 단계와 같은 몇 가지 어려움을 수반합니다. 초음파 처리는 크로마틴을 깎는 데 널리 사용되었습니다. 그러나 재현 가능한 조건을 식별하는 것은 번거롭습니다. 마이크로코칼 뉴클레아제(MNase) 치료는 염색질 전단을 위한 대체 방법이다. MNase는 이중 가닥, 단일 가닥, 원형 및 선형 DNA 및 RNA를 소화하는 내분과 핵산입니다. 최적의 크로마틴 단편화를 위해 염색질과 효소의 양, 온도 및 배양 시간을 포함하여 조건을 결정하는 것이 비교적 쉽습니다. 기존 프로토콜을 수정하고 단순화했으며 간단하고 재현 가능한 방법을 수립했습니다. 본 논문은 포유류 세포에서 MNase를 사용하여 ChIP 분석에 대한 프로토콜을 제공한다.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 시약의 준비

  1. 18.5% 파라포름알데히드(PFA) 용액을 만드십시오. PFA 0.925 g, 물 4.8 mL (프로토콜 전반에 걸쳐 초정화 된 물 사용) 및 50 mL 원엽 플라스틱 튜브에 1 M KOH의 35 μL을 추가하십시오. 캡을 단단히 닫고 전자 레인지를 사용하여 약 200 mL의 물을 포함하는 400-600 mL 유리 비커로 튜브를 가열하십시오. 물이 끓기 시작하기 전에 튜브를 제거하고 PFA를 용해시키기 위해 튜브를 소용돌이. PFA가 실온으로 식히고 얼음위에 보관하십시오.
    참고: PFA가 완전히 녹을 때까지 가열및 혼합을 반복합니다. 가교 직전에 PFA 용액을 준비합니다(단계 2.1.3).
  2. 1.25 M 글리신 용액을 만드십시오. 150 mL의 물에 글리신 14.07 g을 용해시키고 0.22 μm 공극 크기의 필터를 통해 여과하십시오. 4 °C에서 보관하십시오.
  3. ChIP 세포 를 포염 버퍼로 만듭니다. 378 mg의 PIPES, 10.6 mKCl 의 10.6 mL, 그리고 1.25 g의 분기 옥틸페녹시 폴리 (에틸렌옥시)에탄올을 물에 녹입니다. 4°C에서 1M KOH로 pH를 8.0으로 조정하고 최대 250 mL를 만듭니다. 0.22 μm 의 기공 크기 필터를 통해 걸러내고 4°C에서 보관하십시오.
  4. 마이크로코칼 뉴클레아제(MNase) 소화 완충액을 만드십시오. 1 mL을 만들려면 0.1 mL의 MNase 소화 버퍼, 100x BSA 용액 의 10 μL, 0.1 M 디티오트라이톨 10 μL 및 0.88 mL의 물을 섞습니다.
  5. 1 M NaHCO3을확인합니다. 50 mL의 물에 NaHCO3 의 4.2 g을 용해시키고 0.22 μm 공극 크기의 필터를 통해 여과하십시오. 실온에서 보관하십시오.
  6. 10% 도데실 황산나트륨(SDS)을 만드세요. 50 mL의 물에 SDS 5 g을 녹입니다. 실온에서 보관하십시오.
  7. 용출 버퍼를 만듭니다. 1M NaHCO3,10% SDS 의 15 μL, 120 μL의 물을 혼합하여 1개의 샘플에 대해 150 μL의 용출 버퍼를 얻습니다.
    참고: 샘플 수에 따라 부피를 비례적으로 늘립니다.
  8. 3M 아세테이트 나트륨(pH 5.2) 용액을 만드십시오. 물에 아세테이트 나트륨 24.6 g을 용해. 아세트산으로 pH를 5.2로 조정하고 100 mL를 구성하십시오. 0.22 μm 의 공극 크기 필터를 통해 걸러내고 실온에서 보관하십시오.

