이 기사에서는 지질학 및 전사학, 그리고 지질의 근본적인 염증 및 신경 활동, 막 지질, 다운스트림 메신저 및 mRNA 인코딩 효소/수용체를 대상으로 하는 신경 질환 마우스 모델의 혈장 지질학에 대한 모듈식 프로토콜을 제시합니다. 샘플링, 샘플 처리, 추출 및 정량화 절차가 설명되어 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
지질은 신경 질환에 도움이되는 뇌 모욕이나 자극에 대한 기본 인터페이스 역할을하며 질병의 발병 및 진행을 강조 할 수있는 다양한 신호 또는 리간드 기능을 가진 지질 합성을위한 저수지입니다. 종종 전증상 수준에서 변화, 지질은 약물 표적과 바이오 마커의 신흥 소스입니다. 많은 신경 질환은 신경 염증을 전시, 신경 변성, 일반적인 특징으로 신경 흥분성, 부분적으로 특정 지질 신호 시스템에 의해 변조. 다양한 지질의 합성의 상호 의존성 및 상호 관계는 신경학적 맥락의 공통점과 특이성을 도출하고 질병 발병 및 진행의 기계적 측면의 해명속도를 촉진하기 위해 다중 지질, 다효소 및 다수용체 분석을 자극한다. 뚜렷한 뇌 영역에 지질 역할을 아스포딩하는 것은 신경 질환과 관련된 지질 분자 표현형 및 형태학의 결정을 진행합니다.
여기에 제시된 모듈식 프로토콜은 특정 신경 질환 및/또는 조건에 관련있는 이산 뇌 영역에서 추출된 기능의 근간이 되는 효소 및 중재자의 mRNA와 함께 멤브레인 지질 및 하류 지질 신호의 분석에 적합한 모듈식 프로토콜이다. 정확한 비교 지질 프로파일링을 보장하기 위해, 워크플로우 및 운영 기준은 최적화 및 표준화되었다: i) 뇌 샘플링 및 관심 영역의 해부, ii) 다중 지질 신호 및 멤브레인 지질의 공동 추출, iii) 이중 지질/mRNA 추출, iv) 액체 크로마토그래피 다중 반응 모니터링(LC/MRM), 및 v) 표준 mRNA 프로파일링에 의한 정량화. 이러한 워크플로우는 기능적으로 이산뇌 하위 영역(즉, 뇌 펀칭에 의한)의 샘플링에 의해 얻어진 낮은 조직량에 대해 가능하므로 조직 이질성 및/또는 동물 적 변이성으로 인한 다분자 분석의 편견을 방지할 수 있습니다. 신경 질환의 말초 결과를 밝히고 신경 질환 상태의 번역 분자 판독을 확립하기 위해 말초 장기 샘플링, 처리 및 후속 지방 피도혈 분석뿐만 아니라 혈장 리피도믹도 추구되고 설명됩니다. 프로토콜은 급성 간질 마우스 모델에서 입증된다.
서론
지질의 기능과 신경 질환의 발병 및 진행에 대한 역할의 최근 발전은 새로운 치료 목표 및 질병 메커니즘 의 새로운 연구 및 개발 장소를 열어1. 질량 분석 영상 및 고급 질량 분광 프로파일링과 같은 현대 분자 이미징 기술에 의해 강조되는 다른 뇌 영역에서 지질 조성에 대한 문서화 된 차이는 전체 뇌에서 지질 조사의 패러다임을 기능적으로 뚜렷하고 이산적인 뇌 영역으로 전환합니다. 지질 성분이 다른 뇌 영역에서 다르다는 사실은 기능적으로 뚜렷한 뇌 영역을 가로지르는 뇌 모욕이나 자극에 대응하여 멤브레인 지질 감수성과 하류 지질 신호의 새로운 개념화를 자극합니다. 따라서 지질 프로토콜은 더 높은 공간 분해능 검출 및 정량화, 그리고 동시에 세포막 및 신호 경로의 여러 지질 성분의 분석을 위해 낮은 조직 량의 과제를 해결하기 위해 새로운 개발이 필요합니다. 또한, 효소의 결정, 지질 리간드, 그들의 수준 및 기능의 조절에 관련 된 수용 체는 신경 질환에 영향을 받는 신호 경로를 해명 하 고 병리학적 맥락에서 새로운 기계분석 조사를 안내 하는 것이 가장 중요 하다.
