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방법 논문

하 악 및 파 타 액 땀 샘에서 유기 유형 배양의 방사선 치료는 생체 내 특성의 핵심

7.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59484

⸱

2019년 5월 17일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Nutritional Sciences, University of Arizona, 2Cancer Biology Graduate Interdisciplinary Program, University of Arizona, 3Department of Chemical Engineering, University of Arizona

이 논문에서

요약

3 차원 유기 typic 문화권을 사용 하 여 타 액 선의 형태학 및 기능적인 마커를 시각화 하는 것은 방사선을 따르는 조직 손상의 기계 장치에 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에서 설명 하는 프로토콜은 이온화 방사선에 노출 되기 전에 섹션, 문화, 방사선, 얼룩 및 이미지 50-90 μ m 두께의 타 액 선 섹션에 관한 것 이다.

초록

Xerostomia는 방사선 요법으로 치료 되는 머리와 목 암 환자에 있는 삶의 질을 감소 시키는 만성 경구 합병증을 만듭니다. 타 액 선 기능 장애 및 복원의 이해 메커니즘에 대 한 실험적 접근법은 생체 내 모델에 초점을 맞추고 있으며,이는 형질 감염의 치료 후보 및 효율성을 체계적으로 화면 화 하는 무 능력에 의해 장애인 특정 유전자를 조작 하는 기능. 이 침 샘 유기 typic 배양 프로토콜의 목적은 배양 생존 율의 최대 시간을 평가 하 고 전 생체 방사선 치료 후 세포 변화를 특성화 하는 것입니다. 우리는 면역 형광 염색 및 공초점 현미경을 이용 하 여 특정 세포 집단 및 마커가 30 일 배양 기간 동안 존재 하는 시기를 결정 합니다. 또한, 이전에 생체 내 방사선 모델에서 보고 된 세포 마커는 생체 내 조사 되는 배양 물에서 평가 된다. 전진 하는이 방법은 침 샘 기능을 개선 하는 치료제에 대 한 뮤 린 및 인간 타 액 선 조직 반응의 신속한 ex 생체 내 평가를 위한 매력적인 플랫폼입니다.

서론

적절 한 타 액 선 기능은 구강 건강에 필수적 이며 방사선 요법으로 머리와 목 암 치료 다음에 변경 됩니다1. 2017에서, 머리와 목 암의 거의 5만 새로운 케이스는 미국에서 보고 되었다2. 침 샘과 같은 주변 정상 조직에 대 한 방사선 요법의 조직 손상 및 자주 돌이킬 수 없는 효과로 인해, 환자는 종종 심각한 부작용으로 남아 있고 삶의 질을 감소2,3, 4. 방사선 손상으로 인 한 일반적인 합병증은 xerostomia (구강 건조의 주관적인 느낌), 치아 우 식, 씹는 것과 삼 킴, 음성 장애 및 손상 된 경구 마이크로 바이오 메스2 와 같은 증상에서 나타난다 3 , 4.이 현상은 집단적으로 영향 받은 개별에 있는 영양실조 그리고 손상 한 생존에 지도할 수 있습니다5. 이 인구의 침 샘 기능 장애는 잘 문서화 되었지만, 포상 세포에 대 한 손상의 근본적인 기전이 논란이 되었으며, 다른 동물 모델 들 사이에는 약간의 통합이 있다6,7.

침 샘 기능 및 방사선 유발 손상 연구의 현재 방법은 생체 내 모델의 사용을 포함, 불멸의 세포 주, 2 차원 (2-d) 일차 세포 배양 물 및 3 차원 (3-d) 살 리 구 균 배양 물8, 10,11,12. 전통적으로, 불멸의 세포 라인과 2 차원 배양에서 세포 배양 모델은 평평한 표면에 배양 된 단일 층 세포를 포함 하 고 빠르고, 쉽고, 비용 효율적인 실험에 대 한 가치가 있다. 그러나, 인공 세포 배양 조건은 다양 한 조건에 노출 된 세포의 분화 상태 및 생리 적 반응을 변화 시킬 수 있으며, 그 결과는 종종 전체 유기 체 모델14,15로의 번역에 실패 하 게 된다. 또한, 불멸 세포 배양은 DNA 손상16,17에 대 한 침 샘 반응에 중요 한 p53 활성의 변조를 필요로 한다.

