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방법 논문

비교 약물 평가를 위한 호스트로 Zebrafish 애벌레를 사용하여 췌장암의 환자 유래 이종 이종이식 모형

8.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59507

⸱

2019년 4월 30일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Key Laboratory of Metabolism and Molecular Medicine, Ministry of Education, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, 2National Human Genetic Resources Sharing Service Platform (2005DKA21300), 3Fudan University Shanghai Cancer Center, 4Department of Pancreatic Surgery, Fudan University Shanghai Cancer Center, 5Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, 6Pancreatic Cancer Institute, Fudan University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 애벌레 얼룩말어를 숙주로서 사용하여 바이러스 기반 이중 형광 표지 종양 이종이식 모델에서 최적화 절차를 설명합니다. 이 이기종 이종이식 모델은 생체 내 췌장암 미세환경의 조직 조성을 모방하고 맞춤형 zPDX(제브라피쉬 환자 유래 이종이식) 모델에서 약물 반응을 평가하기 위한 보다 정밀한 도구역할을 한다.

초록

환자 유래 종양 이종이식(PDX) 및 세포 유래 종양 이종이식(CDX)은 전임상 평가, 약물 지도 및 기초 암 연구를 위한 중요한 기술입니다. 전통적인 호스트 마우스에 있는 PDX 모형의 세대는 시간 소모적이고 견본의 작은 비율을 위해서만 작동합니다. 최근에는 제브라피쉬 PDX(zPDX)가 소규모 및 고효율의 특성을 가진 독특한 숙주 시스템으로 부상하고 있다. 여기서, 우리는 zPDX 모델에서 비교 화학요법 평가를 위한 이중 형광 표지종양 이종이식 모델을 생성하기 위한 최적화된 방법론을 기술한다. 종양 세포 및 섬유아세포는 상이한 배양 조건에서 갓 수확되거나 냉동된 췌장암 조직으로부터 농축되었다. 두 세포 군 모두 녹색 또는 적색 형광 단백질을 발현하는 렌티바이러스뿐만 아니라 항세포자멸 유전자 BCL2L1에의해 표지되었다. 형질감염된 세포를 미리 혼합하고 32°C에서 변형된 E3 배지에서 사육한 2dpf 애벌레 제브라피시내로 공동 주입하였다. 이종이식 모델은 화학요법 약물 및/또는 BCL2L1 억제제에 의해 처리되었고, 종양 세포와 섬유아세포의 부동체를 동시에 조사하였다. 요약하면, 이 프로토콜은 연구원이 이기종 종양 미세 환경을 가진 다량의 zPDX 모델을 신속하게 생성할 수 있게 하고 약물 후보의 효율성을 평가하는 데 있어 더 긴 관찰 창과 보다 정확한 정량을 제공한다.

서론

정밀 종양학은 개별 적인 환자를 위한 가장유익한 치료 전략을 찾아내기 위하여 목표 1. 현재, 시험관내 1차 배양, 체외 오르가노이드배양 2, 및 환자 유래 이종이식(PDX)과 같은 수많은 전임상 모델이 유기체 배양 전후의 마우스에서 진단 및 스크리컬/평가전형에 대해 제안되고 있다. 치료 선택3. 면역성 면역성 마우스로 인간 원발성 암세포를 주사하여 생성된 PDX 모델은 임상 종양학에서 맞춤 약물 스크리닝을 위한 가장 유망한 도구 중 하나이며,4. 시험관내 배양된 세포주와는 달리, PDX 모델은 일반적으로 생체 내 종양 환경의 무결성과 이질성을 보존하고, 상이한 종양 환자의 다양성 및 특이성 특성을 더 잘 모방하고, 따라서, 환자의 잠재적 인 의료 결과4. 그러나, 마우스에 있는 PDX 모형의 생성은 다중 단 실험을 위한 충분한 세포 그리고 모형을 집합하기 위하여 고품질 참을성 있는 견본 및 달의 달을 요구하고, 이종이식의 세포/유전 조성은 본래의 그것에서 표류할 수 있습니다 환자의생검. 마우스 PDX 모형을 설치하기위한 성공률은 또한 낮습니다, 임상 사례에서 광범위하게 실행되기 어렵게 만들기. 췌장암 같이 급속하게 진행된 암을 운반하는 환자를 위해, 그(것)들은 PDX 실험에서 시간에 귀중한 정보를 장악하지 못할 수 있습니다.

