골격 근 생검 절차에서 인간 근육 선조 세포의 격리, 배양, 특성화 및 분화

요약

우리는 골격 근 생검 조직에서 얻은 인간 1 차적인 근육 전구 세포 (hMPCs)를 분리, 배양, 특성화 및 분화하는 기술을 제시합니다. 이러한 방법을 통해 획득되고 특징지어지는 hMPC는 인간 근생 및 골격 근 재생과 관련된 연구 질문을 이후에 해결하는 데 사용될 수 있다.

초록

1 차적인 인간 조직 및 세포의 사용은 골격 근 재생 과정과 같은 생물학적 및 생리적 과정의 조사에 이상적입니다. 수집된 조직으로부터의 낮은 세포 수율및 많은 정도의 공여자 이질성을 포함하여 골격근 생검에서 유래한 인간 1차 성인 줄기 세포, 특히 인간 근육 전구 세포(hMPC)와 함께 일하는 데 있어 인식된 과제가 있습니다. 문화 간의 성장과 죽음의 매개 변수. 이질성을 실험 설계에 통합하려면 더 큰 샘플 크기가 필요하지만, hMPC 확장 용량의 가변성을 뒷받침하는 메커니즘을 식별할 수 있으므로 더 잘 이해할 수 있습니다. 골격 근육 재생의 이질성. 배양물의 확장 능력을 구별하는 새로운 메커니즘은 골격 근 재생을 개선하기 위한 치료법의 개발로 이어질 가능성이 있다.

서론

골격 근은 인체에서 가장 큰 장기 시스템으로 전신 질량의 30-40 %를 차지합니다¹. 운동에서 잘 알려진 역할 외에도 골격 근은 체온과 자세를 유지하고 전신 영양소 항상성에 중심적인 역할을합니다. 인간 참가자, 동물 및 세포 배양 모델과 관련된 연구는 모두 골격 근 생물학 및 재생과 관련된 질문을 해결하는 데 가치가 있습니다. 인간 1차 근육 전구 세포(hMPC)의 분리 및 배양은 인간 샘플에 세포 배양 기술 및 조작을 허용하는 견고한 모델을 제공한다. hMPC를 사용하는 장점은 각 기증자^{2,3으로부터}유전및 대사 표현형을 유지한다는 것입니다. 기증자 표현형의 유지 보수는 연구원이 myogenic 프로세스에 있는 개별적인 변이를 검토하는 것을 허용합니다. 예를 들어, 우리는 hMPC 인구 확장 용량 4의 연령 및 성별 관련 차이를식별하기 위해 hMPC 특성화 방법을 사용했습니다.

이 프로토콜의 목적은 골격 근 생검 조직으로부터 hMPC를 분리, 배양, 특성화 및 구별하는 기술을 자세히 설명하는 것입니다. hMPC를 설명하고 hMPC 격리^5,6에대한 잠재적 인 세포 표면 제조 자를 식별 한 이전 작업을 기반으로이 프로토콜은 hMpc의 특성화에 격리를 연결하여 지식의 중요한 격차를 채웁니다. 또한, 이 프로토콜에 포함된 상세한 단계별 지침은 hMPC에 대한 사전 경험이 제한된 사람들을 포함하여 광범위한 과학 청중에게 hMPC 격리 및 특성화에 접근할 수 있도록 합니다. 우리의 프로토콜은 세포 집단을 추적하기 위하여 화상 진찰 세포계의 사용을 기술하는 첫번째 중 입니다. 새로 설계된 이미징 세포계는 최첨단, 높은 처리량 및 마이크로플레이트 기반으로, 몇 분 내에 배양 용기의 각 우물에서 모든 세포의 라이브 세포 이미징, 세포 카운팅 및 다채널 형광 분석을 가능하게 합니다. 이 시스템은 배양에 최소한의 중단으로 전체 세포 집단의 증식 및 생존력의 동적 변화를 신속하게 정량화할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 상이한 공여자로부터 유래된 각 배양물의 성장 역학을 결정하기 위해 시험관 내에서 연속적인 날에 합류의 객관적인 척도를 수행할 수 있다. 문헌의 많은 프로토콜, 특히 MPC의 분화를 수반하는 프로토콜은, 분화 또는 치료를 개시하기 전에 세포가정의된 수준의 합류에 도달하도록 요구한다 7. 우리의 방법은 연구원이 편견, 비 주관적인 방식으로 처리를 시작하는 것을 허용하는 문화 용기에 있는 각 우물의 합류의 객관적인 결정을 허용합니다.