3 차원 살 리 구의 배양은 배양 초기 시점에서 줄기 및 전구 세포에 대해 풍부 하 고, 침 샘 세포의이 서브셋 인9,18의 방사선 민감성을 이해 하는데 유용 하였다. 이러한 모든 배양 모델의 중요 한 제한은 세포 외 기질 (ECM) 및 다양 한 층을 통한 세포 세포 상호 작용을 포함 하는 침 샘의 3 차원 구조를 시각화 하는 데 효과가 없으며,이는 타 액 조절에 결정적인 역할을 합니다. 분 비15. 전체적으로 조직의 거동을 포괄 하는 방법에 대 한 필요성이 있지만, 또한 방사선 유발 침 샘의 근본적인 메커니즘을 더 발견 하기 위해 치료의 효과를 연구 하기 위해 실험실 조건 하에서 조작 될 수 있다 장애.

살아있는 조직 절편 및 문화는 이전에 문서화 되었습니다19,20 종종 뇌 조직 상호 작용을 연구 하는 데 사용21. 이전 연구에서, 파 타 액 선 조직은 마우스 로부터 약 50 µm에서 단면화 되었고 최대 48 h까지 배양 하였으며, 생존 율, 세포 사 멸 및 기능을 분석 한 후19를 수행 하였다. Su 외. (2016) 35 µm 또는 50 µm에서 단면화 된 인간 턱 밑 샘 (SMGs)을 14 일 동안 배양 하 여이방법론을 확장 하였다. 제안 된 방법은 30 일 동안 50 µm 및 90 µm 및 배양에 대 한 평가에서 단면화 된 파와 턱 밑 침 샘 모두를 포함 한다는 것에서 전진 합니다. 조직 두께 범위를 절단 하는 능력은 분 비에 대 한 apical-basolateral 극성 및 신경 분포를 포함 하는 세포 프로세스와 관련 된 세포 세포 및 세포-ECM 상호작용을 평가 하는 데 중요 합니다. 더욱이, 침 샘 슬라이스는 배양 중에 조사 되어 방사선 유발 된 타 액 선 손상을 연구 하기 위한이 배양 모델의 타당성을 확인 하였다.

이 침 샘 유기 typic 배양 프로토콜의 목적은 배양 생존 율의 최대 시간을 평가 하 고 전 생체 방사선 치료 후 세포 변화를 특성화 하는 것입니다. 세포 사 멸을 위한, 트리 판 청색 염색, 살아있는 세포 염색 및 면역 조직 염색을 실행 가능한 최대 시간 섹션을 결정 하기 위해 수행 하였다. 공초점 현미경 및 면역 형광 염색은 특정 세포 집단, 형태학 적 구조 및 증식 수준을 평가 하기 위해 활용 되었다. 조직 섹션 배양은 또한이 3-d 모델에서 다양 한 마커에 대 한 방사선의 영향을 확인 하기 위해 이온화 방사선에 노출 되었다. 세포 사 멸 유도, 세포 골격 파괴, 분화 마커의 상실 및 조사 된 전 생체 배양에서의 보상 증식은 생체 내 모델의 이전 연구와 비교 하였다. 이 방법론은 방사선 손상에 따르는 세포 세포 상호 작용의 역할을 조사 하 고 치료 적 개입의 효능을 효율적으로 평가할 수 있는 실험적 모델을 제공 하는 수단을 제공 한다 (유전자 조작 또는 약리학 적 제제 )는 생체 내 모델에 대해 덜 적합할 수 있다.

