조합 미르 세포 주기 조절 및 신생 치료의 분석

요약

miRNA 치료제 암 진행을 조절에 상당한 잠재력이 있다. 여기 설명 분석 접근 사용 된다 세포 주기 및 신생 중단 조합 미르 치료의 활동의 식별을 위해.

초록

폐 암 (LC)은 전세계 암 관련 된 죽음의 주요 원인입니다. 다른 암 세포와 마찬가지로, 액정 셀의 기본적인 특성은 관계가 없는 확산 및 세포 분열 이다. 억제 세포 주기 진행을 중단 하 여 확산의 LC를 포함 한 암 치료에 대 한 유망한 접근 되도록 표시 되었습니다.

miRNA 치료제 중요 한 post-transcriptional 유전자 레 귤 레이 터로 등장 하 고 암 치료에 사용 하기 위해 점점 공부 되 고 있다. 최근 작품에서 우리는 두 miRNAs, 143 미르와 미르-506, 세포 주기 진행 조절 하 활용. A549 비 작은 세포 폐 암 (NSCLC) 세포 페 했다, 유전자 표현 변경 했다 분석 하 고 치료 때문에 apoptotic 활동 마지막으로 분석 했다.  종속 kinases (CDKs)의 Downregulation 감지 했다 (즉, CDK1, CDK4 그리고 CDK6), 세포 주기 G1/G2/M 및 상전이에 중단 하 고. 경로 분석 다각적인 활동 접근을 endows 치료의 잠재적인 항 혈관 신생 활동을 가리킨다. 여기, 설명 된 혈관 신생의 억제에 의해 세포 주기 억제, apoptosis의 유도 및 내 피 세포에 치료의 효과 관한 miRNA 활동을 식별 하기 위해 사용 하는 방법론입니다. 그것은 여기에 제시 된 방법 미르 치료제와 해당 활동에 미래 연구를 지원 합니다 및 대표적인 데이터 실험 분석 하는 동안 다른 연구자를 안내할 것입니다 기대.

서론

세포 주기 mitotic 프로세스¹를 통해 DNA와 세포 확산의 중복을 허용 하는 여러 규제 이벤트의 조합 이다.  종속 kinases (CDKs)을 조절 하 고 세포 주기²를 홍보 합니다. 그 중, mitotic CDK (CDK1) 및 interphase CDKs (CDK2, CDK4, 및 CDK6)에 있는 중추적인 역할 세포 주기 진행³. Retinoblastoma 단백질 (Rb)는 CDK4/CDK6 복잡 한 세포 주기 진행⁴, 허용에 의해 phosphorylated 그리고 CDK1 활성화⁵성공적인 세포 분열 위해 필수적 이다. 수많은 CDK 억제제를 개발 하 고 지난 몇 년간 CDKs 암 치료에서 표적으로 하기의 가능성을 나타내는 임상 시험에서 평가 되었습니다. 사실, 3 CDK 억제제 유방암의 치료에 대 한 승인 되었습니다 최근^6,7,8,,910. 따라서, CDKs, 그리고 특히, CDK1 및 CDK4/6, 암 세포의 진행을 조절에 큰 관심의.

(미르) miRNAs는 작은, 비 코딩 RNAs 모든 인간의 유전자¹¹의 약 30%를 조절 하는 유전자 발현의 post-transcriptional 레 귤 레이 터. 그들의 활동은 변환 억압 또는 메신저 RNAs (mRNAs)¹²의 저하를 기반으로 합니다. 그들의 생물학 중요성의 설명, 5000 개 이상의 miRNAs 확인 된 하 고 하나의 miRNA 분자 여러 유전자^11,13를 통제할 수 있다. 더 중요 한 것은, miRNA 식 다른 질병 및 질병 상태, 암¹³를 포함 하 여 관련 된 되었습니다. 사실, miRNAs는 되었습니다 특징으로 종양 또는 종양 진압, 홍보 하거나 종양 개발 및 진행^14,15억제 능력이 되 고. 병에 걸리는 조직에 miRNAs의 상대 식 질병 진행;를 통제할 수 있다 따라서, 외 인 납품 miRNAs의 치료 가능성이 있다.

