크로마틴 면역 침전 (ChIP)은 유전자 조절의 분자 메커니즘을 이해하는 강력한 도구입니다. 그러나, 이 방법은 기계적 전단에 의한 재현가능한 크로마틴 단편화를 얻는 데 어려움을 수반한다. 여기서, 우리는 효소 소화를 사용하여 ChIP 분석에 대한 향상된 프로토콜을 제공한다.
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이 논문에서
요약
초록
유기체에서 세포 표현형을 표현하기 위해 살아있는 세포는 그에 따라 유전자 발현을 실행하고 전사 프로그램은 유전자 발현에서 중심적인 역할을 합니다. 세포 전사 기계 및 그것의 염색질 수정 단백질은 전사를 조절하기 위하여 조정합니다. 분자 수준에서 전사 조절을 분석하기 위해 전기 동이동성 이동, 과도 리포터 및 크로마틴 면역 침전(ChIP) 분석과 같은 여러 실험 방법을 사용할 수 있습니다. 우리는 이 문서에서 수정된 ChIP 분석법(ChIP) 분석법(ChIP)을 자세히 설명하며, 이는 히스톤 수정과 세포내 의 단백질과 DNA 간의 상호 작용을 직접 보여주는 이점 때문입니다. 성공적인 ChIP 분석의 주요 단계 중 하나는 염색질 전단입니다. 초음파 처리는 일반적으로 크로마틴 을 깎는 데 사용되지만 재현 가능한 조건을 식별하기는 어렵습니다. 초음파 처리에 의한 크로마틴 전단 대신, 우리는 더 재현 가능한 결과를 얻기 위해 소각뉴클레아제(MNase)를 사용하여 효소 소화를 활용했습니다. 이 문서에서는 MNase를 사용 하 여 간단한 ChIP 분석 프로토콜을 제공 합니다.
서론
포유류 세포에서 유전자 발현은 단단하고 동적으로 조절되며, 전사는 주요 단계 중 하나입니다. 유전자 전사는 주로 전사 인자와 히스톤에 의해 조절됩니다. 전사 인자는 특정 DNA 서열에 결합하고 유전자 전사를 제어하는 단백질입니다. 이러한 인자는 유전체 DNA로부터 mRNA 합성을 템플릿으로 개시하는 RNA 폴리머라제 II(PolII)의 모집을 촉진하거나 억제한다1. 히스톤 변형은 히스톤 꼬리 잔기의 아세틸화 및 메틸화와 같은 염색질 구조를 변화시킴으로써 유전자 전사에긍정적이고 부정적인 영향을 미친다 2. 유전자 발현에 있는 변경이 세포 문맥에 영향을 미치기 때문에, 전사가 통제되는 분자 기계장치를 검토하는 것이 필수적입니다.
현재까지 유전자 전사의 조절을 조사하기 위한 여러 가지 방법이 있습니다. 겔 시프트 분석이라고도 하는 전기영동 이동성 시프트 분석(EMSA)은 단백질-DNA상호작용 3을 분석하는데 사용된다. 관심 있는 세포로부터의 핵 추출물은 방사성 동위원소(예를 들어, 32P)로 배양되고 폴리아크릴아미드 겔상에 DNA 프로브및 전기환동된다. 그것의 autoradiogram는 DNA 단백질....
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프로토콜
1. 시약의 준비
- 18.5% 파라포름알데히드(PFA) 용액을 만드십시오. PFA 0.925 g, 물 4.8 mL (프로토콜 전반에 걸쳐 초정화 된 물 사용) 및 50 mL 원엽 플라스틱 튜브에 1 M KOH의 35 μL을 추가하십시오. 캡을 단단히 닫고 전자 레인지를 사용하여 약 200 mL의 물을 포함하는 400-600 mL 유리 비커로 튜브를 가열하십시오. 물이 끓기 시작하기 전에 튜브를 제거하고 PFA를 용해시키기 위해 튜브를 소용돌이. PFA가 실온으로 식히고 얼음위에 보관하십시오.
참고: PFA가 완전히 녹을 때까지 가열및 혼합을 반복합니다. 가교 직전에 PFA 용액을 준비합니다(단계 2.1.3). - 1.25 M 글리신 용액을 만드십시오. 150 mL의 물에 글리신 14.07 g을 용해시키고 0.22 μm 공극 크기의 필터를 통해 여과하십시오. 4 °C에서 보관하십시오.
- ChIP 세포 를 포염 버퍼로 만듭니다. 378 mg의 PIPES, 10.6 mKCl 의 10.6 mL, 그리고 1.25 g의 분기 옥틸페녹시 폴리 (에틸렌옥시)에탄올을 물에 녹입니다. 4°C에서 1M KOH로 pH를 8.0으로 조정하고 최대 250 mL를 만듭니다. 0.22 μm 의 기공 크기 필터를 통해 걸러내고 4°C에서 보....