지난 몇 년 동안, 제브라피쉬는 CDX(세포 유래 종양 이종이식) 모델뿐만 아니라 PDX 모델5,6,7,8,9, 10. 척추 동물로, 제브라피쉬는 유전학과 생리학 모두에서 포유류와 충분한 유사성을 항구, 두 가지 중요한 장점 : 투명성과 크기11작은. Zebrafish는 또한 매우 fecundity, 그리고 근친 유충의 수백 성인의 한 쌍에서 몇 일 이내에 얻을 수 있습니다12. 여러 연구는 암 질환의 형질 전환 및 이종이식 모델을 모두 생성하기 위해 제브라피시를 고용했다13,14. 마우스 이종이식에 비해, 제브라피시 이종이식은 단일 세포 해상도에서 추적을 허용합니다. 일정량의 인간 조직은 수백 개의 제브라피시 PDX 모델(zPDXs)을 생성할 수 있는 반면, 단지 몇 마리의 마우스 PDX모델(15,16)을생성하기에 충분할 수 있다. 게다가, 2-5 dpf에 있는 제브라피시 유충은 이미 간 및 신장과 같은 완전한 순환계 및 신진 대사 기관을 개발하고, 그러나 면역 계통 17은, 나머지 노른자 낭은 자연적인 3D 매체인 동안, 약물 검열, 약 에 이상적 저항성 검사 및종양 이동 관찰 6,18,19,20,21.

임상 사용을 위한 검열/시험 플랫폼으로 zPDX를 사용하는 궁극적인 시도로, 여기에서, 우리는 더 적은 비용으로 더 적은 세포를 사용하여 짧은 시간 안에 생체 내 후보 약물 평가를 허용하는 췌장암의 zPDX 모형을 위한 최적화된 제안을 기술합니다. zPDX 6,9,10에대한 이전 참조와 비교하여, 우리는 임상 개인화 진단을위한 시스템을 보다 실현 가능하고 신뢰할 수 있도록 몇 가지 최적화를 도입했습니다 : 1) 다른 세포를 미리 분류 1 차적인 종양 조직에 있는 단 및 추가 실험의 앞에 1 주일 세포를 위한 안정화; 2) 인간 세포를 표지하고 렌티바이러스 기반 의 유전자 변형을 통해 이종이식에서 세포 생존능력을 향상시키는 단계; 3) 영양 보충제 (포도당 및 글루타민) 및 온도 모두에서 제브라피시 배양 상태를 최적화; 4) 비교 방식으로 상이한 세포 유형의 약물 반응을 정량화한다. 우리는 또한 몇 가지 보충 재료를 추가하여 사출 용액을 변경했습니다. 전부, 그 개선은 후보 약물의 반응을 평가하기 위하여 믿을 수 있는 공구로 이용될 수 있는 zebrafish 호스트에 있는 더 참을성 있는 이종이식을 빨리 생성하는 가능성을 제공합니다.

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프로토콜

모든 동물 절차는 푸단 대학의 동물 윤리위원회의 지침에 따라 승인되고 따라졌으며 모든 췌장암 표본은 푸단 대학 상하이 암 센터에서 얻었습니다. FUSCC 윤리위원회로부터 윤리적 승인을 받았으며, 각 환자로부터 서면 동의를 얻었습니다.

1. 미세 주입을위한 장비 준비

  1. 사출 플레이트를 준비합니다.
    1. E3 용액에 용해된 1% 아가로즈 용액 50 mL 용액을 준비합니다(이중 증류수에 0.6 g/L 수족관 소금 + 0.01 mg/L 메틸렌 블루). 아가로즈가 녹을 때까지 용액을 끓입니다.
    2. 아가로즈 용액 50 mL을 10cm 페트리 접시에 부은 다음 제브라피쉬 배아 고정 금형을 표면에 놓습니다. 아가로즈 용액이 고형화되면 금형을 제거합니다.
    3. 주입 플레이트에 20 mL의 E3 용액을 추가하고 장기 보관을 위해 4 °C에서 유지하십시오.
  2. 주사 바늘을 준비.
    1. 바늘 풀러에 두 개의 바늘에 0.9mm의 내부 치수와 10cm 유리 모세관을 당깁니다.
    2. 집게를 사용하여 바늘의 끝을 잘라 현미경 아래에 개구부를 만듭니다.