폐암은 주요 원인이 암 관련 된 죽음의 그리고 이상의 모든 폐 악성 종양의 60%는 비 작은 세포 폐 암^16,17, 20%의 5 년 생존 율과¹⁸. 미르-143-3 p와 미르-506-3 p를 사용 하 여 최근 폐 암 세포¹¹에서 세포 주기를 대상으로 평가 했다. 143 미르와 미르-506 CDK1 및 CDK4/CDK6, complementarity 시퀀스 있고 A549 세포에 이러한 두 미르의 효과 분석 했다. 실험 내용은 제시 되며이 문서에서 설명. 유전자 발현, 세포 주기 진행 및 apoptosis 다른 실험적인 디자인 및 transfection 다음 timepoints를 사용 하 여 평가 되었다. 우리는 특정 유전자 발현을 측정 하 microarray 분석 함께 실시간 정량 PCR (RT-정량) 방법을 사용 하 고-세대 RNA 시퀀싱 글로벌 유전자 dysregulation¹¹을 결정 하는 데 사용 되었다. 후자의 방법을 유전자의 수천은 단일 실험 분석에서 분석 될 수 있다 하는 동안 높은 감도와 재현성, 각 유전자의 사본의 관계 되는 풍부를 식별 합니다. 또한, miRNA 처리 때문 apoptotic 분석 수행 및 여기에 설명 되어. 생물 정보학 보충 통로 분석. 여기에 제시 된 프로토콜 사용 됩니다 분석 치료의 조합 미르-143의 잠재력과 미르-506.

이 프로토콜의 주요 목적은 세포, 세포 주기에 중점을 두고 miRNAs의 효력을 식별 하는 것 이다. 다양 한 기술 여기에 제시 된 유전자 표정 분석 (사용 하 여 정량) 정교 하 게 사전 번역 고 소설에서 microarray 분석 등 단백질 수준에 유전자 분석을 위한 기법. 그것은이 보고서는 miRNAs와 함께 작업에 관심이 연구원을 위한 도움이 기대. 또한, 세포 주기의 흐름 cytometric 분석 및 세포의 apoptosis에 대 한 방법론을 제시.

프로토콜

1. 미르-143 및 미르-506 transfection

주의: 라텍스 장갑, 보호 안경, 그리고 실험실 외 투를 사용 하 여 설명된 실험을 수행 하는 동안. 필요한 경우 biosafety 내각을 사용 하 여 캐비닛 팬에, 기도 차단 또는 판 상 공기 흐름을 방해 하지 않고. 항상 제조 업체에 의해 설명 된 대로 적절 한 높이에 보호 유리 창을 설정 합니다.

1. T25 cm² 플라스 크/6/96 잘 접시 DMEM/F12K 미디어에서 씨 NSCLC A549 세포 10 %FBS 1% 페니실린-스 (문화 미디어) 조직 문화 후드에서 보충 하 고 5% CO₂ 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 밤새 품 어.
2. 미르-143 / 미르-506 모방, 일시 중단 또는 transfecting 에이전트와 siRNA를 출 격 (미르의 2.4 µ g 14 µ L transfecting 에이전트의 혼합 했다; 테이블의 자료를 참조) transfection 미디어와 1.5 mL 혈 청의와 항생제 무료 500 µ L에서 DMEM/F12K 미디어에는 마지막 미르 농도 100의 nM. 미르 금액 다른 셀 및 농도에 최적화를 해야 합니다. 적절 한 접근에는 미르 (즉, 50-200 nM)의 농도 및 관심사의 유전자의 식 downregulation의 평가 증가 함께 세포의 transfection 포함 됩니다.
3. 플라스 크/접시에서 문화 미디어를 제거 하 고 한 번 1 x PBS로 세척.
4. 미르/출 격 transfecting 에이전트 단지를 추가 하 고 37 ° C 6 h 5% CO₂ 에서 품 어 (플라스 크 크기 정의 추가 인큐베이션 볼륨).
5. 문화 미디어의 4 mL와 함께 미디어를 교체 하 고 24 시간 및 48 h에 대 한 셀을 품 어.
6. 각 T25 cm² 플라스 크에 트립 신-EDTA의 1 mL을 추가 하 여 trypsinization, 의해 transfected 세포를 수확 하 고 37 ° C에서 5-10 분 동안 품 어 배양 세포를 수확의 3 mL를 추가 합니다. 각 플라스 크의 내용을 별도, 표시 된 15 mL 튜브에 놓습니다. 조직 문화 후드에서 작동 합니다.
7. 5 분 동안 751 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한을 제거 합니다.
   참고: 주의 필요 표면에 뜨는 제거 하는 동안 튜브의 동요 셀 손실 발생할 수 있습니다.
8. 751 x g. 에 1 x PBS와 5 분 동안 원심 분리기의 2 개 mL를 추가
9. 미디어와 상쾌한의 모든 흔적을 제거 하는 7, 8 번 단계를 반복 합니다.
   참고:이 단계에서 샘플 튜브-80 ° C에 저장 될 수 있습니다 또는 즉시 사용할 수 있습니다.