2. MNase 소화 조건의 결정

참고: 프로토콜의 2단계에서, VCaP를 이용한 예는, 인간 전립선암 세포가 제시된다. 임의의 포유류 세포주를 사용할 수 있다; 단계의 참고를 참조하십시오.

  1. 가교 크로마틴의 준비
    1. 이산화탄소 인큐베이터에서 37°C에서 10% 태아 소 혈청(FBS)으로 보충된 DME 고포도당에서 VCaP 세포를 유지합니다. 종자 VCaP 세포를 4 x 106 세포에서 6 cm 접시에서 4 mL의 배양 배지 및 배양3일 동안 배양하였다.
      참고: 각 세포주마다 적절한 배양 배지를 사용하십시오. 최대 10 x 106 세포는 6cm 또는 10cm 접시에 씨를 뿌수 있습니다. 부유 한 세포의 경우 T25 플라스크의 종자 세포. 접시 또는 플라스크의 수는 MNase 소화에 대 한 테스트 얼마나 많은 복용량에 따라 달라 집니다. 4 회 분량을 테스트하면 6 가지 요리 또는 플라스크를 준비하십시오. 2.2단계를 참조하십시오.
    2. 트립신을 사용하여 한 접시에서 VCaP 세포를 분리하고 세포를 계산합니다. 한 접시에 셀 번호를 계산합니다. 부유 세포의 경우, 하나의 플라스크에서 소량의 세포 현탁액을 제거하고 셀 번호를 계산합니다.
    3. 18.5% PFA의 0.229 mL를 4 mL의 배양 배지에 6 cm 접시에 1%의 최종 농도로 첨가한다. 부드럽게 하지만 철저 하 게 접시 또는 플라스크 를 소용돌이 PFA를 균등 하 게 배포. 정확히 10 분 동안 실온에서 배양하십시오.
      참고: 이 단계에서는 염색질과 단백질이 가교됩니다. PFA는 독성이 있기 때문에 화학 연기 후드에서이 단계를 수행하고 적절한 개인 보호 장비를 사용하십시오.
    4. 10분 후, 125 mM의 최종 농도에서 1.25 M 글리신 용액의 0.47 mL를 추가하십시오. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
      참고: 글리신은 추가 가교를 중지하기 위해 과잉 PFA를 중화.
    5. 포름알데히드/글리신/배양 배지 흡입. 인산완식염(PBS)의 4mL를 두 번 첨가하여 세포를 세척한다. 부유 세포의 경우, 실온에서 5분 동안 300 x g에서 15 mL 원엽 튜브및 원심분리기로 세포 현탁액을 옮긴다. 상급을 흡인하고 PBS의 하나의 중간 볼륨을 추가하고 완전히 일시 중단합니다. 이 단계를 반복합니다. 포름알데히드가 포함되어 있기 때문에 액체 폐기물을 적절하게 폐기하십시오.
    6. 프로테아제 및 인산염 억제제 칵테일(PIC)을 함유하는 PBS를 PBS에 100x PIC의 1/100 부피를 첨가하여 준비합니다. 접시에서 PBS를 흡인하고 PIC를 포함하는 PBS의 접시 당 1 mL을 추가합니다. 세포를 긁어 내고 세포 현탁액을 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮김을 옮김. 부유 된 세포의 경우, 단순히 1.5 mL 튜브에 현탁액을 전송합니다.
    7. 세포 펠릿을 회수하기 위해 실온에서 5 분 동안 3,000 x g의 원심 분리튜브. 파이펫을 사용하여 PBS를 완전히 제거합니다. 튜브당 세포 수를 기록하고 세포 펠릿을 -80°C에 저장합니다.