증가 된 뇌 공간 해상도 뿐만 아니라, 새로운 신경 지질 도성 접근의 개발에 도전 하는 두 가지 주요 어려움이 있다. 첫째, 지질 신호 분자는 일....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
여기에 설명된 모든 실험 절차는 2010년 9월 22일(2010/63EU)의 유럽 공동체 위원회 지침에 따라 독일 라인란트 팔츠 주 지역 동물위원회의 승인을 받았습니다(파일 참조: 23 177-07/G16-1-075).
1. 급성 및 예방 치료 KA 유도 간질의 동물 모델
- 발작 유도, 치료 및 행동 점수를 수행합니다.
- 단일 케이지에서 분리 마우스(최소 n = 그룹당 6마우스).
- 발작 유도 주입 용액 및 해당 차량( 표 1 참조)과 치료 사출 용액 및 해당 차량을 준비합니다( 표 2 참조).
- 그들의 그룹 정체성에 따라 마취 없이 마우스 내회(즉, 10mL/kg 마우스 체질량)를 주입합니다: 질병, 치료 또는 차량 치료(즉, KA, PEA 처리된 KA 및 2개의 차량 그룹). 그림 2, 표 1 및 표 2를 참조하십시오.
- 다음 표준화된 발작 강도 척도에 따라 동작을 모니터링하고 점수를 매는 다: 0 = 응답 없음; 1 = 부동성 및 응시; 2 = 앞다리 및/또는 꼬리 확장, 경직된 자세....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
기술 된 프로토콜의 집합은 동물 모델의 선택, 샘플링 경로, 추출 및 프로파일링 방법과 같은 목표 특정 방식으로 상이한 수준에서 결합 될 수있다 (그림 1).
급성 간질 발작 상태의 시간 과정 동안 뇌와 주변의 지질 수준 변화를 결정하고 완두콩의 잠재적 인 항 간질 효과를 해명하기 위해13 뇌와 주변의 립피돔 변화에 미치는 영향, 세 가지 실험 동물 그룹은 차량으로 치료되었다, KA 급성 간질을 유도하기 위해, 및 PEA는 항질 약물 후보로. 완두콩은 KA-주입 전에 i.p.p.를 통해 투여되었다(예를 들어, 급성 치료를 위한 단일 완두콩 주사와 아만성 치료를 위한 2개의 완두콩 주사). 다중 분자 분석 및/또는 면역히스토케토화학 염색을 치료 후 5일 동안 의목적으로,.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
여기에 설명된 신경 지질도혈 및 전사 방법론은 뇌 및 말초 장기의 높고 낮은 공간 해상도에서 질병이나 건강한 발달을 조사하는 실행 가능한 의미입니다. 최적화된 플라즈마 샘플링 및 취급 절차로 인해 혈장 리피도믹 분석은 조직 리피도믹스 및 전사학을 위해 희생된 동일한 동물로부터 수행될 수 있으므로 조직 혈액 분자 상관관계 및 바이오마커 발견의 신뢰성을 향상시킬 수 있습니다. 3개의 프로토콜 또는 그 조합 중 하나를 적용하여 광범위한 데이터 세트를 제공하면 컨텍스트(동물 모델 실험) 내의 신경 질환뿐만 아니라 실험 모델 컨텍스트 를 가로질러 사이를 조사하는 것이 가치가 있습니다. 더욱이, 샘플링, 처리 및 분자 분석의 높은 수준의 표준화는 분자 데이터의 높은 재현성을 용이하게 하므로 연구 와 실험실 내의 분자 변화를 안정적으로 참조합니다.