2. 이식용 배아 준비

  1. 오후 7~9시에 짝짓기 탱크에 1~2쌍의 성체 얼룩말물고기를 놓고 다음날 오전 8시경 수정란을 채취합니다.
  2. 교배 탱크에서 40 mL의 신선한 E3 용액을 함유 한 페트리 접시로 기름지게 한 계란을 옮기고 28.5 °C에서 배양하십시오.
  3. E3 용액에서 8 시간 의 배양 후, 색소 침착을 억제하기 위해 E3 용액에 0.03 % 1-페닐-2 티오레아 (PTU)를 추가하십시오. 28.5 °C에서 48 hpf까지 0.03 % PTU로 E3 용액에서 배아를 배양하십시오. 이 단계는 사육 된 캐스퍼 돌연변이 제브라피시를 사용하는 경우 생략 할 수 있습니다.

3. 신선한 외과 췌장암 견본 또는 냉동 조직에서 1 차적인 인간 세포의 격리 그리고 문화

  1. 복부 수술 중 약 1cm3 크기의 인간 췌장암 조직의 표본을 얻고 즉시 조직을 성장 매체로 옮기고 (10 % 태아 소 혈청 (FBS), 10 μM Y-27632, 100 μg / mL 프리모신, 10 μg / mL 퍼크레신으로 즉시 조직을 옮긴다. 디하이드로 클로라이드, 10 mM 니코틴 아미드 및 1 % 페니실린 스트렙토 마이신).
  2. 췌장암 샘플을 페트리 접시로 옮기고 주변 괴사 조직, 지방 조직 및 결합 조직을 제거합니다.
  3. 인산완충액(PBS)으로 암 조직을 5-6회 헹구고 메스를 사용하여 조직을 1mm 3개로 자릅니다.
  4. 파쇄된 조직을 50 mL 튜브에 5 mL로 옮기고 콜라게나아제 타입 IV, 히알루로나이다제 및 DNase I을 최종 농도200 단위/mL, 100 mg/L 및 20 mg/L로 추가합니다. 혼합물을 위아래로 파이펫하여 잘 섞습니다.
  5. 혼합물을 37°C에서 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 15-20분 동안 배양한다.
  6. 소화가 완료되면 튜브와 원심분리기에 7 mL를 넣고 110 x g에서 5분 동안 4°C에서 추가합니다.
  7. 상급체를 Decant하고 DMEM에서 종양 혼합물을 다시 중단시운다.
  8. 전체 성장 매체의 3 mL에서 6cm 페트리 접시에 혼합물을 플레이트 (10 % FBS, 20 μg / mL 인슐린, 100 ng / mL bFGF, 10 ng / mL EGF, 10 μM Y-27632, 100 μg / mL 프리모신, 10g / mL 니코테린, 10g / mL 의 mL 디에시엔 , 1 % 페니실린 연쇄상 구균). 셀을 두 그룹으로 분리합니다.
  9. I군에서는, 췌장암 섬유아세포의 100x 억제제를 48시간 후에 배지에 첨가하여 자란 섬유아세포를 제거하고, 암세포를 주요 세포 유형으로 남긴다; 그룹 II에서, 섬유아세포는 1주일 안에 암세포를 능가할 것이다.
  10. 세포 밀도/순도에 따라 1-2주 동안 두 세포 군을 배양하고 3일마다 배지를 변경한다. 두 그룹 I & II의 예상 세포 유형은 typic 성공적인 실험에서 98% 이상의 비율을 차지할 수 있습니다.