  2. 세포 포염 및 MNase 소화
    참고: 다음 단계의 시약 부피는 6 x 106 세포를 포함하는 하나의 튜브를 기반으로 한다. 세포 수에 따라 시약 부피를 비례적으로 조정합니다. 한 튜브에 2 x 106 세포가 포함되어 있는 경우, 100 μL의 ChIP 세포 용해 버퍼(단계 2.2.1), MNase 소화 버퍼(단계 2.2.3), 및 ChIP 희석 버퍼(단계 2.2.5), 및 0.5 M EDTA(pH 8.0)의 10 μL(2.2.4 단계)을 사용한다.
    1. 얼음상에서 2.1.7단계에서 제조된 저장된 세포 펠릿(VCaP 세포, 튜브당 6 x 106세포 함유)을 해동한다. 버퍼에 100x PIC의 1/100 볼륨을 추가하여 PIC로 보충된 ChIP 세포 용해 버퍼를 준비합니다. PIC로 보충된 ChIP 세포 용해 완충제 300 μL을 추가하고 펠릿을 완전히 다시 놓습니다. 15 s의 튜브를 소용돌이시키고 10 분 동안 얼음에 현탁액을 배양합니다.
    2. 9,000 x g에서 4°C에서 3분 동안 원심분리기를 제거하고 상급체를 완전히 제거한다. MNase 소화 완충제의 300 μL에 펠릿을 다시 중단.
    3. MNase (2,000 젤 단위 / μL)를 MNase 소화 완충액으로 희석하여 50 겔 단위 / μL을 제공합니다. 0, 0.5, 1, 2, 4 μL의 50 젤 단위 / μL을 현탁액에 넣고 정확히 10 분 동안 37 °C에서 배양하고 2.5 분마다 반전하여 혼합합니다.
      참고: 표 1은 여러 세포주에서 최적의 MNase 양을 나타낸다.
    4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)의 30 μL을 추가하여 MNase 소화와 소용돌이를 간단히 종료합니다. 얼음에 5 분 동안 배양. 9,000 x g에서 4°C에서 5분 간 원심분리기를 제거하고 상급체를 완전히 제거한다.
    5. 버퍼에 100x PIC의 1/100 부피를 추가하여 PIC로 보충된 ChIP 희석 버퍼를 준비합니다. PIC로 보충된 ChIP 희석 완충제의 300 μL에서 펠릿을 다시 중단시켰다.
    6. 마이크로팁 프로브가 장착된 초음파 처리기로 얼음의 현탁액을 초음파 처리합니다. 진폭 2, 처리 시간 15 초, 펄스 ON 5 초, 펄스 OFF 30 초 : 다음과 같은 초음파 조건을 사용합니다. 현탁액 1 μL을 가지고 슬라이드 유리에 발견하고 현미경을 사용하여 관찰하십시오. 셀 구조가 거의 손상되었는지 확인합니다.
      참고: 도 1A는 초음파 처리 전후에 VCaP 세포 현탁액의 대표적인 마이크로사진을 나타낸다. 이 단계는 핵 막을 파괴하여 상류로 소화 된 염색을 방출하기위한 것입니다. 전원 설정은 최대 전력의 5% 미만으로 조정해야 하며 30초 간격을 초과하여 5초 3회 초음파 처리를 시도해야 합니다. 와트 제어가 가능한 경우, 전력 설정을 5W로 조정하고 위에서 언급한 총 15s의 샘플을 처리하여 총 70-75 J. 위에서 언급한 대로 셀 구조가 파손되었는지 확인합니다. 충분하지 않은 경우 한 번 더 반복합니다. 전술한 조건은 시험된 모든 세포주에 실질적으로 적용된다.
    7. 4°C에서 10분 동안 9,000 x g의 원심분리기를, 상급체를 새로운 1.5 mL 미세원지 튜브로 옮기고, 2.3단계에서 소화된 염색질 20 μL을 저장한다. 나머지는 -80°C에 보관하십시오.