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프로토콜

1. 진동의 제조

  1. 완충 트레이, 블레이드 부착, 아가 로스 블록 몰드 및 실험실 필름을 포함 하 여 진동의 분리 가능한 구성품을 70% 에탄올로 분무 한 다음 적어도 30 분 동안 자외선 살 균 합니다.
  2. 얼음이 떨어지는 것을 막기 위해 추가의 실험실 필름을 완충 트레이에 놓고 고정 하십시오.
  3. 얼음 실에 분쇄 된 얼음을 채우고 버퍼 트레이에서 실험실 필름을 제거 하 고 1% 페니실린-streptomycin-앰 피 실린 (PSA)로 보충 되는 100 mL의 얼음 차가운 1x 인산 완충 식 염 액 (PBS) 용액으로 완충 트레이를 채웁니다.
  4. 스테인레스 스틸 면도날을 블레이드 홀더에 넣습니다. 스크루 드라이버를 사용 하 여 블레이드의 각도를 강화/풀고 변경 합니다.

2. 진동 체를 사용 하 여 아가 로스 블록 및 절편으로 조직 샘플의 제조

  1. 집게,가 위 및 페인트 브러시를 포함 하 여 필요한 모든 해 부 및 절편 도구를 오토 클레이 브.
  2. 3% 낮은 융 점 아가 로스를 멸 균 된 1x PBS로 준비 하 고 아가 로스가 용액에 녹을 때까지 전자 레인지에 넣습니다. 용액이 끓이 지 않는지 확인 하 고 병을 주기적으로 소용돌이치 세요.
    참고: 저 융 점 오 스를 따뜻한 수조에 보관 하 여 응고 시키는 것을 방지 하십시오. 저 용융 아가 로스는 37 ° c에서 유체 이며 25°c에서 설정 합니다. 그러나, 수 욕은 생리 적 온도에서 조직 주위에 아가 로스를 부 어 하기 위해 40 ° c이 하 이어야 한다.
  3. 침 샘을 분리 하 고 하 부 조직을 2 mL 아이스 콜드 1x PBS에 넣고 1% PSA로 보충 한 후 30 mm의 무 균 배양 접시에 넣습니다.
  4. 멸 균 핀셋을 사용 하 여 1pb+1% PSA 솔루션에서 침 샘을 제거 하 고 임베딩 몰드 하단에 위치 시킵니다. 조직을 커버 하는 액체 3% 낮은 융 점 아가 로스로 금형을 채 웁 니다.
  5. 포 셉을 사용 하 여 조직을 블록의 중간으로 조정 하 고 침 샘을 적절 한 평면에 놓습니다. 하 악 및 파 니 스 땀 샘에 대 한 최적의 횡단면은 수직 평면에 있습니다.
  6. 아가 로스 블록을 얼음에 10 분 동안 넣고 굳 힙 니다.
  7. 조심 스럽게 아가 로스의 바깥 가장자리 주위에 면도날을 실행 하 여 느슨하게 하 고 블록을 1.1 단계에서 UV 멸 균 된 실험실 필름 위로 밀어 넣으십시오.
  8. 면도날을 사용 하 여 타 액 샘이 들어 있는 아가 로스 상자를 잘라냅니다. 단면의 평면이 직선 이며 블록의 반대쪽 (아래로 붙일 서피스)에 평행 인지 확인 합니다. 아가 로스가 조직에 침투 하지 않기 때문에 조직이 잘 지원 될 수 있도록 조직 주위에 너무 많은 아가 로스를 트리밍 하지 마십시오.
  9. 절단 표면에 블록을 부착 하려면 수퍼 접착제를 사용 합니다.
  10. 50 µm 또는 90 µm 두께 0.075 mm/s의 속도 및 100 Hz의 주파수에서의 진동.
    주: 가장 높은 주파수와 가장 낮은 블레이드 속도로 진동을 설정 하면 최적의 슬라이스를 제공 합니다.
  11. 무 균 성을 유지 하기 위해 슬라이스 컬렉션 사이에 70%의 에탄올에 브러시를 배치 하 고, 오토 클레이 브, 천연 헤어 브러시를 사용 하 여 잘 1 mL 얼음 차가운 PBS를 포함 하는 24 웰 조직 배양 접시에 섹션을 수집 합니다.