과거에는 1차 hMPC를 사용하는 주요 제한은 실험에 사용할 수 있는 셀 수를 제한하는 낮은 수율이었습니다. 우리와 다른 사람들은 골격 근 생검 조직에서 MPC의 수율을 보여 주었다 조직의 밀리그램 당1-15 MPC (그림 1)^8. 우리의 프로토콜은 형광 활성화 세포 선별 (FACS)으로 정제하기 전에 세포의 네 개의 통로를 허용하기 때문에, 소량의 생검 조직 (50-100 mg)에서 파생 된 극저온 보존 된 hMPC 수율은 연구 목표를 해결하기에 충분합니다. 여러 실험이 필요합니다. 우리의 FACS 프로토콜은 ~ 80 % 순수 (Pax7 양성) MPC 인구를 생성하므로 우리의 프로토콜은 수율과 순도 모두에 최적화되어 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 코넬 대학의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 참가자는 기본 건강 상태에 대한 심사를 받고 정보에 입각한 동의를 얻었습니다.

1. 골격 근 생검을 통해 인간의 근육 조직 획득

1. 촉진, 해부학 적 랜드 마크 및 근육의 활성 수축을 통해 광대 한 측면 근육을 식별하십시오.
2. 참가자가 사두근 근육을 조이고 근육의 배를 찾아서 광대 한 측면을 만져, 슬개골에서 엉덩이까지의 길의 약 1/3, 대퇴골에 대한 방향성.
3. 종이 측정 테이프를 사용하여 근육의 배를 나타내는 슬개골 상단에서 약 4-6 인치의 수술 마커가있는 영역을 표시하십시오.
4. 표시된 부위 근처의 모발을 면도한 다음 의료 절차 전에 사용되는 수술 용 등급 방부제로 정화하십시오 (예 : 2 % 클로르헨시딘 글루코네이트 (CHG)/ 70 % 이소 프로필 알코올 (IPA)) ) .
5. 1 % 리도카인으로 생검 부위를 마취시.
   참고: 골격 근육에 리도카인을 주입하지 마십시오.
6. 표시된 부위에 4-5mm 절개 경로를 만듭니다.
7. 이 부위를 마취 한 후, 근막을 통해 트로카로 Bergstrom 바늘을 근육의 배 (약 2−3cm)로 밀어 넣습니다.
8. 절단 트로카를 2−3 cm 를 인출하여 베르그스트롬 바늘로 근육 조직을 끌어들이고, 어시스턴트는 부착된 60mL 주사기 플런저를 인출하여 흡입을 적용합니다.
9. 절단 챔버를 닫습니다.
10. 생검 바늘의 기지를 분기 차례로 회전하고 바늘을 열고, 흡입을 적용하고, 바늘을 닫는 순서를 반복합니다.
    참고: 바늘이 닫혀질 때마다 Bergstrom 바늘 내부에서 근육 조직의 상처를 얻어야합니다. 샘플 수집 중에 바늘은 각 샘플을 얻기 위해 360 °를 통해 세로로 회전하는 동안 동일한 수직 위치에서 허벅지에 남아 있습니다. 이 서열은 3-4회 반복될 수 있다.
11. 바늘에서 수집 된 생검 조직을 멸균 된 비 부착 드레싱 패드로 추방하십시오.
12. 조직을 검사하고 멸균 메스 블레이드 또는 핀셋을 사용하여 눈에 보이는 지방 및 섬유 조직을 제거합니다.
13. 조직의 일부(50-100 mg)를 CO2-독립적인 영양소배지(예를 들어, 최대 절전 모드 A)를 함유하는 멸균 튜브에 넣는다.
    참고: 조직의 무게는 다음과 같이 결정된다. 먼저 영양배지를 함유하는 뚜껑을 스케일과 주석에 놓는다. 다음으로 조직을 튜브에 넣고 튜브를 요약한 다음 영양 배지에 조직을 포함하는 튜브를 계량합니다.
14. 처리 될 때까지 4 °C에서 조직 및 영양 배지를 포함하는 튜브를 저장합니다.
    참고: 생검 조직은 수집의 48 시간 안에 가공되어야 합니다.