2. RNA 추출

1. 70% 이소프로필 알콜과 RNAse 오염 제거 솔루션으로 분사 하 여 작업 영역을 청소.
2. RNA 추출 적절 한 RNA를 사용 하 여 수행 되어야 합니다 키트 ( 재료의 표참조).
3. -80 ° C에서 튜브를 제거 하 고 해 동 하도록 허용. 세포의 용 해 버퍼의 아래로 세포 막 휴식을 피펫으로 300 µ L를 추가 합니다.
4. 100% 초 순수 에탄올의 동일한 볼륨을 추가 합니다.
5. 잘 혼합 하 고 분리 하는 열에.
6. 11와 16 x g 30 s를 통해 흐름 제거 사이 원심.
7. 버퍼와 버퍼를 제거 하는 원심 분리기 세척의 400 µ L를 추가 합니다.
8. DNAse I DNA 소화의 75 µ L 각 샘플에서 버퍼링 하 고 15 분 동안 품 어의 5 µ L를 추가 합니다.
9. RNA 준비 버퍼의 400 µ L로 샘플을 씻으십시오.
10. 워시 RNA 워시 버퍼 2 배.
11. 추가 nuclease 무료 물 원심 분리기, 열을 다음 수집 RNA.
12. UV 분 광 광도 계와 총 RNA 농도 측정 합니다.

3입니다. 실시간 정량

1. RT-정량, 전에 cDNA를 음성 합성. RNA 농도 정량화, 이후 PCR 튜브에 cDNA를 준비 하는 반응의 20 µ L 최종 볼륨에 RNA의 1 µ g를 배치 합니다. 항상 깨끗 한 벤치에 작동 합니다.
2. 모든 다른 필요한 재료는 표 1에 포함 되어 있습니다.

재료	수량 (µ L) / 샘플 (20 µ L)
5 X cDNA 마스터 믹스	4
dNTPs	2
임의의 hexamers	1
실시간 증강	1
짝수로 효소 혼합	1
DNase과 RNase 무료 물	20 µ L을 RNA를 추가한 후 필요한 수량

표 1: RNA 샘플에서 cDNA 합성에 대 한 자료. 마스터 믹스 cDNA 합성 한 샘플에 대 한 준비를 각각 재료의 수량을 필요 합니다.

3. 다음 온도 조건 열 cycler에서 품 어: 30 분;에 대 한 42 ° C 95 ° C 2 분; 샘플 컬렉션까지 4 ° C입니다.
4. 즉시를 사용 하 여 일반 PCR 또는 정량, 또는-20 ° c.에 cDNA를 저장
5. 정방향 및 역방향 뇌관 솔루션 DNase/RNase 무료 주식 뇌관 솔루션에서 10 μ M의 농도에서 물 준비.
6. 감지 되 고, 샘플의 수에 따라 각 유전자에 대 한 별도 마스터 믹스를 준비 합니다. 각 cDNA 샘플 (잘 정량), 반응 수량 표 2에 따라 준비 됩니다.

재료	수량 (µ L) / 샘플 (20 µ L)
SYBR 마스터 믹스	10
앞으로 뇌관-10 μ M	2
반전 뇌관-10 μ M	2
DNase과 RNase 무료 물	3
cDNA 샘플	3

표 2: cDNA 샘플에서 실시간 양이 많은 PCR에 대 한 자료. 정량에 대 한 하나의 샘플에 대 한 마스터 믹스를 준비 하는 재료의 수량을 필요 합니다.

7. 각 우물에 각 샘플을 배치 합니다.
8. 96 잘 정량 플레이트에 대 한 샘플 레이아웃을 디자인 합니다. 각 샘플을 분석 된 유전자에 대 한 반응에서에서 수행 triplicates에서 최소한에 중복.
9. 광학 투명 접착 커버 96 잘 접시를 봉인.
10. 빠른 스핀 반응 혼합물 각 우물의 바닥에 도달 수 있도록 접시.
11. 다음 열 그라데이션에 따라 실시간 정량 Pcr을 실행:
    2 분 동안 1) 50 ° C
    2 분 동안 2) 95 ° C
    15 3) 95 ° C s
    4)을 읽기
    1.5 분 동안 5) 60 ° C
    6) 39 시간을 위한 3 단계를 반복
12. 위의 단일 제품 확대를 나타내는 용융 곡선을 결정 하는 계속에서 다음 열 그라디언트를 실행 합니다.
    0.31 분 7) 65 ° C
    8) +0.5 ° C/사이클
    접시 9) 읽기
    10) 95 ° C를 도달할 때까지 60 시간을 위한 8 단계를 반복
    2 분 동안 11) 72 ° C