4. 반대로 세포 자멸 유전자 BCL2L1 (BCL-XL) 및 다른 형광 성 단백질을 별도로 발현하는 렌티바이러스로 세포에 라벨을 붙이기

  1. 렌티바이러스 생산
    1. 플레이트 3 x 106 HEK 293T 세포를 완전한 DMEM 배지(DMEM+ 10% FBS로 공급됨)에 10 cm 접시및 배양하여 37°C에서 5% 이산화탄소 인큐베이터에 배양한다. 형질전환 전에 배지를 6 mL의 무혈청 배지로 교체하십시오.
    2. 준비 솔루션 A: 8 μg의 BCL2L1-렌티바이러스벡터(pCDH-EF1α-mKate2-E2A-BCL2L1-WPRE 또는 pCDH-EF1α-eGFP-E2A-BCL2L1-WPRE), pVSVG 2.4 μg, 4 μg pMDL(개그/폴), 1.6 μg의 pREV 및 무혈청 DMEM 총 부피 500 μL. 부드럽게 파이펫 혼합물을 여러 번 넣고 실온에서 5 분 동안 놓습니다.
    3. 용액 B: 460 μL 무혈청 DMEM에서 PEI(폴리에틸렌아이민)의 40 μL. 실온에서 5분 동안 놓습니다.
    4. 용액 B를 용액 A에 천천히 넣고 튜브를 실온에서 30분 동안 둡니다.
    5. 4.1.1단계에서 제조된 HEK 293T 세포 배양 접시에 최종 혼합물을 넣고 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다. 12시간 후, 전체 DMEM 배지의 5mL를 추가합니다. 48 시간 후, 렌티 바이러스를 함유 하는 배지를 수확.
    6. 0.45 μm 멸균 필터를 사용하여 상급체를 걸류, 농도 컬럼에 상급체를 추가하고, 원심분리기를 6,000 x g에서 25-30분 동안 4°C에서. 튜브 당 100 μL의 렌티바이러스 알리쿼트는 -80°C에서 만들어지고 저장된다.
  2. 1 차 세포의 감염
    1. 종자 세포(군 I&II)를 30-40% 밀도를 가진 12웰 플레이트에 감염시키고 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 세포를 배양한다.
    2. 4 시간 동안 8 μg / mL의 폴리브렌을 함유 한 500 μL의 무혈청 배지로 매체를 교체하십시오. 이어서, 렌티바이러스의 100 μL을 배지에 추가한다(그룹 I또는 그룹 II에 대한 mKate2-E2A-BCL2L1에 대한 eGFP-E2A-BCL2L1). 12 시간 후, 완전한 매체의 1 mL로 매체를 교체하십시오.
    3. 48 시간 후에 형광 마커를 확인하십시오.
    4. 감염된 세포를 수확하고 1:1 비율로 10 6/mL의 최종 농도로 혼합합니다.
    5. 세포를 110 x g에서 5 분 동안 원심 분리하고 50 μL의 주사 용액 (10 % FBS, 0.05 % 히알루 론산 나트륨 염, 0.05 % 메틸 셀룰로오스)에서 세포 혼합물을 다시 현탁시한다.

5. 제브라피시에 혼합 세포 현탁액 주입

  1. E3 물에 10x 트리카인 용액을 첨가하여 제브라피시 유충을 마취시키고 유충(2.3단계에서)을 변형된 E3(E31 g/L 포도당 과 5 mmol/L-글루타민)로 채워진 주사판으로 옮김을 옮긴다.
  2. 혼합 세포 현탁액 25 μL을 마이크로 모세 혈관 바늘에 채우고 바늘을 마이크로 주입 조작기에 삽입하십시오.
  3. 사출 압력과 시간을 설정합니다. 48 hpf 제브라피시의 노른자 낭에 50-80 세포 (~8 nL)를 주입하십시오.

6. 제일이식 제브라피시(zPDX 모델)의 문화

  1. 32°C에서 40 mL의 혼합 용액(1 g/L 포도당과 5 mmol/L-글루타민이 있는 E3 용액)으로 이식후 제브라피시 유충을 옮긴 후를 옮김처리합니다.

7. 제브라피시 이식에 대한 약물 투여 및 종양 세포/섬유아세포 비능력 평가

  1. 젬시타빈/나비토클락의 최적 농도 결정.
    1. 10개의 야생형 제브라피시 배아를 48 hpf에 12웰 플레이트의 각 우물에 넣습니다.
    2. 각 우물에 젬시타빈 또는 나비토클락스의 다른 농도를 추가하고 2 일 동안 32 °C에서 배양하십시오.
    3. 2 일 후, 제브라피쉬 유충이 유충이 유의한 기형 및 비정상적인 행동을 나타내지 않는 젬시타빈 및 navitoclax의 최대 허용 오차 복용량 (MTD)을 계산하고 작업 농도가 MTD 이하로 설정됩니다.
  2. 젬시타빈/나비토클락스로 zPDX 모델 의 치료.
    1. 12개의 우물 판의 각 우물에 10개의 이종이식 유충을 놓습니다.
    2. 유충을 4개의 그룹으로 나누고, 0.1% DMSO를 함유하는 E3의 대조군을 치료하고, 다른 군을 5 μg/mL 젬시타빈 및/또는 50 μM navitoclax로 치료하고, 2일 동안 32°C에서 배양한다.
  3. zPDX 모델에서 세포 부채 및 세포 조성의 평가.
    1. 이식된 유충을 치료 후 마취시키고 3% 메틸셀룰로오스에 넣습니다.
    2. 형광 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 측면 도면으로부터 애벌레를 이미지화한다.
    3. ImageJ 및 GraphPad 소프트웨어를 사용하여 적색 및 녹색 형광 신호의 강도를 정량화합니다.