2. 생검 조직에서 인간 근육 전구 세포를 분리

1. 다진 생검 조직.
   1. 생물학적 안전 캐비닛 또는 유사한 멸균 작업장에서 영양 배지에서 멸균 페트리 접시로 근육 조직을 옮김.
   2. 멸균 메스 블레이드를 사용하여 조직을 ~1mm³ 개로 잘라내보도록 하십시오.
2. 다진 생검 조직을 세척하여 잔여 이물질을 제거합니다.
   1. 인산완충식염수(PBS)의 10mL를 함유한 15mL 원점관으로 근육 조직을 옮기고 조직이 중력을 통해 침전되도록 합니다.
   2. 상급자 근육 조직을 방해 하지 않도록 주의 하 고 흡인 합니다.
   3. 씻은 조직에 10 mL의 PBS를 추가하고 근육 조직이 중력을 통해 다시 정착 할 수 있도록하십시오.
   4. 상급자 근육 조직을 방해 하지 않도록 주의 하 고 흡인 합니다.
   5. 저포도당 덜베코의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)의 10 mL를 추가하고 조직이 중력을 통해 재정착 할 수 있도록하십시오.
   6. 상급자 근육 조직을 방해 하지 않도록 주의 하 고 흡인 합니다.
3. 다이제스트 미디어에서 조직을 배양하십시오.
   1. 다이제스트 미디어 3 mL에서 근육 조직을 다시 중단하십시오 (저혈당 DMEM에서 2 mg / mL 콜라게 나제 D).
      참고: 콜라게나아제 D 스톡 솔루션은 저혈당 DMEM에서 20 mg/mL로 제조하고 -80°C에 보관한 다음 사용 시 저혈당 DMEM에서 1:10희석할 수 있습니다.
   2. 37°C에서 수조에서 근육 조직을 함유하는 튜브를 30분 동안 배양한다.
   3. 10 mL 혈청학적 파이펫 또는 넓은 보어 피펫을 사용하여 10분마다 근육 조직 현탁액을 트리튜레이.
   4. 83 μL의 추가 다이제스트 미디어와 24 μL의 디스파제 용액 (0.76 mM 칼슘 아세테이트, 1.39 mM 나트륨 아세테이트, 13.91 mg / mL 디스파스 II 저혈당 DMEM)을 추가하십시오. 현탁액을 37°C 수조로 되돌려 보입니다.
   5. 넓은 보어 피펫 팁으로 5-10분마다 근육 조직 현탁액을 트리튜드합니다.
   6. 균일 한 슬러리가 달성 될 때까지 삼조를 계속하고, 이상 1.5 시간 이상 소화를 방지하기 위해.
      참고: 조직의 충분한 다진 및 콜라게나제와 디스파스의 효소 활성은 샘플 소화에 영향을 미칠 수 있습니다. 균일 한 슬러리는 1.5 시간 후 최소한의 폐색으로 일반 파이펫 팁을 통과 할 수 있어야합니다. 균일한 슬러리가 1.5시간 후에 달성되지 않으면, 조직 다듬이가 충분한지 다시 한 번 확인하고, 조직이 적절한 크기로 다진것을 다시 확인한다(단계 2.1.2). 부가적으로, 효소의 활성은 효소 활성이 많이 발생함에 따라 많이 시험되어야 한다.
4. 펠릿 세포를 복구 매체에서 동결.
   1. 6 mL의 성장 매체 (GM; 79% 햄의 F12, 20% 태아 소 혈 청, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 5 ng/mL 기본 섬유아세포 성장 인자 [bFGF], pH 7.4, 근육 슬러리에 통과) 추가.
   2. 70 μm 세포 스트레이너를 통해 현탁액을 50 mL 원점 튜브로 피펫. GM의 추가 4 mL로 여과기를 헹입니다.
      참고: 샘플은 펠릿을 쉽게 시각화하기 위해 15 mL 원추형 튜브로 다시 이송될 수 있습니다. 후속 셀 수율이 낮은 경우 더 큰 세척 볼륨을 사용할 수 있습니다.
   3. 실온(RT)에서 5분 동안 300 x g의 원심분리기.
   4. 상급자가 펠릿을 방해하지 않도록 합니다. 튜브를 쓸어넘기고 나머지 용지에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 세포가 배양되지 않을 경우 즉시 2.4.5 단계로 장기 보관에 대한 지침을 진행하고, 그렇지 않으면 3.1.6 단계로 진행한다.
      참고: 즉각적인 배양이 필요한 경우, 세포 배양 플레이트의 GM은 생검 처리가 시작되기 전에 미리 배양되어야 합니다(단계 3.1.1 및 3.1.2).
   5. 회수된 펠릿에 1.5 mL의 회수 세포 배양 동결배지(물자표)를 첨가한다.
   6. 슬러리를 저온으로 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 이소프로판올 제어 속도 냉각기를 -80°C에서 하룻밤 사이에 극저온에 놓습니다. 배양준비가 될 때까지 -80°C에서 저울을 보관하십시오.
      참고: 슬러리를 함유하는 Cryovials는 장기 저장을 위해 액체 질소에 보관 될 수있다 (1 개월 이상). 이소프로판올 제어 속도 냉각기를 사용하면 세포가 1 °C/min의 속도로 재현 가능하게 동결될 수 있으며, 동결 후 생존율및 세포 배양 용기에 부착될 가능성이 증가함에 따라 최적의 세포 회수율을 입증할 수^있다9. 대안적으로, -80°C 냉동고에 놓인 RT 이소프로판올을 함유하는 비커가 사용될 수 있다.