  3. 역가교, DNA 정화, 소화된 염색질 분석
    1. 75 μL의 물, 5 M NaCl의 4 μL, 1.5 mL 나사 튜브에 단백질 나사 K 1 μL을 추가합니다. 2.2.7단계에서 제조된 다양한 MNase 소화 조건에서 20 μL의 소화된 염색질을 물, NaCl 및 단백질분해제가 함유된 튜브에 넣고 캡을 단단히 닫고 완전히 혼합하고 밤새 65°C에서 튜브를 배양합니다.
      참고: 이 단계는 단백질과 DNA 사이 가교의 제거를 위한 것입니다.
    2. 조건당 2개의 1.5-mL 미세원원지 튜브를 준비합니다. 페놀 100 μL:클로로포름:이소아밀알콜(25:24:1) (PCI) 1.5 mL 튜브 1개에 추가합니다. 아세테이트 나트륨 3m(pH 5.2)와 글리코겐 2 μL 10 μL을 다른 튜브에 추가합니다.
      참고: 클로로폼 : 이소아밀 알코올의 사용은 필요하지 않습니다7. 부피 증가는 에탄올 강수 후 낮은DNA 회복을 초래할 수 있습니다 8.
    3. 2.3.1단계에서 소화된 염색질이 함유된 튜브를 잠시 원심분리하고 100 μL의 PCI를 추가한다. 캡을 단단히 닫고 와류를 힘차게 하여 에멀젼을 형성합니다. 실온에서 30초 동안 튜브를 최대 속도(예: 20,000 x g)로 원심분리합니다.
    4. DNA를 함유하는 상부상을 조심스럽게 취하고 2.3.2단계에서 제조된 PCI를 함유하는 튜브에 첨가한다. 소용돌이는 2.3.3 단계로 튜브를 힘차게 원심분리한다.
      참고: 하부 상이 오염되면 튜브를 다시 원심 분리하거나 하부의 대부분을 먼저 제거하고 튜브를 원심 분리하고 상부 상을 취하십시오.
    5. 단계 2.3.4에 기재된 대로 상반위를 조심스럽게 취하고 2.3.2단계에서 제조된 아세테이트 나트륨 및 글리코겐을 함유하는 튜브에 첨가한다. 에탄올 250 μL을 추가합니다. 반전으로 섞고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 튜브를 최대 속도(예: 20,000 x g)에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다.
      참고: 실온에서 용액의 배양은 DNA회복에영향을 미치지 않는다 8,9.
    6. 튜브 바닥에 있는 펠릿을 확인합니다. 펠렛을 방해하지 않도록 상급자를 조심스럽게 제거하고 70 % 에탄올 500 μL을 추가하십시오. 튜브를 최대 속도(예: 20,000 x g)에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
    7. 상급체를 완전히 제거하고 펠릿을 실온에서 약 5분 동안 건조시고 말립니다. 10 mM 트리스의 20 μL에 펠릿을 용해 · HCl/1 mM EDTA (pH 8.0) (TE). UV 분광광도계를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다.
    8. 0.5 μg의 DNA를 젤 로딩 염료와 혼합하고 2% 아가로즈 겔에 바하십시오. 전기포어는 트리스-아세테이트-EDTA 완충제에서 100V에서 샘플을 보라색 염료가 겔의 2/3로 이동하고 0.5 μg/mL 에티듐 브로마이드로 젤을 10분 동안 염색한다. 젤사진을 찍습니다.
      참고: 자세한 내용은 그림 2를 참조하십시오.

3. 크로마틴면역 침전

  1. 소화 된 염색질의 준비
    1. 셀을 준비합니다. 부착 세포의 경우, 처리 그룹 당 2 접시 (6cm 또는 10cm)에 접시 당 2-10 x 106 세포를 시드하고 세포가 1 일 이상 접시바닥에 부착 되도록합니다. 부유 세포의 경우, 치료 군당 2T25 플라스크의 씨앗. 원하는 대로 세포를 치료하십시오.
