방법 논문

향상된 신경 화학적 검출을 위한 금 나노입자 수정 탄소 섬유 마이크로 전극

DOI:

10.3791/59552

⸱

2019년 5월 13일

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1Department of Chemistry, American University, 2Center for Behavioral Neuroscience, American University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구에서는, 우리는 신경 전달 물질 검출의 감도를 향상시키기 위하여 금 나노 입자를 가진 탄소 섬유 마이크로 전극을 수정합니다.

초록

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30년 이상, 탄소 섬유 마이크로 전극(CFMEs)은 신경 전달 물질 검출의 표준이었습니다. 일반적으로 탄소 섬유는 유리 모세 혈관으로 흡인되어 미세 한 테이퍼로 당겨진 다음 에폭시를 사용하여 밀봉하여 빠른 스캔 순환 voltammetry 테스트에 사용되는 전극 재료를 만듭니다. 그러나 베어 CFMEs의 사용에는 몇 가지 제한사항이 있습니다. 무엇보다도 탄소 섬유는 상대적으로 낮은 표면적을 가지고 있으며 다른 나노 물질보다 낮은 감도를 생성하는 기저 평면 탄소를 주로 함유하고 있습니다. 또한, 흑연 탄소는 시간적 분해능과 상대적으로 낮은 전도도에 의해 제한된다. 마지막으로, 신경 화학물질과 거대분자는 탄소 전극의 표면에서 파울을 하는 것으로 알려져 있으며, 여기서 그들은 추가 신경 전달 물질 흡착을 차단하는 비 전도성 폴리머를 형성합니다. 이 연구를 위해, 우리는 빠른 스캔 주기적 voltammetry를 가진 신경 화학 시험을 강화하기 위하여 금 나노 입자를 가진 CFME를 수정합니다. Au3+는 콜로이드 용액으로부터 CFM의 표면상에 전기 증착 또는 디코팅되었다. 금은 안정적이고 상대적으로 불활성 금속이기 때문에 신경 화학 물질의 분석 측정에 이상적인 전극 재료입니다. 금 나노입자 개질(AuNP-CFMEs)은 4시간 이상 동안 도파민 반응을 위한 안정성을 가졌다. 더욱이, AuNP-CFMEs는 수정되지 않은 CFMEs보다 증가된 감도(주기적 볼탐모그램의 높은 피크 산화 전류) 및 더 빠른 전자 전달 역학(낮은 ΔEP 또는 피크 분리)을 나타낸다. AuNP-CFMEs의 개발은 검출의 낮은 한계에서 도파민 농도 및 기타 신경 화학 물질의 빠른 변화를 감지하기위한 새로운 전기 화학 센서의 생성을 제공합니다. 이 작품은 신경 화학 측정의 향상을 위한 광대 한 응용 프로그램. 금 나노 입자 변형 CFMEs의 생성은 약물 남용, 우울증, 뇌졸중, 허혈의 신경 화학 적 효과를 연구하기 위해 설치류 및 기타 모델에서 생체 내 신경 전달 물질을 감지하는 새로운 전극 센서의 개발에 매우 중요합니다. 및 기타 행동 및 질병 상태.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

탄소 섬유 마이크로 전극 (CFMEs)1은 도파민 3, 노르 에피네프린 4,세로토닌5,아데노신6을포함하여 몇 가지 중요한 신경 전달 물질2의산화를 검출하는 바이오 센서로 가장 잘 사용됩니다. 히스타민7, 그리고 다른사람 8. 탄소 섬유의 생체 적합성과 크기는 더 큰 표준 전극에 비해 조직 손상이 완화되기 때문에 이식에 최적입니다. 9개의 CFME는 유용한 전기화학적 특성을 가지고 있는 것으로 알려져 있으며, 빠른 전기화학 적 기술과 함께 사용될 때 빠른 측정을 할 수 있으며, 가장 일반적으로 빠른 스캔 주기적 voltammetry (FSCV)10,11. FSCV는 적용된 전위를 빠르게 스캔하고 특정 세포체 에 대한 특정 순환 볼탐모그램을 제공하는 기술이다12,13. 빠른 스캐닝으로 생성된 대형 충전 전류는 탄소 섬유에서 안정적이며 배경감 빼서 특정 순환 볼탐모그램을 생성할 수 있습니다.