4. 단일 유전자 증폭을 확인 Agarose 젤 전기 이동 법

1. 1 x TBE 버퍼에 1 %agarose 젤 준비.
2. 추가 ethidium 평범한 사람 (EtBr) 따뜻한 (~ 50 ° C) 젤에 약 0.2-0.5의 최종 농도 달성 때까지 µ g/mL. EtBR dna 한다 UV 젤 영상에 빛에서 시각화 될 수 있습니다.
3. 따뜻한 젤 전기 이동 법 젤 상자와 함께 제공 된 젤 트레이에 붓으십시오. 단단히 균일 한 우물에 대 한 제공 된 빗을 연결 합니다.
4. 나머지를 젤 실내 온도 (RT) 멋진 ~ 30 분을 허용 합니다.
5. 젤은 고형화 하는 때, 트레이 젤 젤 상자에 놓습니다.
6. 채워 젤 상자 1 x TBE 버퍼 젤 완전히 덮여 때까지.
7. UV 분석기를 사용 하 여 PCR 증폭 과정에서 DNA의 농도 측정 합니다.
8. 받아 ~ 15 작은 PCR 튜브에 DNA의 ng 염료, 5 µ L을 추가 하 고 nuclease 무료 물 15 µ L 총 볼륨을 달성 하기 위해 필요한 금액을 추가.
9. 우물에 DNA 사다리 및 샘플을 로드 합니다.
10. 염료 라인 젤 아래로 75-80% 정도 될 때까지 100 V에서 젤을 실행 합니다.
    참고: 젤 실행 네거티브에서 포지티브 차지 다는 것을 확인 하십시오.
11. 젤을 제거 하 고 DNA를 시각화 하 젤 영상에.

5. 세포 주기 분석

1. 각 씨앗 5 x 10⁵ 셀 T25 cm² 플라스 크에서 시음 하 고 제 1, 1-5 단계를 설명 하는 프로토콜에 따라 transfection를 수행.
2. 24 시간 및 48 h 후 다음 trypsinization에 의해 셀 수확.
3. 15 mL 무 균 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 제대로 그들을 분류.
4. 샘플 5 분 751 x g 에서 원심 및 삭제는 상쾌한.
5. 얼음 처럼 차가운 1 x PBS의 2 개 mL를 추가, 소용돌이, 그리고 5 분에 대 한 751 x g 에서 원심 분리기는 상쾌한 삭제.
6. 잔여 미디어를 제거 하려면 1 x PBS로 세척 단계를 반복 합니다.
7. Resuspend 고 펠 릿 pipetting으로 얼음 처럼 차가운 1 x PBS의 200 µ L을 추가 하 여.
8. 부드럽게 vortexing 동안 튜브를 70% 얼음 에탄올 dropwise의 2 개 mL를 추가 하 여 셀을 수정.
9. RT에서 30 분 동안 튜브를 품 어 고 1 시간에 4 ° C에서 튜브를 배치 합니다.
10. 4 ° C, 5 분 동안 751 x g 에서 원심 분리기에서 튜브를 제거 합니다.
11. 얼음 처럼 차가운 1 x PBS의 2 개 mL를 추가, 소용돌이, 그리고 5 분에 대 한 751 x g 에서 원심 분리기는 상쾌한 삭제.
12. Propidium 요오드 화물 (50 µ g/mL)와 ribonuclease는 (200 µ g/mL) 1 x PBS의 500 µ L을 추가
13. 빛에서 샘플을 보호 하면서 RT에서 30 분 동안 품 어.
14. 데이터 흐름 cytometer에 취득. 맨 상단에 사이드 분산형 (FSC 대 SSC) FSC 대 SSC 밀도 줄거리와 셀 클러스터의 하단 왼쪽된 모서리에 파편을 제외 하 고 셀의 주요 인구를 선택 대 앞으로 사용-FSC 대 SSC 밀도 플롯의 오른쪽.
15. 적절 한 소프트웨어와 함께 세포 주기 단계 마다 세포 인구의 식별을 위해 데이터를 분석 합니다.

