마우스 유방 동맥에 Cre 발현 아데노 바이러스의 경막 주사를 통해 유방암 모델링

요약

이 프로토콜의 목표는 마우스 유방 땀샘으로 Cre 발현 아데노바이러스의 자궁 내 주입에 기초한 새로운 유방암 모델링 접근을 기술하는 것입니다. 이 접근은 세포 모형 및 기관 특정 조작을 시간적으로 통제한 방식으로 oncogenic 사건을 둘 다 허용합니다.

초록

유방암은 이기종 질병, 기원의 다른 세포 와 종양 발생 이벤트 사이의 복잡 한 상호 작용 때문일 수 있습니다. 마우스 모델은 이러한 복잡한 프로세스에 대한 통찰력을 얻는 데 중요한 역할을 합니다. 많은 마우스 모형이 유방 종양발생에 각종 종양 발생및 기원의 세포의 기여를 공부하기 위하여 개발되었더라도, 이 모형은 수시로 세포 모형 또는 기관 특정이 아니거나 유방 종양 발생의 개시를 유도할 수 없습니다 일시적으로 제어 방식. 여기에서 우리는 마우스 유방 땀샘 (MGs)으로 Cre 발현 아데노 바이러스 (Ad-Cre)의 경막 주사에 근거를 둔 유방암 마우스 모형의 새로운 모형을 생성하는 프로토콜을 기술합니다. 유선 덕트에 Ad-Cre를 직접 주입하기 때문에이 접근법은 다른 장기에서 원치 않는 암 유도없이 MG 특정입니다. 경막 주사 절차는 MG 발달의 다른 단계에서 마우스에서 수행 될 수있다 (따라서, 그것은 암 유도의 시간적 제어를 허용, ~에서 시작 ~3-4 나이의 주). 세포 형 특이성은 아데노 바이러스 벡터에서 Cre 발현을 유도하기 위해 상이한 세포 형 특이적 프로모터를 사용하여 달성될 수 있다. 우리는 발광 및 기저 유방 상피 세포 (MECs)가 각각 케라틴 8 또는 케라틴 5 프로모터의 통제하에 Ad-Cre의 경막 주사를 통해 Cre /loxP 기반 유전자 조작을 위해 단단히 표적으로 할 수 있음을 보여줍니다. 조건부 Cre 리포터(예를 들어, Cre/loxP-유도성 Rosa26-YFP 리포터)를 통합함으로써, 우리는 Ad-Cre에 의해 표적화된 MECs, 및 그로부터 유래된 종양 세포가, 유도 내 주사 후 리포터 양성 세포를 따라 추적될 수 있음을 보여준다.

서론

이 방법의 전반적인 목표는 마우스 MG에 Ad-Cre의 경내 주입에 근거를 둔 새로운 유방암 모델링 접근을 개발하는 것입니다. Cre/loxP 재조합 기반 유전 적 접근법은 마우스에서 인간 유방암을 모델링하는 데 널리 사용되어 왔습니다. Cre/loxP 기반 유방암 마우스 모델의 1세대는 MEC 특이적 프로모터(예: 광ME및 기저 MEC의 일부인 MMTV-Cre) 및 기저 MEC의 일부, Wap-Cre 및 발광 선조 및 폐포 광도 MEC, K14-Cre 기저 및 발광 MEC의 일부에 대한 Blg-Cre 1, 2,^{3,4,5)6, 7명 , 8개 , 9}. 그러나, 이러한 Cre 형질전환 선은 Cre 발현의 공간 제어를....