그것의 최적의 전기 화학 및 신경 생물학적 중요성으로 인해, 도파민 널리 공부 하고있다. 카 테 콜 아민 도파민은 운동의 제어에 중요 한 역할을 하는 필수 화학 메신저, 메모리, 인식, 그리고 신 경계 내에서 감정. 잉여 또는 도파민의 결핍 수많은 신경 및 심리적 간섭을 일으킬 수 있습니다.; 이들 중 파킨슨 병, 정신 분열증, 중독성 행동이다. 오늘, 파 킨 슨 병 도파민 합성에 관련 된 중뇌 뉴런의 변성으로 인해 유행 장애 계속14. 파 킨 슨 병 증상은 떨림을 포함, 운동의 둔화, 강성, 그리고 균형을 유지 에 문제. 한편, 코카인15 및 암페타민16,17과 같은 각성제는 도파민의 오버플로를 촉진한다. 약물 남용 결국 도파민의 정기적인 흐름을 대체 하 고 도파민의 잉여를 필요로 하는 두뇌 조건, 결국 중독성 행동에 이르게.

최근 몇 년 동안, 신경 전달 물질 검출18에서전극 기능 개선에 중점을 두고 있다. 전극 감도를 향상시키는 가장 광범위한 방법은 섬유 표면을 코팅하는 것입니다. 놀랍게도, 탄소 섬유19에금속 나노 입자 전착에 대한 제한된 연구가 수행되었습니다. 금과 같은 귀금속 나노입자는, 다른 기능성물질(20)과함께 섬유 표면에 전기증착될 수 있다. 예를 들어, 신경전달물질 흡착이 일어나기 위한 전기활성 표면적을 증가시키게 된다. 전기 증착 된 금속 나노 입자는 빠르게 형성되고, 정제 될 수 있으며, 탄소 섬유에 부착 할 수 있습니다. 전기 화학은 이러한 나노 입자의 핵 형성 및 성장을 제어 할 수 있기 때문에 귀금속 나노 입자의 증착과 탄소 섬유의 표면 향상 모두에 대해 중요한 것으로 계속됩니다. 마지막으로, 증가 된 촉매 및 전도성 특성, 향상된 대중 수송은 전기 분석을위한 금속 나노 입자를 활용하는 다른 장점 중 하나입니다.

미국 대학의 고급 실험실 서열 과정 (실험 생물 화학 I 및 II CHEM 471/671-472/672) 분석의 조합, 물리, 생화학 실험실. 첫 학기는 실험실 기술의 개요입니다. 2학기는 학생 중심의 연구 프로젝트21입니다. 이러한 프로젝트의 경우, 학생들은 이전에 금 나노 입자22,23의생체 분자, 단백질, 펩타이드 및 아미노산 촉진 합성의 메커니즘을 조사했습니다. 최근 연구는 전극 표면에 금 나노 입자 (AuNP) 생산의 형성과 신경 전달 물질을 검출하는 CFM의 능력에 대한 AuNPs 효과의 평가에 초점을 맞추고있다. 본 작품에서, 실험실은 도파민 산화를 검출하는 CFM의 감도가 섬유 표면에 AuNP의 전착을 통해 강화된다는 것을 입증하기 위해이 기술을 적용했다. 각 베어-CFME는 CFME의 표면에서 도파민 산화를 측정하기 위해 도파민 산화 전류를 검출할 때 다양한 스캔 속도, 안정성 및 도파민 농도를 특징으로 합니다. Au3+는 Au 0으로 전기를 감소시키고 동시에 나노 입자로서 섬유 표면에 전기 증착하고 일련의 특성화 실험을 수행하였다. 직접 비교 후, AuNP-CFMEs 도파민 검출의 높은 감도 를 가지고 발견 되었다. 전착을 통해 섬유 표면에 AuNP의 균일 한 코팅은 더 높은 전기 활성 표면적을 렌더링; 따라서, 변형 된 전극 표면에 도파민의 흡착을 증가. 이 높은 도파민 산화 전류를 주도. AuNP-CFMEs의 도파민 산화 및 환원피크(□E p)의 잠재적분리도 더 작아졌으며, 더 빠른 전자 전달 역학을 시사한다. 이 연구의 미래 작품은 도파민의 검출을 위한 베어-및 AuNP-CFMEs 둘 다의 생체 내 시험을 포함한다.