6. Apoptosis 분석 결과

1. 각 씨앗 5 x 10⁵ 셀 T25 cm² 플라스 크에서 시음 하 고 제 1, 1-5 단계를 설명 하는 프로토콜에 따라 transfection를 수행.
2. 24 시간 및 48 h 후 trypsinization에 의해 세포를 수확.
3. 15 mL 무 균 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 제대로 그들을 분류.
4. 5 분 동안 751 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.
5. 얼음 처럼 차가운 1 x PBS의 2 개 mL를 추가, 소용돌이, 그리고 5 분에 대 한 751 x g 에서 원심 분리기는 상쾌한 삭제.
6. 잔여 미디어를 제거 하려면 1 x PBS로 세척 단계를 반복 합니다.
7. 10 차가운 dH₂오 1 x Annexin V 바인딩 버퍼 배 희석
8. 각 샘플 튜브를 Annexin V 바인딩 버퍼 x 1의 1 mL을 추가 하 고 부드럽게 resuspend.
9. 장소 96 µ L의 세포 현 탁 액 1.5 mL microcentrifuge 튜브.
10. 세포 현 탁 액을 포함 하는 튜브를 Annexin V FITC 켤레의 1 µ L 및 propidium 요오드 화물 (PI)의 12.5 µ L를 추가 합니다.
11. 어둠 속에서 얼음에 10 분 동안 세포 현 탁 액을 품 어.
12. 희석을 각 샘플 튜브를 Annexin V 바인딩 버퍼 x 250 µ L 얼음 1을 추가 합니다.
13. 즉시 교류 cytometer 샘플을 분석 합니다.

7. 단백질 항 체 세포 주기 microarray 식

1. 각 씨앗 5 x 10⁵ 셀 T25 cm² 플라스 크에서 시음 하 고 제 1, 1-5 단계를 설명 하는 프로토콜에 따라 transfection를 수행.
2. 24 시간 및 48 h 후 trypsinization에 의해 세포를 수확.
3. 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 그에 따라 그들을 분류.
4. 5 분 동안 751 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.
5. 얼음 처럼 차가운 1 x PBS의 2 개 mL를 추가, 소용돌이 및 751 x g 에서 원심 분리기는 5 분에 대 한 삭제는 상쾌한.
6. 1 x PBS로 세척 단계를 반복 합니다.
7. 세포의 용 해 버퍼 protease 억제제와 보충의 150 µ L를 추가 합니다. 위쪽 및 아래쪽 피펫으로 세포 막 중단을 부드럽게.
8. 어떤 세포의 용 해 버퍼 간섭 방지 하려면 제조업체의 용 매 교환 열을 사용 하 여 레이블 버퍼에 세포의 용 해 버퍼를 바꿉니다 버퍼 exchange를 수행 합니다.
9. BCA 분석 결과 함께 총 단백질 계량.
10. 70 µ g 단백질 샘플의 고 75 µ L의 최종 볼륨을 달성 하기 위해 레이블 버퍼를 추가.
11. 시 약 비오 틴 (biotin/DMF)의 1 밀리 그램의 dimethylformamide (DMF) 100 µ L를 추가 합니다.
12. 각 단백질 샘플 (biotinylated 단백질 샘플) biotin/DMF의 3 µ L을 추가 하 고 실시간에 2 h에 대 한 품 어
13. Vortexing에 의해 정지 시 약의 혼합 35 µ L를 추가 합니다.
14. 30 분 동안 RT에서 샘플을 품 어.
15. 그렇게 그들은 사용 하기 전에 1 시간을 위한 rt 따뜻한 냉장고에서 microarray 슬라이드를 제거 합니다.
16. 일반적인 바인딩 (차단 시 약 제조업체에서 제공)에 3% 건조 우유 솔루션 슬라이드 실시간에서 45 분 연속 떨고와 페 트리 접시에 배양 하 여 차단 수행
17. DdH₂O 물으로 슬라이드를 세척 (다른 규정이 없는 한, 세척으로 일어난다 ddH₂O).
18. 세척 단계 ~ 10 x 슬라이드 표면에서 차단 솔루션을 완전히 제거를 반복 합니다. 이것은 균일 하 고 낮은 배경 달성 해야 합니다.
19. 과도 한 물 슬라이드 표면에서 제거 하 고 건조 하는 슬라이드 없이 다음 단계로 진행.
20. 결합 시에 3% 건조 우유를 용 해 하 여 커플링 솔루션을 준비 합니다.
21. 단계의 7.12 이전 준비 biotinylated 단백질 샘플의 전체 수량을 커플링 솔루션의 6 mL를 추가 합니다.
22. 장소 슬라이드에 커플링 챔버에의 한 잘 공급 업체에서 제공 하 고 혼합 결합 단백질의 ~ 6 mL를 추가 합니다.
    참고: 슬라이드 혼합 솔루션을 결합 하는 단백질에 완전히 빠져들 확인 합니다.
23. 커플링 챔버를 커버 하 고 궤도 셰이 커에 지속적인 동요와 RT에 2 h에 대 한 품 어.
24. 페 트리 접시에 슬라이드를 전송 하 고 버퍼를 세척 하는 x 1의 30 mL를 추가 합니다. 페 트리 접시 궤도 통에, 10 분 동안 흔들어 놓고 솔루션을 삭제 합니다.
25. 반복 단계 7.24 2 x.
26. 7.17-7.18 단계에 설명 된 대로 광범위 하 게 ddH₂O 물으로 슬라이드를 헹 구 고 건조 하지 않도록 하는 즉시 다음 단계를 수행 하십시오.
27. 검색 버퍼의 30 ml에서 Cy3 streptavidin (0.5 mg/mL)의 30 µ L를 추가 합니다.
28. 슬라이드를 페 트리 접시에 놓고 Cy3 streptavidin 포함 된 감지 버퍼의 30 mL를 추가 합니다.
29. 20 분 연속 떨고 빛에서 보호와 궤도 통에서 품 어.
    참고: Cy-3는 형광 성 염료. 알루미늄 호 일로 다룹니다 또는 형광 강도 유지 하기 위해 어두운 조건 하에서 운영.
30. 7.24-7.26 단계를 수행 하 고 건조 한 공기의 부드러운 스트림을 사용 하 여 또는 50 mL 원뿔 튜브와 5-10 분 동안 1300 x g 에서 원심 분리기에 슬라이드를 삽입 하려면 슬라이드 허용.
31. 슬라이드 슬라이드 홀더 및 알루미늄 호 일 덮개에 놓습니다.
32. 적절 한 여기 및 방출 파장 microarray 스캐너에 슬라이드를 검사 합니다. Cy3, 경우 여기 파장 피크 ~ 550 ~ 570 nm와 방출 피크에 이다 nm.
33. 소프트웨어 사용에 대 한 ( 재료의 표참조) 데이터 분석).