    2. 각 그룹에서 한 접시 또는 플라스크를 취하고 단계 2.1.2에 설명된 대로 셀 번호를 계산합니다. 단계 2.1.3-2.1.7에서 언급 한 대로 가교 크로마틴을 준비하십시오.
    3. 단계 2.2.1-2.2.7에 기재된 바와 같이 세포 펠릿 및 MNase 소화를 라이즈. 2단계에서 결정된 대로 염색질을 소화하기 위해 최적의 MNase 양을 사용하십시오. 소화된 염색질을 -80°C에서 보관하십시오.
    4. 역방향 크로스링크 20 μL의 소화된 염색질 및 2.3.8단계에서 기재된 바와 같이 DNA를 정제한다. 단계 2.3.7에 기재된 바와 같이 DNA 농도를 측정한다. 2.3단계에서 언급한 바와 같이 소화된 염색질의 크기를 확인하기 위해 2% 아가로즈 겔에서 샘플을 전기포어.
      참고: DNA 농도는 3.1.3단계에서 제조된 저장된 소화염색질과 동일하다.
    5. 3.1.4단계에서 역가교 로 연결된 소화 된 염색질 샘플을 희석하여 물로 10 ng / μL을 주고 연속적으로 희석하여 1, 0.1 및 0.01 ng / μL의 농도를 만듭니다.-20 °C에서 저장하십시오.
      참고: 이러한 샘플은 실시간 PCR 표준에 사용됩니다.
  2. 면역 침전
    참고: 프로토콜의 3.2-3.5 단계에서, VCaP 세포에서 항 다듬된 히스톤 H3 리신 4 (H3K4me3) 점유율이 결정됩니다. 그림 3을참조하십시오.
    1. 3.1.3 단계에서 소화 된 염색체를 해동하십시오. 모든 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
    2. 버퍼에 100x PIC의 1/100 부피를 추가하여 PIC로 보충된 ChIP 희석 버퍼를 준비합니다. 소화된 염색질을 5 μg/500 μL로 희석하고 PIC로 보충한 ChIP 희석 완충제를 함유합니다. H3K4me3을 사용하면 1,000 μL+ 비면역 IgG(제어 IgG), (2) IP를 갖춘 (1) IP에 대해 추가 로 준비하십시오.
    3. 입력 샘플(1IP의 1%)으로 1.5 mL 나사 튜브에 5 μl의 5 μl/500 μL 소화된 크로마틴을 추가합니다. 샘플을 -80°C에 보관합니다.
    4. IP 샘플로 1.5 mL 나사 튜브에 5 μg/500 μL 소화 된 염색질 각각 500 μL을 추가하십시오. 튜브에 2 μg의 항체를 추가합니다. 뚜껑을 닫고 흔들 플랫폼을 사용하여 부드러운 혼합으로 밤새 4 °C에서 튜브를 배양합니다.
      참고: 최적의 항체 양은 경험적으로 결정되어야하지만, IP 당 2 μg는 처음에 권장됩니다.
    5. IP당 ChIP 등급 단백질 G 자기 비드 30 μL을 추가합니다. 4 °C에서 튜브를 2 시간 동안 배양하고 흔들 플랫폼을 사용하여 부드러운 혼합을합니다.
      참고: 자기 비드의 사전 세척은 필요하지 않습니다.
  3. 면역 복합체 세척 및 후진 가교
    1. 3.2.5 단계에서 튜브를 짧게 회전시면 됩니다. 튜브를 네오디늄 자석이 들어있는 폴리에틸렌 랙에 1 분 동안 놓습니다.
    2. 낮은 소금 면역 복합 세척 버퍼의 튜브 당 0.5 mL를 추가합니다. 튜브를 부드럽게 두드리거나 짧게 소용돌이쳐 구슬을 분산시입니다. 4 °C에서 튜브를 5 분 동안 배양하고 흔들 플랫폼을 사용하여 부드러운 혼합을합니다. 5분 후, 3.3.1단계를 반복합니다.