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프로토콜

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1. 탄소 섬유 마이크로 전극의 건설

  1. 탄소 섬유의 준비
    1. 탄소 섬유 마이크로 전극을 만들려면 먼저 탄소 섬유 (탄소 섬유, 직경 7mm)를 손, 장갑 및 주걱을 사용하여 하나씩 분리하십시오.
    2. 꼬인 원사에서 섬유질 하나를 당기거나 양크합니다.
    3. 유리 모세관에 고립 된 탄소 섬유를 흡인 (마이크로 필라멘트가없는 단일 배럴 보로 실리 케이트 모세관 유리, 1.2 mm 외경, 0.68 mm 내경).
    4. 길이 약 10cm, 너비 25cm의 판지 조각을 절단하여 전극용 전극 홀더를 만듭니다.
  2. 수직 모세관 풀러를 사용하여 전극을 당깁니다.
  3. 수직 모세관 풀러의 슬라이딩 도어를 엽니다.
  4. 유리 모세관을 삽입할 수 있는 충분한 공간으로 드릴 척을 시계 반대 방향으로 회전시켜 금속 홀더 로드를 느슨하게 하고 제거합니다.
  5. 유리 모세관을 전극 홀더에 삽입합니다. 손으로 유리 모세관을 수직 모세관 의 상단에 올립니다.
  6. 유리 모세혈관을 깨거나 깨뜨리지 않고 드릴 척으로 시계 방향으로 유리 모세관을 조입니다.
  7. 히터 1, 히터 2 및 자석 설정을 제조업체에 조정하여 유리 모세 혈관을 전극 재료의 미세 테이퍼로 끌어 당기는 수준을 제안했습니다.
  8. 빨간색 시작 버튼을 눌러 코일 코일을 가열하여 압력, 중력 및 가열을 통해 전극을 당깁니다.
  9. 코일 코일은 붉은 뜨거운 상태에서 식힙니다. 두 개의 당겨진 전극을 위에서 아래로 연결하는 가위로 탄소 섬유를 잘라냅니다. 드릴 척 방법을 사용하여 시계 반대 방향으로 비틀어 수직 모세관 풀러에서 유리 모세관을 제거합니다.

2. 탄소 섬유 마이크로 전극 준비

  1. 스테레오스코프 또는 현미경으로, 외과용 가위 또는 날카로운 면도날로 유리 모세관 표면에서 튀어나온 탄소 섬유를 약 100~150μm 길이로 자른다.
  2. 면봉을 사용하여 25 mL 바이알에 0.2 mL의 경화제와 에폭시 10g을 혼합하여 에폭시 용액을 준비합니다.
  3. 각 전극의 팁만 에폭시 및 경화제 용액에 약 15s에 담급합니다.
  4. 전술한 탄소 섬유 마이크로전극의 상부를 아세톤에 담그고 약 3s를 위해 탄소 섬유 마이크로전극의 배럴로부터 임의의 과잉 에폭시를 씻어낸다.

3. 전극

  1. 마이크로 조작기를 사용하여 기준 전극, 은-은 염화물(Ag/AgCl) 외에 0.5 mM HAuCl 4의 용액에 작동 전극(탄소-섬유 마이크로전극)을 놓습니다.
  2. 작동 전극과 기준 전극을 potentiostat 및 헤드스테이지에 연결합니다.
  3. UNC HDCV 소프트웨어를 엽니다. 소프트웨어의 설정을 변경하여 파형을 적용합니다. 컴퓨터 설정에 다음 파형을 입력합니다: 0.2V에서 -1.0V까지 0.1 M KCl 용액에서 0.5mM HAuCl4를 포함하는 스캔을 10사이클 동안 50mV/s의 스캔 속도로 입력합니다. 녹색 화살표를 눌러 파형을 적용합니다. 그런 다음 시작 버튼을 눌러 측정 기록을 시작합니다.

4. 주사 전자 현미경 검사법

참고 : 스캐닝 전자 현미경 계측기 (SEM)를 사용하여 이미지 베어 및 금 나노 입자 변형 탄소 섬유 마이크로 전극. 검정 전도성 테이프에 샘플을 로드하고 제조업체에 설명된 지침에 따라 로드합니다.