8. RNA 시퀀싱

1. 각 씨앗 5 x 10⁵ 셀 T25 cm² 플라스 크에서 시음 하 고 제 1, 1-5 단계를 설명 하는 프로토콜에 따라 transfection를 수행.
2. 24 시간 및 48 h 후 trypsinization에 의해 세포를 수확.
3. 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 그에 따라 그들을 분류.
4. 섹션 2, 1-6 단계에 따라 RNA를 추출 합니다.
5. 농도 bioanalyzer와로 서 RNA 품질을 확인 합니다. RNA 무결성 (린) 8 위 점수와 적절 한 히스토그램은 RNA 품질을 확인 하는 데 필요한.
6. 총 RNA에서 RNA 시퀀싱 (총 RNA에서 메신저 RNA)에 대 한 샘플의 ~ 2 µ g을 사용
7. ¹¹다음-세대 시퀀서 사용 하 여 시퀀스입니다.
8. 품질 트리밍 실행 하 고 RNA 시퀀싱 컴퓨터¹¹에서 생성 된 FASTQ 파일에서 참조 게놈 지도.
9. FASTQ 파일 및 원시 읽기 카운트 데이터를 업로드의 지침에 따라 Genebank는 < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/> 웹사이트.
   참고: 이전 결과 대 한 승인 번호를 SRP133420을 참조 하십시오.