    3. 튜브 당 0.5 mL의 높은 염분 면역 복합 세척 버퍼를 추가합니다. 3.3.2 단계로 구슬을 분산하고 세척하십시오. 세탁 후 3.3.1 단계를 반복하십시오.
    4. 튜브 당 LiCl 면역 복합 세척 버퍼 0.5 mL를 추가합니다. 3.3.2 단계로 구슬을 분산하고 세척하십시오. 세탁 후 3.3.1 단계를 반복하십시오.
    5. 튜브를 자기 랙에 1분 동안 놓습니다.
    6. 튜브에 용출 버퍼 150 μL을 추가합니다. 튜브를 소용돌이로 하여 구슬을 완전히 분산시다. 캡을 닫고 튜브를 65°C에서 30분 동안 배양하고, 5분마다 반전또는 소용돌이로 혼합하여 구슬을 철저히 분산시다.
    7. 배양 동안, 1.5 mL 나사 튜브를 준비하고 3.2.3 단계에서 제조된 1% 입력 샘플의 5 M NaCl 및 2 μL의 단백질ADK. 해동 1% 입력 샘플을 추가한다. 용출 완충제 150 μL, 6 μL 의 5 M NaCl 및 2 μL의 단백질아제 K를 1% 입력 샘플에 추가합니다.
    8. 배양 후 튜브를 스핀 다운합니다. 튜브를 자기 랙에 1분 동안 놓고 3.3.7단계에서 제조된 NaCl 및 proteinase K를 함유하는 나사관으로 상급체를 옮김을 옮김을 전달한다.
    9. 캡과 소용돌이 모든 IP 및 입력 샘플을 완전히 혼합닫습니다. 튜브를 65°C에서 밤새 배양합니다.
  4. DNA 정화
    1. 2.3.2에 설명된 대로 튜브를 준비하고 100 μL 대신 150 μL의 PCI를 추가합니다. 다른 튜브에 3 M 아세테이트 나트륨 (pH 5.2)의 12 μL과 글리코겐 2 μL을 추가합니다.
    2. 인큐베이터에서 튜브를 제거합니다. 튜브를 스핀다운하고 PCI 150 μL을 추가합니다.
    3. 와류는 튜브를 힘차게 에멀젼을 형성한다. 실온에서 30초 동안 튜브를 최대 속도(예: 20,000 x g)로 원심분리합니다.
    4. 3.4.1단계에서 제조된 PCI를 함유하는 튜브에 상부상 140 μL을 조심스럽게 이송한다. 3.4.3 단계를 반복합니다.
      참고: 2.3.4단계의 참고 사항도 참조하십시오.
    5. 3.4.1단계에서 제조된 아세테이트 나트륨 및 글리코겐을 함유하는 튜브에 상부상 120 μL을 조심스럽게 이송하였다.
      참고: 2.3.4단계의 참고 사항도 참조하십시오.
    6. 에탄올 300 μL을 추가합니다. 반전으로 섞고 실온에서 10분 동안 배양합니다.
    7. 튜브를 최대 속도(예: 20,000 x g)에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다. 2.3.6단계에서 설명한 대로 펠릿을 세척한다.
    8. 2.3.7단계에서 설명한 바와 같이 펠렛을 건조한 후, 펠렛을 50 μL의 TE로 용해시켰다. -20 °C에서 보관하십시오.
  5. 실시간 PCR을 사용한 DNA 단편 검출
    1. 다음 샘플을 해동: (1) 제어 IgG와 IP, (2) 안티 H3K4me3와 IP, (3) 1% 입력 샘플. 또한 3.1.5단계(총 7개의 샘플)에서 제조된 표준의 4회 분량을 해동한다.
      참고: 입력 및 IP 샘플에서 DNA 양을 정량화하기 위해 동일한 그룹의 표준을 사용합니다.