3. 배양 섹션

  1. 마이크로-주걱 및 집게를 오토 클레이 브.
  2. 소 태아를 포함 하거나 없이 스톡 진동 배양 배지 만들기 세럼 (FBS): 1% PSA, 5µ g/mL 트랜스 페 린으로 보충 되는 DMEM/F12 미디어, 1.1 µ M 하이드로 코르 티 손, 0.1 µ M 레 틴 산, 5 80 µ 표 피 성장 인자, 5mm L 글루타민, 50 µ 겐 타 마이 신 설 페이트 및 10 µ L/mL 미 량 원소 혼합물. 적절 한 양의 FBS를 추가 하 여 0%, 2.5%, 5.0% 또는 10% 솔루션을 만듭니다.
  3. 절편 하기 전에, 미리 데워 진 매체의 300 μ l를 추가 하 고 직경 12mm, 0.4 µm 기 공 크기 멤브레인을 24 웰 조직 배양 판의 각 웰에 삽입 합니다. 매체는 배양을 위한 액체 공기 인터페이스를 만들기 위해 멤브레인 바닥에 도달 해야 합니다.
  4. 37 ° c에서 마이크로 주걱 및 배양 액을 사용 하 여 멤브레인 인서트의 상단에 침 섹션을 부드럽게가 습 5 % co2 및 95% 공기 분위기 인큐베이터에 놓는다.
    1. 약 300 μ l의 1 차 배양 배지를 웰에 넣고 멤브레인 인서트 (약 40 μ l)에 몇 방울 떨어뜨려 서 또는 필요에 따라 매일 첨가 하십시오. 적절 한 배양은 세포가 최대 30 일 전 생체 내에서 생존 하 고 유지 될 수 있음을 보여주었다.

4. 침 샘 섹션의 조사

  1. 코발트-60 (또는이에 상응 하는) 조사 기를 사용 하 여 단일 용량의 방사선 (5Gy)으로 섹션을 처리 합니다.
    1. 온도 변동을 방지 하기 위해 지붕이 있는 스티로폼 용기를 사용 하 여 방사선 조사 시설에 운송 섹션을 전송 합니다. 또한, 미디어가 배양 뚜껑에 튀 지 않고 오염을 유도 하지 않도록 실험실 인큐베이터로 반송 하는 동안 주의가 필요 합니다.
    2. 침 샘 섹션을 포함 하는 24 웰 플레이트를 방사선 공급원에서 80 센티미터, 32 "x 32" 방사선 분야의 중심에 배치 합니다. 방사선 량 계산 및 조사 기의 해당 시간은 계측기와 코발트-60 붕괴에 따라 달라 집니다.
  2. 섹션 3에 설명 된 대로 이러한 섹션을 계속 모니터링 하 고 배양 합니다.

5. 생존 염색

  1. 오래 된 미디어를 흡 기 하 고 멸 균으로 두 번 슬라이스를 세척, 미리 따뜻하게 1x PBS.
  2. 염색 부분에는 트리 판 블루 염료가 있습니다.
    1. 마이크로 주걱을 사용 하 여 문화에서 유리 슬라이드로 슬라이스를 이동 합니다.
    2. 조직 (10 ~ 20 µ L)을 커버 하기에 충분 한 부피의 진동에 0.4% 트리 판 블루 솔루션을 추가 합니다.
    3. 염료가 조직에 침투 하기 위해 트리 판 분 동안 실 온 (RT)에서 슬라이스를 배양 합니다. 생존 하지 않은 세포는 청색으로 얼룩진 것 이며, 생존 가능한 세포는 얼룩 지지 않습니다.
  3. 얼룩 부분은 칼 세 인, AM 살 세포 염료입니다.
    1. 24 웰 플레이트 (µ L)의 한 우물에서 부분을 커버 하기 위해 충분 한 양의 얼룩을 추가 하십시오.
    2. 염료 침투가 가능 하도록 RT에서 15 분 동안 슬라이스를 배양 합니다.
    3. 조심 스럽게 우물에서 섹션을 제거 하 고 유리 슬라이드에 놓습니다. 마운팅 미디어 1 방울로 슬라이스를 마운트합니다.
    4. 488 nm 및 515 nm의 여기/방출 파장의 형광 현미경에 대 한 이미지 섹션.