프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 브리검 및 여성 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 플록스 마우스의 생성 및 유지 보수

1. 유방암 관련 플록스 조건부 녹아웃(예: Trp53^Tm1Brn [Trp53^L/L], Brca1Aash [Brca1^L/L])또는 조건부 노크인 마우스 라인(예: GT(ROSA)26Sor^{tm1(Pik3ca*H1047R)이건)} 잭슨 연구소 (JAX) 또는 인간 암 컨소시엄의 NCI 마우스 모델 (MMHCC) 저장소에서. 또한, Cre-mediaed 재결합을 거치는 MEC의 추격을 용이하게 하기 위해, 조건부 크레 리포터 라인은 또한 JAX(예를 들어, GT(ROSA)26Sor^{tm1(EYFP)Cos[R26Y로} 지칭된다]로부터 얻을 수 있다.
2. R26Y 동형접합체 리포터 마우스또는 R26Y 리포터 대립구를 운반하는 동형접합 마우스를 가진 품종 Trp53^L/L 동....

결과

R26Y 및 Trp53^L 대두에 대한 대표적인 PCR 지질형 검사 결과는 도1에 나타내고 있다.

원칙적으로, 모든 10개의 MGs는 모두 경감 내 주사 절차를 실시할 수 있지만, 실질적으로, 두 개의 제4 인큐니탈 MG는 일반적으로주입을 위해 선택되며, 이는 그들의 접근성및 더 큰 MG 크기(도 2)로 인해 선택된다. 수술 중, 소독되고 깔끔한 작업 영역을 유지하고 멸균 도구로 절차를 수행하는 것이중요합니다 (그림 3). 자궁 내 주사 동안, 주사 혼합물에 청색 염료(예를 들어, 브로모페놀 블루)를 포함시키는 것은 전체 덕트 트리내로 Ad-Cre의 성공.......

토론

MECs의 다른 하위 집단에서 유방 종양을 유도하기위한이 접근법의 성공은 적절한 세포 유형 특이적 프로모터를 선택하는 것뿐만 아니라 (Cre 발현을 유도하기 위해) 뿐만 아니라 자궁 내 주사 절차 자체에 의존합니다. 이 접근의 뒤에 아이디어는 주입된 Ad-Cre 바이러스가 루멘을 가진 은폐한 구조물인 덕트 트리에서 유지된다는 것입니다, 그러므로, 단지 MECs는 바이러스에 드러내고 Ad-Cre에 의해 감염됩니다. 유방 덕트 내의 제한된 루멘 공간으로 인해 각 MG (즉, ~ 3-5 μL)에 주사 혼합물의 소량만 주입하는 것이 중요합니다. 주입된 부피는 또한 마우스의 나이에 따라 조정되어야 한다(즉, 3-4주령 마우스에 주입될 때 더 작은 부피를 사용해야 한다). 주입된 액체의 부피가 주입 및 제한된 덕트 루멘 공간에서의 압력으로 인해 과도할 때, 유체는 기질로 상피 층을 통해 "밀려나게"될 수 있으며, 기질 세포에서 원치 않는 바이러스 감염으로 이어질 수 있습니다.

세포형 특이성.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
33게이지 바늘	Hamilton	7803-05	포인트 스타일 3 무딘
7mm 반사 클립	Braintree Scientific	RF7 CS
아데노바이러스, Ad-K5-Cre	아이오와 대학교 바이러스 벡터 코어	Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547)
아데노바이러스, Ad-K8-Cre	아이오와 대학교 바이러스 벡터 코어	Ad5mK8-nlsCre
알코올	피셔	HC800-1GAL	70% 사용 준비
비오틴화 CD31	eBiosciences	13-0311-85
비오틴화 CD45	eBiosciences	13-0451-85
비오틴화 TER119	eBiosciences	13-5921-85
브로모페놀 블루	시그마-알드리치	B0126-25G
CD24-AF-700	BD 파밍겐	564237
CD24-PE	eBiosciences	12-0242-83
CD29-APC	eBiosciences	17-0291-82
CD29-PE	eBiosciences	12-0291-82
헤어 리무버 로션	Nair		9
Oz Hamilton 주사기	Hamilton	7636-01	0.025 mL
요오드 포머	베타딘		10% 포비돈-요오드
이소플루란	박스터	NDC 10019-360-40	1-2.5%
Loxicam	Norbrook	NDC 55529-040-10	5 mg/ml
윤활제 눈 연고	Akorn	NDC 17478-062-35
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