3. 인간의 근육 전구 세포 배양

1. 근육 슬러리를 해동합니다.
   1. hMPC를 해동 및 파종하기 전에, GM에서 세포 배양 플레이트를 미리 평형화시켰다. 장기간 배양 시 증발을 방지하기 위해 500 μL의 멸균 염기 매질(즉, F12)으로 나머지 웰을 채웁니다.
      참고: 50g에서 100g 사이의 생검의 경우 24웰 플레이트의 4개의 웰이 적합합니다. 생검 조직이 50g 미만이면 두 개의 우물이 더 적합 할 수 있습니다. 잔류 이물질 및 낮은 셀 수는 이 단계에서 세포 카운팅 기술의 사용을 방지합니다. 그러므로, 정확한 파종 조밀도는 결정되지 않으며 생검에 생검에서 약간 변화합니다.
   2. 종자 전에 1시간 동안 5% CO2에서 37°C에서 GM으로 세포 배양 용기를 배양한다.
   3. -80°C 냉동고에서 저온 제거 및 37°C 수조에 놓는 다; 튜브의 액체는 물에 완전히 잠겨 있어야합니다.
   4. 해동이 거의 완료되면 (~5 분), 멸균 층류 흐름 후드에 저온을 전송합니다. 저온 튜브에서 근육 슬러리를 옮기고 1 mL / min의 속도로 미리 데운 GM 6 mL을 포함하는 15 mL 원엽 튜브에 추가하십시오.
   5. RT에서 5 분 동안 300 x g에서 근육 슬러리를 원심 분리합니다.
      참고: 스윙 버킷 원심분리기는 이 단계에서 작은 펠릿을 쉽게 시각화할 수 있지만 필수는 아닙니다.
   6. 상급자가 펠릿을 방해하지 않도록 합니다. 튜브를 쓸어 넘기고 나머지 용지의 펠릿을 다시 일시 중단하고 GM의 1 mL에서 다시 일시 중단하십시오.
   7. 250 μL의 재부유 펠릿(현재 hMPC 현탁액으로 간주됨)을 미리 배양된 24웰 세포 배양 판의 4개의 웰각각에 전달한다.
2. 문화 및 통로 hMPC.
   1. 5% CO2에서 37 °C에서 GM에서hMPC 배양유지.
      참고: bFGF(즉, F12, 항생제, FBS)가 없는 GM의 주식은 일괄처리되어 제조되고 최대 2주 동안 4°C에서 유지된다. bFGF는 사용 당일 GM에 추가됩니다. bFGF를 함유하는 매질은 4°C에서 48시간 동안 저장될 수 있다.
   2. 격리 후 24 시간, GM을 흡인, 부드럽게 미리 따뜻하게 GM으로 배양 용기 2 배를 세척하고, 신선한 GM을 추가합니다.
      참고 : 24 hMPC는 부착 할 수있는 충분한 시간을 제공해야합니다. 세척 후 hMPC를 제거해서는 안됩니다. 이 단계는 또한 세포 수확 중에 생성 된 나머지 파편을 제거하여 이미징 세포계 (아래 섹션 5)를 사용하여 정확한 합류 스캐닝을 보다 정확하게 할 수 있게합니다. 이 초기 미디어 변경 후, GM은 48 시간마다 변경됩니다.
   3. 70% 합류가 달성되거나 10일 동안 동일한 배양 접시에 남아 있을 때, 중 먼저 발생하는 통로 hMPC.