9. 관 형성 분석 결과

1. 섹션 1, 대신 A549 세포 HUVEC 세포를 사용 하 여 1-5 단계에에서 설명 된 대로 miRNA 페 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs) 36 h 후 transfection, 신생 잠재력을 평가 합니다.
2. 5% CO₂와 37 ℃에서 4 h M199 기아 미디어와 HUVECs을 굶 어.
3. 감소 된 성장 인자 지하실 멤브레인 매트릭스-80 ° C에서 4 ° C 하룻밤에 저장소 버블 형성 및 중 합 방지 하기 위해 점진적 재개 허용을 제거 합니다.
4. 신중 하 고 천천히 감소 성장 인자 지하실 멤브레인 매트릭스, 거품 형성 방지의 0.04 mL와 함께 96 잘 접시의 웰 스 코트. 층 류 흐름 후드 아래 모든 절차를 수행 합니다.
5. 습도 유지 하 고 온도 보존 하는 PBS의 0.1 mL로 96 잘 접시의 인접 한 우물을 채우십시오.
6. 지하실 막 추출의 중 합 달성 된다 그래야 적어도 20 분 동안 37 ° C에 96 잘 접시를 품 어. 1 시간 이상에 대 한 품 어 하지 마십시오.
7. 각 그룹에서 transfected HUVECs trypsinize 그리고 1 x 10⁵ 셀/mL의 농도에서 중간 M199에 resuspend.
8. 96 잘 접시에 지하실 멤브레인 생산 매트릭스를 포함 하는 우물에 각 세포 현 탁 액 0.1 mL를 추가 합니다.
9. 성장 요인의 준비는 동안 5% CO₂ 와 37 ° C에 96 잘 접시를 품 어. 성장 요인의 준비 층 류 두건에서 또한 일어난다.
10. Reconstitute 최종 원하는 농도 (4 ng/mL 농도 2 ng/mL 최종 농도) x 2에서 성장 인자 (VEGF)와 셀으로 M199 기아 매체의 0.1 mL 위에 M199 기아 매체 포함 하는 성장 인자의 0.1 mL를 추가 합니다. VEGF 치료 비 웰 스에 대 한 셀으로 M199 기아 매체의 0.1 mL 위에 M199 기아 매체의 0.1 mL를 추가 합니다.
11. 5% CO₂와 37 ℃에서 6 h 96 잘 접시를 품 어.
12. 잠복기의 끝에, 4 배 확대, 명시 야 현미경 디지털 카메라 연결을 사용 하 여 각 잘의 이미지를 얻을.
13. "신생 분석기" 플러그인¹⁹를 갖춘 소프트웨어 프로세스 이미지. 세 개의 매개 변수를 사용 하 여, 노드 수, 접합, 및 총의 수 새싹 길이, 신생에 미르 치료의 효과 비교.

결과

실시간 정량 Pcr 및 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 유전자 표정 분석

실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 차동 유전자 표정 분석 대상된 유전자 CDK1, CDK4, 및 CDK6의 상당한 downregulation 시연. CDK1 및 CDK4/6 될 G2/M과 g 1/S 전환에 대 한 각각을 표시 했다. 수행된 분석 개별 미르와 미르 조합 활동 사이 직접적인 비교를 허용. 평가 절차에서 어떠한 간섭의 허용 transfecting 에이전트와 함께 출 격 siRNA 사용 하 여 감지 유전자 downregulation를 최소화 했다. 데이터는 양측 스튜던트 t를 사용 하 여 분석 통계 되었다-테스트, 그리고p < 0.05 통계적 (그림 1)으로 간주...

토론

miRNAs의 식 수준 dysregulation를 인식 하는 암 치료에 대 한 표적으로 한 치료로 서 작동할 수 정상 조직의 대 병. 이 연구 목적 miRNAs 잠재적으로 여러 단계 세포 주기 진행 중단을 결정. 그것은 143 미르와 미르-506 암 세포, 그리고이 조합 미르 치료의 활동을 이해 하는 목적으로 제시 프로토콜의 세포 주기 정지 확인 되었다.

설명된 방법론 miRNAs의 기능에 지배적인 이해를 제공합니다. 공부 하는 miRNAs의도 전에 그들의 능력을 여러 개의 유전자를 대상으로 하 고 따라서 여러 경로 영향을 미칠와 연결 됩니다. 설명된 정량 분석 구체적인 목표는 치료 전에 식별 하는 경우 관심의 특정 유전자의 표정의 식별 수 있습니다. 예를 들어 여기에 주요 초점 CDK1 및 CDK4/6과 세포 주기의 표현 이었다.