6. 항 체 염색 진동 섹션

참고: 다음은 Ki-67에 특이 적인 일반적인 항 체 염색 프로토콜을 제공 합니다. 그러나,이 프로토콜은 임의의 항 체와 함께 사용 될 수 있다. 별도의 언급이 없는 한 모든 세척은 RT에서 진행 됩니다.

  1. 다중 우물 조직 배양 접시에, 미디어를 흡 인 하 고 멸 균 1x PBS로 적어도 2 배를 씻으십시오.
  2. 4°c에서 밤새 4% 파라 포름알데히드 (PFA)를 사용 하 여 섹션을 수정 합니다.
  3. 4% PFA를 흡 기 하 고 PBT를 사용 하 여 3 배를 세척 하 고, 0.1% 트리톤 X-100).
    참고: 섹션은 4°c에서 1x PBS에 저장 하 고 나중에 염색 할 수 있습니다. 이 원고에서 테스트 한 최대 보관 시간은 3 주 였습니다. 필요한 경우 개별 사용자가 더 긴 저장 시간을 최적화 해야 합니다.
  4. 0.3% 트리톤 X-100을 사용 하 여 30 분 동안 1 PBS에서의 투과 섹션
    참고:이 단계는 특정 항 체 염색 및 투과를 위해 수정 및 최적화 될 수 있습니다.
  5. 의 침투를 차단 합니다.
  6. 1% BSA와 0.1% 트리톤 X 100 (PBT)와 함께 5 분 동안 슬라이스 3x를 씻으십시오.
  7. 1% 정상 염소 세럼 1%로 차단 제로 슬라이스를 차단 합니다.
  8. PBT로 5 분 동안 슬라이스 3x를 씻으십시오.
  9. 1% BSA에서 500 µ L 항 Ki67 토끼 단 클론 항 체를 1x PBS로 희석 하 여 4°c에서 밤새 슬라이스를 배양 한다.
    참고: phalloidin 염색에 대 한, 6.9 단계를 건너 뛰고 특정 phalloidin에 대 한 프로토콜을 사용 하 여 계속. DNA 반대 얼룩의 경우, 6.15 단계로 건너뜁니다.
  10. Ki67 토끼 단 클론 항 체를 흡입 합니다.
  11. 1x PBS에서 5 분 동안 슬라이스 6 배를 씻으십시오.
  12. Ki67 항 체와 호환 되는 형광 공액 2 차 항 체의 500 µ L의 슬라이스를 1.5 h의 RT에서 1% BSA에 1x PBS로 희석 하 여 배양 하 여 빛 으로부터 보호 한다.
    주: 사용 되는 이차 항 체에 기초 하 여, 이차 항 체와의 인큐베이션 시간은 개별 사용자에 의해 더욱 최적화 될 수 있다. 또한, 2 차 항 체는 광 감 응 이다. 모든 후속 세척은 어둠 속에서 수행 되어야 합니다.
  13. 2 차 항 체를 흡 기.
  14. 1x PBS로 5 분 동안 슬라이스를 3 배 씻으십시오.
  15. 탈 이온 수에서 5 분간 슬라이스를 씻으십시오.
  16. RT에서 20 분 동안 DAPI (1 µ를 사용 하 여 슬라이스를 반염색 합니다.
  17. 슬라이스 (한 번)를 탈 이온 수에서 5 분간 씻으십시오.
  18. 장착 용지의 한 방울 (~ 40 µ L)으로 슬라이스를 마운트합니다. 과잉 기포를 방지 하려면 45 ° 각도로 시작 하 여 슬라이드의 마운팅 미디어에 커버 슬립을 천천히 놓습니다.
    1. 커버 슬립으로 두꺼운 부분을 분쇄 하는 것을 방지 하려면 각 슬라이스를 스페이서와 함께 장착 합니다. 스페이서는 조직 섹션 주위에 있는 정사각형에 진공 그리스의 테두리를 배치 하 여 만들 수 있습니다.
    2. 커버 슬립을 배치할 때 커버 슬립의 가장자리를 진공 그리스로 밀봉 할 수 있습니다. 엄지 손가락으로 커버 슬립의 가장자리를 아래로 눌러 슬라이드에 단단히 부착 합니다. 또는 투명 매니큐어를 사용 하 여 커버 슬립을 현미경 슬라이드에 밀봉 하십시오.