  1. 기기 켜기
    1. 키를 돌려 시작 및 해제합니다.
    2. InTouchScope 소프트웨어를 두 번 클릭하여 엽니다.
    3. 키를 놓습니다. 그것은 그 자체로 I 기호에 착륙한다.
    4. EVAC 버튼이 깜박이지 않을 때까지 기다립니다.
    5. EVAC 버튼이 깜박이지 않는 경우 VENT 버튼을 누릅니다.
    6. VENT 버튼이 깜박이지 않을 때까지 기다립니다.
    7. 작동 거리(WD)가 20mm ~ 30mm인지 확인합니다.
    8. 기다리는 동안 샘플을 준비합니다.
  2. 스캔
    1. VENT 버튼이 깜박이지 말면 샘플을 기기에 로드합니다.
    2. 샘플을 적재할 때 샘플 홀더의 곡선 부분이 계측기를 향하도록 합니다.
    3. 샘플이 로드되면 EVAC 버튼을 누릅니다.
    4. 작동 거리를 10mm로 조정합니다.
    5. EVAC 버튼이 깜박이지 않는 경우 컴퓨터를 켭니다.
    6. 바탕 화면에 있는 터치 범위 내 소프트웨어를 클릭합니다. 터치 범위 소프트웨어가 두 가지가 있습니다, 녹색과 노란색 원없이 하나를 클릭합니다.
    7. 소프트웨어가 열리면 OBSERVE (화면 오른쪽 상단)를 클릭하여 빔을 켭니다. 관찰을 클릭하기 전에 EVAC 버튼이 깜박이지 않았는지 확인합니다.
    8. 샘플 분석을 시작합니다.
    9. 전압, 작동 거리(WD) 및 프로브 전류(PC) 설정이 허용되는지 확인합니다.
    10. 더 높은 설정을 위해 축소(~50X)하고 더 낮은 설정을 위해 확대합니다.
    11. 작동 거리를 10mm로 설정합니다.
    12. 샘플 사진을 찍기 전에 그림이 원하는 대상 폴더에 저장되도록 하십시오.
    13. 원하는 폴더를 선택하려면 설정(화면 왼쪽 상단)을 클릭합니다.
    14. 플래시 드라이브를 통해 컴퓨터에서 사진을 내보냅니다.
  3. 해제
    1. 관찰을 클릭하여 빔을 끕니다.
    2. VENT 버튼을 누르고 깜박임이 멈출 때까지 기다립니다.
    3. VENT 버튼이 깜박이지 않을 때까지 기다리는 동안 작업 거리를 다시 20mm ~ 30mm로 조정합니다.
    4. VENT 버튼이 깜박임을 멈추면 기기에서 샘플을 언로드합니다.
    5. EVAC 버튼을 누르고 깜박임이 멈출 때까지 기다립니다.
    6. EVAC 버튼이 깜박임을 중지하면 소프트웨어를 종료하고 컴퓨터를 종료합니다.
    7. 키를 O 기호로 돌려 악기를 완전히 끕니다.

5. 빠른 스캔 순환 볼테미트리 테스트

  1. Ag/AgCl 기준 전극과 함께 탄소 섬유 마이크로 전극을 전위및 헤드스테이지에 연결합니다.
  2. 마이크로 조작기는 X, Y 및 Z 측정 노브를 수동으로 조정하여 탄소 섬유 마이크로 전극을 유동 셀로 잘 낮춥시됩니다.
  3. DI 물에서 완충액을 준비(131.5 mM NaCl, 3.25 mMKCl, 1.2 mM CaCl 2, 1.25 mM NaH2PO4,1.2 mM MgCl2,및 2.0 mM Na2 SO4 pH를 7.4로 조정).
  4. 유량 셀을 인산완식염수(PBS) 버퍼(pH = 7.4)로 채웁니다.
  5. 채워진 60 mL 버퍼 주사기를 사용하여 약 1 mL / min에서 흐름 셀에 PBS 버퍼를 주입하십시오.
  6. 전극을 유동 셀에 넣고 녹색 버튼을 눌러 파형을 적용합니다. 오실로스코프를 관찰하고 전극을 자르거나 게인을 조정하여 과부하를 방지합니다. 각 전극 실행 사이에 약 10분의 평형을 허용합니다.
  7. 기본 파형을 도파민 파형으로 설정합니다. 스캔 – 0.4V ~ 1.3V 10Hz 및 400V/s.
  8. 10 mM 도파민, 세로토닌, 노르 에피네프린 및 과염소산의 다른 주식 용액을 준비하십시오. 피펫을 사용하여 PBS 완충액의 10 mL에서 도파민 스톡 용액의 1 μM을 피펫팅하여 완충액에서 1 μM의 최종 농도로 신경화학물질을 희석한다.
  9. 측정을 시작하려면 레코드 버튼을 누릅니다. 10 s 후, 주입 0.2 mL의 1 μM 도파민 흐름 세포 또는 신경 전달 물질의 다른 농도. 그에 따라 농도, 스캔 속도, 파형(전위 또는 스위칭 전위)을 조정합니다. 총 실행 시간을 30s로 설정합니다.
  10. HDCV 분석 소프트웨어를 사용하여 실행을 분석합니다. 필요에 따라 매개 변수를 변경합니다.
  11. 실험이 완료된 후, 3 mL의 물을 주입한 다음 공기가 플로우 셀의 버퍼 및 주입 포트에 각각 3회 주입하여 유동 셀을 청소합니다.
  12. 파형과 악기를 끕니다.