따라서, 세포 주기 분석 propidium 요오드 화물 및 흐름 cytometry 프로토콜을 사용 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
-80 > C Freezer	VWR	VWR40086A
96 웰 플레이트	CELLTREAT Scientific	50-607-511
96-웰 마이크로웰 플레이트	Thermo Scientific	12-556-008
A549 비소세포폐암 세포	ATCC	ATCC  CCL-185
아가로스	VWR	0710-25G
애질런트 2100 바이오분석기	애질런트 테크놀로지	G2938c
앰비온 소음기 음성 제어 번호 1 siRNA	앰비온	AM4611
항생제-항진균 용액 (100x)	Gibco	15240-062
항체 어레이 분석 키트, 2 반응	Full Moon Bio	KAS02
Brightfield microscope	마이크로스코프틱	IV-900
명시야 현미경	New Star Environment LLC
세포 주기 항체 어레이, 2 슬라이드	보름달 Bio	ACC058
Cell Logic+ Biosafety Cabinate	Labconco	342391100
Cellquest Pro	BD 생명과학	단계 5.14; 6.13: 세포 주기  단계에 따른 개체군 분포를 계산하고 분석을 위한 개체군 분포를 계산하는 데 사용됩니다. 세포자멸사
CFX96 실시간 시스템	BioRad	CFX96 광학 모듈
Chemidoc 터치 이미징 시스템	BioRad	Chemidoc 터치 이미징 시스템
CO2 인큐베이터	Thermo Scientific	HERAcell 150i
Cultrex 감소 성장 인자 기저층 매트릭스	Trevigen	3433-010-01
디지털 카메라	AmScope	FMA050
DMEM 4.5 g/L 포도당, 피루브산 나트륨 제외, L-글루타민	VWR	VWRL0100-0500
DNAse I	Zymo Research	E1010
내피 세포 성장 보조제(ECGS)	BD Biosciences	356006
Eppendorf 피펫 Pick-A-Pack 세트	Eppendrof	05-403-152
에탄올, 절대(200 프루프), 분자 생물학 학년,	Fisher BioReagents	BP2818500
Ethidium bromide	Alfa acar	L07462
F-12K 영양 혼합물(Kaighn's Mod.) L-글루타민, Corning		Corning 45000-354
FACS Calibur 유층계	Becton Dickinson
Fetal Bovine Serum - Premium	Antlanta Biologicals	S11150
Fetal 소 혈청 (FBS)	Fisher Scientific	10438026
Fisherbrand Basix 마이크로 원심분리기 튜브(표준 스냅 캡 포함)	Fisherbrand Basix	02-682-002
Forma Series II 워터 재킷 CO2 인큐베이터	Thermo Scientific
Heparin Solution (5000 U/mL)	Hospira	NDC#63739-920-11
Horixontal 전기영동 시스템	벤치탑 실험실 시스템	BT102
has-miR-143-3p miRNA Mimic	ABM	MCH01315
has-miR-506-3p miRNA Mimic	ABM	MCH02824
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)	Thermo Scientific	PHC9394
인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)	개인 기증자	IRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	SH30256FS
Ingenuity Pathway Analysis	Qiagen	결과: 생물정보학 경로 분석
Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free 증류수	Invitrogen	10-977-015
리포펙타민 2000	Invitrogen	11-668-027
로딩 염료 10X	ward's science+	470024-814
Medium M199 (with Earle′ s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate)	Sigma Aldrich	M4530
현미경 디지털 카메라	AmScope	MU130
Modfit LT	Verity 소프트웨어	5.15단계: 세포주기 개체군 분포
Nanodrop	Thermo Scientific	NanoDrop one C
Opti-MEM	Gibco by life technologies	31985-070
페니실린-스트렙토마이신 10/10	Antlanta Biologicals	B21210
Power UP SYBR 녹색 주된 혼합	적용되는 Biosystems	A25780
Propidium 요오드화물	MP Biochemicals LLC	IC19545825
Proscanarray HT Microarray 스캐너	Perkin elmer	ASCNPHRG. 우리는 543nm에서 여기 레이저 파장을 사용했습니다.
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Ribonuclease A from bovine pancreas	Sigma	R6513-50MG
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Shaker	Thermo Scientific	2314
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems
SpectraTube 원심분리기 튜브 15ml	VWR	470224-998
SpectraTube 원심분리기 튜브 50ml	VWR	470225-004
TBS 버퍼, 20x 액체	VWR	10791-796
온도 제어  원심분리기 말신	Thermo Scientific	ST16R
온도 제어 마이크로 원심분리기 말탄	Eppendrof	5415R
Thermo Scientific BioLite 세포 배양 처리 플라스크	Thermo Scientific	12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA 단백질 분석	Thermo Scientific	PI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA 버퍼	Thermo Scientific	PI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates	Thermo Scientific	AB0800WL
Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs)	Thermo Scientific	AB1453B
Ultra Low Range DNA Ladder	Invitrogen	10597012
VWR 표준 솔리드 도어 실험실 냉장고	VWR