    2. 8개의 샘플에 대한 PCR 작업 솔루션을 만드십시오. 40 μL의 2x 실시간 PCR 슈퍼믹스, 8 μL 의 4 μM 전진 및 역프라이머, 8 μL의 물을 혼합합니다.
      참고: 하나의 PCR 반응 혼합물에는 2x 실시간 PCR 슈퍼믹스 5 μL, 4 μM 전진 및 역프라이머 각각 1 μL, 1 μL의 물이 포함되어 있습니다. 프라이머 서열은 표2에 나열되어 있습니다.
    3. PCR 작동 솔루션의 8 μL을 PCR 플레이트의 하나의 웰에 Aliquot. 3.4.8 단계에서 2 μL의 샘플을 추가하거나 3.1.5 단계에서 표준을 추가하십시오.
    4. PCR 플레이트를 밀봉하고 다음 조건을 사용하여 PCR을 실행: 1) 초기 변성 3 분 동안 95 °C, 2) 변성 10 s에 대한 95 °C, 3) 56 °C 어닐링, 4) 확장 및 데이터 수집을위한 30 초에 대한 72 °C , 55 주기 동안 2) ~ 4) 단계를 반복합니다. 사이클링 후 PCR 제품의 용융 곡선을 측정합니다. 데이터를 분석합니다.
      참고: 그림 3에 대한 원시 데이터는 표3에 나와 있습니다. 표준 곡선을 사용하여 샘플의 시작 수량(SQ)을 계산합니다. SQ를 1% 입력에 100으로 곱하여 1% 입력 샘플의 SQ를 하나의 IP로 조정하여 입력에서 조정된 SQ를 제공합니다(Eq. 1). IP 샘플에서 SQ를 입력에서 조정된 SQ로 나누어 % 입력 값(퍼센트 입력 방법, Eq. 2)을 부여합니다. 접기 농축을 계산하려면 Ip에서 SQ를 안티 H3K4me3으로 IP를 제어 IgG(접이식 농축 방법, Eq. 3)가 있는 IP의 SQ로 나눕니다.
      조정된 SQ 입력 = (1% 입력의 SQ) x 100 (1)
      H3K4me3 = 100 x의 백분율 입력 (안티 H3K4me3IP의 SQ) / (입력에서 조정 된 SQ) (2)
      H3K4me3 = (안티 H3K4me3IP의 SQ) / (제어 IgGIPIP의 SQ) (3)

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결과

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염색질은 ChIP 분석법의 중요한 단계 중 하나입니다. 우리는 MNase를 사용하여 크로마틴을 소화하여 뉴클레오좀 올리고머의 혼합물을 얻었습니다. MNase 소화 단계에서, MNase 는 핵 막을 통과하고 염색질을 소화 할 수 있습니다. 그러나, 소화된 염색질은 막을 통과할 수 없고 핵에 남아 있습니다. 핵에서 소화 된 염색체를 방출하려면 간단한 초음파 처리가 필요합니다. 그림 1A는 VCaP 세포 현탁액의 초음파 처리 전후의 마이크로사진을 나타낸다. 초음파 처리없이 세포 구조는 그대로 유지되어 염색질이 핵에 존재한다는 것을 나타냅니다. 짧은 초음파 처리는 세포 구조를 깨고 마이크로 사진에서 세포를 검사하면 간단한 초음파 상태를 결정하는 데 도움이됩니다. 우리는 또한 293T 세포에서 간단한 초음파 처리에 대한 다른 예를 나타냈다 (그림1B)인간 B 세포 급성 림프 구성 백혈병 세포주, REH 세포 (도

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토론

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초음파 처리는 일반적으로 조각난 염색체를 얻기 위하여 사용되지만, 재현 가능한 조건을 확인하기 위하여 시간이 많이 걸리고 성가신 입니다. 이 프로토콜에서는 효소 소화가 재현 가능한 조건을 식별하는 것이 더 쉬워야 하기 때문에 MNase 소화를 사용했습니다. MNase 소화 후 간단한 초음파 처리 단계 (단계 참조 2.2) 세포 막을 휴식 하 고 소화 된 염색질을 해제 하는 데 필요한. 따라서 프로토콜의 초음파 처리 전력은 가능한 한 낮아야합니다. 우리는 우리가 채택한 모든 세포에 대해 동일한 초음파 처리 조건을 사용합니다(그림 1 및 표 1참조)는 멤브레인의 완전한 분해를 얻습니다.