7. 이미징 진동 섹션

  1. 염색 후 5 일 이내에 염색 된 슬라이드를 이미지 합니다.
  2. 공초점 현미경을 이용 하 여 스테인드 진동 조각의 광학 단면을 얻는다. 공초점 현미경을 사용 하 여 정의 된 스텝 사이즈로 z-스택을 획득 하거나 사용자의 실험 설계에 따라 개별 이미지를 촬영 합니다. 공초점 수집 후 모든 컴퓨터 화면에서 이미지를 검사할 수 있습니다.
    참고: 진동 슬라이스 두께 때문에 공초점 현미경 또는 z-스택 기능이 있는 스코프를 사용 하 여 샘플 내 세부 사항을 시각화할 것을 권장 합니다. 이 원고에 사용 된 이미지의 경우 63x 오일 목표가 사용 되었습니다. 그러나이는 개별 사용자 및 사용 된 특정 범위에 따라 조정 되 고 추가로 수정 될 수 있습니다. 가장 작은 광학적으로 확인 가능한 구조에 대해 X 및 Y에서 2.5 픽셀의 추정 된 나이 퀴 스 트 샘플링을 사용 하 여 각 대물 렌즈 및 확대/축소 계수에 권장 되는 픽셀 해상도. 그러나 일부 주석 가들은 2.3 픽셀을 제안 하 고 나머지는 2.8 픽셀을 제안 합니다. 이러한 계산을 수행 하는 방법에 대 한 자세한 내용은 생물학적 공초점 현미경 안내서 (22 )를 참조 하십시오.

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결과

1 차 2 차원 배양은 소 혈 청 (FBS) 보충 된 배지에서 성장 되 고, 일차 3 차원 살 리 구 배양은 전형적으로 무 혈 청 조건10,11에서 배양 된다. 추가적으로, 침 샘에서의 진동 배양을 활용 한 두 개의 이전 연구는 보충 된 배지 FBS을0% 또는 10%로 배양 하였다. 마우스 턱 밑의 슬라이스는 50 µm의 두께에서 단면화 되어 진동 및 최적 배양 조건을 사용 하 여 일련의 FBS 농도 (0%, 2.5%, 5.0% 및 10%)를 사용 하 여 결정 하였다. 생존 특성을 결정 하기 위해, 밝은 전계 현미경 이미지는 배양 일 1, 4, 7, 14 및 30 사후 절편에서 촬영 하였다 (그림 1). 추가적...