그러나 이를 달성하기 위해 정의된 연구 목표에 대한 최대 판독 가능성을 제공하는 실험 설계의 설정이 중요합니다. 실험군 간의 분자 변화에 대한 신.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 이 기사를 에르멜린다 로마초 박사에게 헌납합니다. 이 원고를 마무리하는 동안 에르멜린다 로마조 박사는 세상을 떠났습니다. 그녀는 의미있는 연구 목적을 달성하기 위해 연구 작업에 과학과 사심없는 참여에 대한 열정의 구현이다. 그녀는 항상 인간의 더 큰 복지에 의미 있는 기여를 꿈꿔주었다. 그녀의 선한 성격은 과학과 삶의 격렬한 길로 인해 결코 타협되지 않았습니다. 그녀는 우리의 마음에 귀중하고 영원히 남아있을 것입니다.
줄리아 M. 포스트는 요하네스 구텐베르크 대학 마인츠의 대학 의료 센터에서 번역 신경 과학 (FTN)에 대한 초점 프로그램에 의해 투자되었으며, 현재 LB에 SPP-2225 EXIT 프로젝트에 의해 투자된다. 이러한 연구에 대 한 부분 자금 은 리피도믹스 코어 시설에 의해 제공 되었다, 생리 화학 연구소, 그리고 교내 기금 (LB에) 요하네스 구텐베르크 대학 마인츠의 대학 의료 센터에서.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 12(S)-HETE | Biomol | Cay10007248-25 | Lipid Std |
| 12(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay334570-25 | Lipid Std |
| 1200 시리즈 LC 시스템 | 애질런트 | 기기/LCMS | |
| 2100 바이오분석기 | 애질런트 | 기기/qPCR | |
| 5(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay 334230 | 지질 Std |
| ABI 7300 Real-Time PCR cycler | Applied Biosystems | Instrumentation/qPCR, | |
| 아세토니트릴 LC-MS, 크로마 솔브 | , Honeywell | 9814920 | 용매/LCMS |
| 황색 에펜도르프 튜브 | Eppendorf | Sample Prep. | |
| Analyst 1.6.2 소프트웨어 | AB SCIEX, 다름슈타트 | 소프트웨어 | |
| 분석 저울 | Mettler Toledo | 계장/샘플 준비. | |
| Arachidonic Acid-d8 MS Standard | Biomol | Cay-10007277 | Lipid Std |
| Bessmann Tissue Pulverizer | Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) | 기기/시료 준비 | |
| Bino | Zeiss | 현미경 | |
| cleaved Caspase 3 항체 | Cellsignaling | 9661S | 현미경 |
| Cryostat, Leica CM3050 S | Leica Biosystems | 기기/샘플 준비. | |
| CTC HTC PAL 자동시료주입기 | CTC Analytics AG | Instrumentation/LCMS | |
| Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 | FST | 11271-30 | 수술 도구 |
| Dumont 펜치 초미세 팁 #5SF (x2) | FST | 11252-00 | 수술 도구 |
| EDTA 1000 A Rö hrchen | Kabe Labortechnik | 078001 | 샘플 준비 |
| EP-1 EconoPump | BioRAD | 700BR07757 | 기기/시료 준비 |
| 미세 집게 미러 마감 | FST | 11412-11 | 수술 도구 |
| 미세 홍채 가위 스트레이트 샤프 | FST | 14094-11 | 수술 도구 |
| 미세 가위 텅스텐 카바이드 스트레이트 | FST | 14568-09 | 수술 도구 |
| 홍채 주걱 | FST | 10094-13 | 수술 도구 |
| Kainic acid | Abcam | ab120100 | 간질 약물 |
| 지질 보기 소프트웨어 | AB SCIEX, 다름슈타트 | 소프트웨어 | |
| LPC 17:0 | Avanis Polaris | 855676P | 지질 표준 |
| LPC 18:0 | Avanis Polaris | 855775P | 지질 표준 |
| 루나 2,5&마이크로; m C18(2)- HAST 100A LC 컬럼 | Phenomenex | 00D-4446-B0 | 계측/LCMS |
| 확대 | Maul GmbH | 계측/샘플 준비 | |
| 메탄올 LC-MS 크로마 용매 99.9% | Honeywell | 9814920 | 용매/LCMS |
| Motic Camara | Motic | 현미경 MTBE | |
| Honeywell | 34875-1L | 용매/LCMS | |
| MultiQuant 3.0 정량 분석 소프트웨어 패키지 | AB SCIEX, 다름슈타트 | 소프트웨어 | |