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결과

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도1의 경우, 우리는 FSCV 시험이 시험관 내에서 신경 전달 물질의 농도를 측정하는 데 사용되는 회로도를 보여줍니다. 도 1은 도파민 파형이 적용된 것을 표시한다. 삼각형 파형은 -0.4V에서 400V/s에서 1.3V로 스캔됩니다. 좌측 도면의 두 번째 부분에서, 도파민-정형-퀴논(DOQ)에 대한 도파민의 산화를 표시하며, 2개의 전자 전달 과정이 전극의 표면으로 의하여 세포화의 표면으로부터 발생한다. 마지막으로 현재 및 시간 플롯은 색상 플롯과 겹쳐져 있습니다. 현재 대. 시간 플롯은 도파민 산화의 표현. 도파민 산화가 없을 때 평평하고, 도파민이 도파민-정형퀴논으로 산화되고, 다시 도파민으로 감소될 때 수직으로 상승하여, 그 후, 전극의 표면에서 탈소를 한다. 색상 플롯은 현재의 3차원 플롯입니다. 황색 전류는 배경 전류(0에 가깝고), 녹색 플롯은 양성 산화...

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토론

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본 연구에서, 우리는 빠른 스캔 순환 voltammetry를 사용하여 도파민과 같은 신경 전달 물질의 검출을 위한 금 나노 입자 변형 탄소 섬유 마이크로 전극을 구성하는 새로운 방법을 보여줍니다. 이 방법은 생체 분자 검출의 감도를 향상시키기 위한 효율적이고 친환경적이며 비교적 저렴한 접근법입니다. 탄소 섬유의 표면에 증착된 금의 두께는 전착액에 존재하는 전착 및 금의 농도에 의해 제어될 수 있다. 금 수정 탄소 섬유 마이크로 전극은 빠른 전자 전달 역학 이외에 베어 전극보다 훨씬 더 높은 전기 활성 표면적을 갖는다는 것을 보여주었다. 또한 수정되지 않은 전극 재료보다 감도가 높고 검출 한계가 낮았습니다. 더욱이, 전극은 적어도 4시간 동안 유동 세포에서 시험했을 때 도파민 검출을 향한 안정성을 보였다. 전극의 표면에 흡착 제어를 나타내는 금 변형 탄소 섬유 전극에 대한 스캔 속도 및 농도 모두에 대하여 도파민 검출을 위한 피크 산화 전류에 대하여 선형 응답이 있었다.

프로토콜의...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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우리는 아메리칸 대학, 교수 연구 지원 보조금, NASA DC 우주 그랜트, NSF-MRI #1625977에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
도파민 염산염시그마 알드리치H8502-5G
인산염 완충 식염수시그마 알드리치P5493-1L
파인 웨이브뉴로 포텐시오스탓파인 인스트루먼트NEC-WN-BASIC이 주문은 헤드스테이지, 어댑터, 코드 및 기타 전자 제품과 같은 다른 모든 액세서리와 함께 대량으로 제공됩니다.
파인 플로우 셀 및 마이크로매니퓰레이터파인 기기NEC-FLOW-1이것은 또한 micromanipulator, 플로우 셀, 손잡이, 튜브, 커넥터 등을 포함하는 또 다른 대량 주문입니다.
유리 모세관A-M 시스템602500
T-650 탄소 섬유굿펠로우C 005711
에폰 828 에폭시 밀러-스티븐슨EPON 828 TDS
디델리네트리아민시그마 알드리치D93856-5ML
금(III) 염화물시그마 알드리치254169HAuCl4 또는 AuCl3
pH 미터FisherS90528
Farraday CageAMETEK TMC81-334-03
주사기 펌프NEW ERA PUMPNE-1000
Eppendorf 피펫 및 팁Eppendorf2231000222이것은 또한 여러 피펫 및 팁을 포함하는 대량 주문입니다.
10 -1,000 mL 비커VWR10536-390
탄소 섬유GoodfellowC 005711
셈JEOLJSM-IT100
로 제공

참고문헌

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