MNase에 의한 염색질 의 소화는 우리의 프로토콜에서 중요한 단계이며, 따라서 우리는 세포 내부의 염색질 의 소화조건을 최적화하기 위해 많은 노력을 기울였습니다. 소화 활성은 효소 및 기질(크로마틴) 및 배양 시간의...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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이 연구는 희망의 도시에 제넨테크 로열티에 의해 지원됩니다. 이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 전체 또는 부분적으로 지원 되지 않습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.5 M EDTA (pH 8.0)Thermo ScientificAM9010
2 M KClThermo ScientificAM9010
2x iQ SYBR Green supermixBio-Rad1706862
5 M NaClThermo ScientificAM9010
50 bp DNA ladderNew England BiolabsN3236S
AgaroseResearch Product InternationalA20090
분지 옥틸페녹시 폴리(에틸렌옥시)에탄올밀리포어 시그마I8896IGEPAL CA-630
ChIP 등급 단백질 G 마그네틱 비드세포 신호 기술9006S
크로마틴 면역침전(ChIP) 희석 버퍼Millipore Sigma20-153버퍼 구성: 0.01% SDS, 1.1% 트리톤 X-100, 1.2mM EDTA, 16.7mM 트리스-HCl, pH 8.1, 167mM 염화나트륨
Gel Loading Dye Purple (6x)New England BiolabsB7024S
GlycineBio-Rad161-0724전기영환 등급
글리코겐MilliporeSigma G176719-22 mg/mL
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)Thermo Scientific78445
High Salt Immune Complex Wash BufferMillipore Sigma20-155버퍼 구성 : 0.1 % SDS, 1 % 트리톤 X-100, 2 mM EDTA, 20 mM 트리스 -HCl, pH 8.1, 500 mM NaCl.
히스톤 H3K4me3 항체 (pAb)Active Motif39915
LiCl 면역 복합체 세척 버퍼Millipore Sigma20-156버퍼 조성 : 0.25 M LiCl, 1 % IGEPAL CA630, 1 % deoxycholic acid (sodium salt), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8.1.
저염 면역 복합체 세척 버퍼Millipore Sigma20-154버퍼 구성 : 0.1 % SDS, 1 % Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 150 mM NaCl.
Magna GrIP Rack (8 well)Millipore Sigma20-4001.5 mL 튜브와 호환되는 모든 종류의 자기 분리 스탠드는 괜찮습니다.
Micrococcal nucleaseNew England BiolabsM0247S는 10x 완충액 (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, 25°C에서 pH 7.9; C) 및 100x BSA (10 mg/mL)
NaHCO3JT Baker3506-01
Normal rabbit IgGMillipore Sigma12-370
PIPESMillipore SigmaP6757
Proteinase KMillipore Sigma3115887001
Real-time PCR systemBio-RadCFX96, C1000
RNA pol II CTD phospho Ser5 항체Active Motif39749
SDSBoehringer Mannheim100155전기폐전도 등급
아세트산 나트륨Millipore SigmaS5636
마이크로팁 프로브QSONICAQ700발생기 1.5mL 튜브와 호환되는 모든 종류의 초음파 발생기는 괜찮습니다.
초순수 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 (25:24:1, V/V)Thermo Scientific15593031pH 8.05
이 장착된 초음파

참고문헌

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