| NanoDrop 2000c 분광 광도계 | Thermo Scientific | 기기/qPCR | |
| PA 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840857P | 지질 표준 |
| PA 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1404 | 지질 표준 |
| 팔미토일 에탄올 아미드 | Biomol | Cay90350-100 | 지질 표준 |
| 팔미토일 에탄올 아미드-d5 | Biomol | Cay9000573-5 | 지질 표준 |
| PC 16:0-18:1 | Avanis 폴라리스 | 850457P | 지질 Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | 지질 표준 |
| PC 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1004 | 지질 Std |
| PE 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850757P | 지질 표준 |
| PE 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1104 | 지질 표준 |
| PG 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840457P | 지질 표준 |
| PG 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1204 | Lipid Std |
| PI 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1504 | Lipid Std |
| Precelleys 24 | Peqlab | 기기/시료 준비 | |
| Precellys Keramik-Kü gelchen | Peqlab | 91-pcs-ck14p | 샘플 준비 |
| Precellys Stahlkugeln 2,8mm | Peqlab | 91-PCS-MK28P | 샘플 준비. |
| Precellys-keramik-kit 1,4mm | VWR | 91-PCS-CK14 | 샘플 준비 |
| 프로스타글란딘 D2 | Biomol | Cay, 12010 | 지질 Std |
| 프로스타글란딘 D2-d4 | Biomol | Cay 312010 | 지질 Std |
| 프로스타글란딘 E2 | Biomol | Cay10007211-1 | 지질 Std |
| 프로스타글란딘 E2-d9 | Biomol | Cay10581-50 | 지질 Std |
| PS 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1304 | 지질 Std |
| Q 트랩 5500 삼중 사중극자 선형 이온 트랩 MS | AB SCIEX | 기기/LCMS | |
| 실시간 PCR 시스템 | Appliert Biosystem | 기기/qPCR | |
| Resolvin D1 | Biomol | Cay10012554-11 | Lipid Std |
| Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | Sample Prep. |
| 경비원 프리 컬럼 | Phenomenex | Instrumentation / LCMS | |
| Shandon 커버 플레이트 | Thermo Fisher | 72110017 | 현미경 |
| Shandon 슬라이드 랙 및 뚜껑 | Thermo Fisher | 73310017 | Microscopy |
| SM 18 : 0 | Avanis Polaris | 860586P | Lipid Std |
| SM d18 : 1 / 12 : 0 | Avanis Polaris | LM-2312 | Lipid Std |
| 표준 겸자 직선 부드러운 | FST | 11016-17 | 수술 도구 |
| 수술 용 가위 ToughCut 표준 패턴 | FST | 14130-17 | 수술 도구 |
| T3000 Thermocycler | Biometra | Instrumentation/qPCR | |
| Thromboxane B2 | Biomol | Cay19030-5 | Lipid Std |
| Thromboxane B2-d4 | Biomol | Cay319030-25 | 지질 Std |
| Tissue Lyser II | Qiagen/ Retsch | 12120240804 | 기기/시료 전처리 |
| Tissue Tek | Sakura Finetek | 4583 | 현미경 |
| Toluidinblau | Roth | 0300.2 | 현미경 |
| Vapotherm | Barkey | 4004734 | 기기/샘플 준비 |
| Wasser LC-MS 크로마 솔브 | VWR | 9814920 | 솔벤트/LCMS |
참고문헌
- Aronica, E., et al. Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models. Epilepsia. 58, 27-38 (2017).
- Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