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토론

타 액 선 연구는 불멸 화 된 2-d 배양 물, 일차 2-d 배양 물, 3 차원 살 균 구 배양 물, 기저 생물학 및 생리학에 대 한 질문을 확인 하기 위해 배아에서의 3 차원 장기 배양을 포함 한 다양 한 문화권 모델을 활용 하 고 있습니다. 이러한 문화 모델 연구 질문의 다양 한 배열에 걸쳐 통찰력 있는 정보를 굴복 하 고 침 연구에서 중요 한 도구를 계속 됩니다. 이러한 배양 모델의 한계는 불멸 화 동안의 p53 활성의 변조, 일차 배양의 일시적인 생존 능력, 분화 및 분 비 단백질의 손실 및 세포 세포, 세포-ECM 및 극성을 평가 하는 무 능력을 포함 한다 성인 조직에서의 상호 작용. 첫 번째 3 차원 유기 형 슬라이스 배양 (진동으로 단면화 된 배양 물) 침 샘에 대 한 방법은 200818에 출판 되었다; 그러나이 기술은 다른 분야에서 빈번 하 게 사용 함에도 불구 하 고이 필드에서 크게 미달 되었습니다. 48 h에 대 한 작업 배양 된이 섹션은 방사선 치료 후 만성 효과에 ...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작품은 애리조나 대학 연구 및 발견의 대학과 건강의 국립 연구소에서 제공 하는 파일럿 기금에 의해 부분적으로 지원 되었다 (R01 DE023534) 키 어스 틴. 암 생물학 연수 교부 금, T32CA009213, 원 유 웡에 대 한 급여를 제공 했다. 저자는 그의 귀중 한 기술 공헌에 대 한 m. 쌀에 감사 하 고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Vibratome VT1000SLeica Biosystems단면 절단용 Vibratome
양날 스테인리스 스틸 면도날전자 현미경 과학72000
AgaroseFisher ScientificBP165-25저용융
파라필름Sigma-AldrichP6543
페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 BLonza17-745HPSA
24웰 플레이트CellTreat229124
Dulbecco' s 인산염 완충 식염수(DPBS)Gibco14190-144
록타이트 울트라겔 제어 초강력접착제 록타이트N/A철물점에서 구입
Natural Red Sable Round PaintbrushPrinceton Art & Brush Co7400R-2
겐타마이신 설페이트 Fisher ScientificICN1676045
트랜스페린시그마-알드리치T-8158-100mg
L-글루타트민Gibco25030-081
미량 원소MP BiomedicalsICN1676549
인슐린피셔 사이언티픽12585014
표피 성장 인자Corning354001
HydrocortisoneSigma-AldrichH0888
레티노산Fisher ScientificR2625-50MG
소 태아 혈청GibcoA3160602
DMEM/F12 미디어Corning150-90-CV
밀리셀 세포 배양 인서트Millipore 시그마PICM0125012mm, 24웰 플레이트용 0.4um 기공 크기
0.4% Trypan BlueSigma-AldrichT8154
LIVE/DEAD 세포 이미징 키트(488/570)Thermo-FisherR37601LIVE 염료 성분만 사용
Anti-Ki-67 항체세포 신호 기술9129S
Anti-E-cadherin 항체세포 신호 전달 기술3195S
Anti-Cleaved Caspase-3 항체세포 신호 기술9661L
Anti-SMA 항체Sigma-AldrichC6198
Anti-amylase 항체Sigma-AldrichA8273
Anti-CD31 항체Abcamab28364
Anti-TUBB3 항체세포 신호 기술5568S
Alexa Fluor 594 항체 라벨링 키트: Thermo-FisherA20185
Alexa Fluor 594, Phalloidin,Thermo-FisherA12381
소 혈청, 알부민Fisher ScientificBP1600
Triton X-100Sigma-Aldrich21568-2500
파라포름알데히드, Prills,Fisher Scientific, 5027632
New England, 핵 차단제Perkin Elmer2346249더 이상 판매되지 않음
DAPICell Signaling Technology4083S
Prolong Gold Antifade Mounting MediaInvitrogenP36934
Leica SPSII Spectral ConfocalLeica BiosystemsN/A컨포칼 이미징용
Leica DMIL Inverted Phase Contrast MicroscopeLeica BiosystemsN/A
코발트-60 텔레테라피 기구Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80N/A
아맥 박스,컨테이너 스토어지우기 60140아가로스 블록 몰드
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참고문헌

  1. Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review. Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
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