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결과

프로시저의 스키마 윤곽은 그림 1에표시됩니다. 요컨대, 원발성 암 조직 세포는 췌장암 섬유아세포 억제제의 첨가 유무에 관계없이 소화 후 완전한 배지내로 파종하였다. 암세포와 섬유아세포는 억제제 없이 섬유아세포가 지배하는 2개의 뚜렷한 집단으로서 농축되었고, 암세포성장은 억제제첨가 후 우세하였다(도 2). 2개의 렌티바이러스 패키징 벡터가 생성되었고, 이는 도3에 나타낸 바와 같이 녹색 또는 적색 형광 단백질 및 BCL2L1을 발현하였다. 바이러스 계 형광 표지는 또한 세포의 생존 상태를 나타내고 있었다. 혼합암세포와 섬유아세포를 48 hpf에서 제브라피시 노른자 낭에 주입하고 2일 동안 젬시타빈 및/또는 나비토클락스로 처리하였다. 이종이식의 상이한 집단 및 세포 조성에서의 세포 부식은 약물 치료에

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토론

PDX 및 CDX 모델 모두 종양생물학(22)분야에서 중요한 플랫폼이며, 성공적인 종 간 이식의 중요한 단계는 이종이식의 생존을 개선하는 것이다.  최근, 일부 연구는 BCL2L1 (BCL-XL) 또는 BCL2의 과도 발현이 세포 정체성과 운명에 영향을 미치지 않고 마우스 숙주에서 인간 배아 줄기 세포의 생존력을 크게 향상시킬 수 있음을 보여주었다23 , 24세 , 25. 우리의 원고에서, 우리는 지속적으로 항 세포 자멸 유전자 BCL2L1 (BCL-XL)뿐만아니라 형광 단백질을 발현 렌티 바이러스세포를 표시. BCL2L1의 도입은 제브라피시에서 이종이식 인간 세포의 생존 시간을 크게 향상시켰으며, 형광 신호는 세포에 라벨을 붙일 뿐만 아니라...

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공개 사항

잠재적 이해 상충은 공개되지 않았습니다.

감사의 글

이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 81402582, 상하이 12DZ2295100, 14YF1400600 및 18ZR1404500의 자연 과학 재단에 의해 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEMGIBCOC11995500BT
FBSHyclonesv30087.03
Y-27632CliniscienceY0503Rho kinase inhibitor
Primocininvivogenant-pm-11차 세포 배양용 항생제
Putrescine dihydrochlorideSigmaP5780
니코틴아미드SigmaN3376
페니실린 스트렙토마이신GIBCO15140122.00
인산염 완충액 (PBS)GIBCOC10010500CP
HBSSGIBCO14170112.00
콜라겐 분해 효소 IV 형GIBCO17104019.00
히알루로니다아제시그마H3884
Dnase I시그마D5025
인슐린시그마I9278
b-FGFGIBCOPHG0264
EGFGIBCOPHG0314
췌장암 섬유아세포 억제제CHI ScientificFibrOUT
0.45 μ m 멸균 필터MilliporeSLHV033RB
농도 컬럼MilliporeMillipore UFC910008농축 바이러스
폴리브레네시그마H9268
히알루론산 나트륨 염시그마H7630
L-글루타민GIBCO21051024.00
젬시타빈Gemzan
메틸셀룰로오스시그마M0262
Navitoclax(ABT-263)SelleckS1001Bcl-xL 억제제
<강한>장비
마이크로인젝터NARISHIGE
실체현미경OLYMPUSMVX10
컨포칼 현미경LEICASP80.00
호

참고문헌

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