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결과
염색질은 ChIP 분석법의 중요한 단계 중 하나입니다. 우리는 MNase를 사용하여 크로마틴을 소화하여 뉴클레오좀 올리고머의 혼합물을 얻었습니다. MNase 소화 단계에서, MNase 는 핵 막을 통과하고 염색질을 소화 할 수 있습니다. 그러나, 소화된 염색질은 막을 통과할 수 없고 핵에 남아 있습니다. 핵에서 소화 된 염색체를 방출하려면 간단한 초음파 처리가 필요합니다. 그림 1A는 VCaP 세포 현탁액의 초음파 처리 전후의 마이크로사진을 나타낸다. 초음파 처리없이 세포 구조는 그대로 유지되어 염색질이 핵에 존재한다는 것을 나타냅니다. 짧은 초음파 처리는 세포 구조를 깨고 마이크로 사진에서 세포를 검사하면 간단한 초음파 상태를 결정하는 데 도움이됩니다. 우리는 또한 293T 세포에서 간단한 초음파 처리에 대한 다른 예를 나타냈다 (그림1B)인간 B 세포 급성 림프 구성 백혈병 세포주, REH 세포 (도
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토론
초음파 처리는 일반적으로 조각난 염색체를 얻기 위하여 사용되지만, 재현 가능한 조건을 확인하기 위하여 시간이 많이 걸리고 성가신 입니다. 이 프로토콜에서는 효소 소화가 재현 가능한 조건을 식별하는 것이 더 쉬워야 하기 때문에 MNase 소화를 사용했습니다. MNase 소화 후 간단한 초음파 처리 단계 (단계 참조 2.2) 세포 막을 휴식 하 고 소화 된 염색질을 해제 하는 데 필요한. 따라서 프로토콜의 초음파 처리 전력은 가능한 한 낮아야합니다. 우리는 우리가 채택한 모든 세포에 대해 동일한 초음파 처리 조건을 사용합니다(그림 1 및 표 1참조)는 멤브레인의 완전한 분해를 얻습니다.
MNase에 의한 염색질 의 소화는 우리의 프로토콜에서 중요한 단계이며, 따라서 우리는 세포 내부의 염색질 의 소화조건을 최적화하기 위해 많은 노력을 기울였습니다. 소화 활성은 효소 및 기질(크로마틴) 및 배양 시간의.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 연구는 희망의 도시에 제넨테크 로열티에 의해 지원됩니다. 이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 전체 또는 부분적으로 지원 되지 않습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2 M KCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2x iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 1706862 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 50 bp DNA ladder | New England Biolabs | N3236S | |
| Agarose | Research Product International | A20090 | |
| 분지 옥틸페녹시 폴리(에틸렌옥시)에탄올 | 밀리포어 시그마 | I8896 | IGEPAL CA-630 |
| ChIP 등급 단백질 G 마그네틱 비드 | 세포 신호 기술 | 9006S | |
| 크로마틴 면역침전(ChIP) 희석 버퍼 | Millipore Sigma | 20-153 | 버퍼 구성: 0.01% SDS, 1.1% 트리톤 X-100, 1.2mM EDTA, 16.7mM 트리스-HCl, pH 8.1, 167mM 염화나트륨 |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0724 | 전기영환 등급 |
| 글리코겐 | Millipore | Sigma G1767 | 19-22 mg/mL |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78445 | |
| High Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-155 | 버퍼 구성 : 0.1 % SDS, 1 % 트리톤 X-100, 2 mM EDTA, 20 mM 트리스 -HCl, pH 8.1, 500 mM NaCl. |
| 히스톤 H3K4me3 항체 (pAb) | Active Motif | 39915 | |
| LiCl 면역 복합체 세척 버퍼 | Millipore Sigma | 20-156 | 버퍼 조성 : 0.25 M LiCl, 1 % IGEPAL CA630, 1 % deoxycholic acid (sodium salt), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8.1. |
| 저염 면역 복합체 세척 버퍼 | Millipore Sigma | 20-154 | 버퍼 구성 : 0.1 % SDS, 1 % Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 150 mM NaCl. |
| Magna GrIP Rack (8 well) | Millipore Sigma | 20-400 | 1.5 mL 튜브와 호환되는 모든 종류의 자기 분리 스탠드는 괜찮습니다. |
| Micrococcal nuclease | New England Biolabs | M0247S | 는 10x 완충액 (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, 25°C에서 pH 7.9; C) 및 100x BSA (10 mg/mL) |
| NaHCO3 | JT Baker | 3506-01 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore Sigma | 12-370 | |
| PIPES | Millipore Sigma | P6757 | |
| Proteinase K | Millipore Sigma | 3115887001 | |
| Real-time PCR system | Bio-Rad | CFX96, C1000 | |
| RNA pol II CTD phospho Ser5 항체 | Active Motif | 39749 | |
| SDS | Boehringer Mannheim | 100155 | 전기폐전도 등급 |
| 아세트산 나트륨 | Millipore Sigma | S5636 | |
| 마이크로팁 프로브 | QSONICA | Q700 | 발생기 1.5mL 튜브와 호환되는 모든 종류의 초음파 발생기는 괜찮습니다. |
| 초순수 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 (25:24:1, V/V) | Thermo Scientific | 15593031 | pH 8.05 |
참고문헌
- Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalen....
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재인쇄 및 허가