      참고 : 70 % 합류는 약 55,000 세포 / cm2입니다.
   4. 통과하려면, 미리 온난된 트립신 250 μL을 각각 24웰 세포 배양 판에 넣고 ~5분 동안 배양한다.
   5. 단단한 표면에 세포 배양 혈관을 탭하여 hMPC를 분리합니다. 가벼운 현미경을 사용하여 hMPC가 분리되었는지 확인할 수 있습니다.
   6. 트립신/hMPC 현탁액을 15mL 원추형 튜브에서 5 mL의 GM으로 옮김.
   7. RT에서 5분 동안 300 x g의 hMPC 서스펜션을 원심분리합니다.
   8. 원심분리기에서 hMPC 현탁액을 제거하고 멸균 층류 후드에 얼음위에 놓습니다.
      참고: 통과하는 동안 얼음에 hMPC를 유지하면 세포 응집이 줄어듭니다.
   9. hMPC에서 흡인상하고 GM의 1 mL에서 펠릿을 부드럽게 다시 놓습니다.
   10. 혈세포계 또는 자동화 된 세포 카운터를 사용하여 세포를 계산합니다.
       참고: 세포 계수 완충액에 대한 세포 현탁액의 1:5 희석은 일반적으로 적절하다.
   11. 종자 hMPC는^cm2당 3,500 세포의 밀도로 미리 데운 GM을 함유한 콜라겐 코팅 배양 접시에. 10cm 플레이트와 24웰 플레이트의 조합이 이상적입니다. 24웰 플레이트는 이미징 세포계에서 매일 스캔하여 성장을 모니터링할 수 있습니다.
   12. 후속 구절에 대해 동일한 절차(3.2.4단계부터 시작)를 따릅니다.
       참고: 세포 건강 및 순도는 세포 노화의 마커 (예를 들어, β-galactosidase) 및 Pax7에 대한 면역 염색의 마커를 사용하여 통로를 통해 모니터링 할 수 있습니다.
3. hMPPc를 냉동 보존합니다.
   1. 나중에 사용하기 위해 과잉 세포를 냉동 보존하여 배양량을 보다 관리하기 쉽게 만듭니다.
   2. 동결 보존의 경우 3.2.4.-3.2.9 단계에 설명된 트립시화 절차를 따르십시오.
   3. 세포 현탁액이 원심분리되는 동안, 적절한 혼합을 보장하기 위해 20% (예를 들어, 200 μL) 디메틸 설폭사이드 (DMSO) 및 80 % (예를 들어, 800 μL) GM. 피펫 을 20 배 위아래로 혼합물을 준비하십시오. 혼합물을 얼음 위에 놓습니다.
   4. 셀 수에 따라 GM에서 hMPC 현탁액을 2 x 10⁶/mL로 희석합니다.
   5. hMPC 현탁액과 20% 멸균 DMSO/80% GM 혼합물50/50을 결합합니다. 최종 동결 보존 매체는 DMSO(10%)의 조합입니다. 및 GM (90%) 1 x 10⁶ hMPC / mL을 포함합니다.
   6. 3.3.5단계에서 제조된 hMPC 현탁액의 1 mL를 초기 세포 수가 허용하는 한 많은 극저온으로 배치한다. 이어서 aliquoted hMPC를 하룻밤 -80°C 냉동고에 이소프로판몰 제어 속도 냉각기에 놓는다.
      참고: 이 단계에서, 전형적으로 5와 15백만 개의 세포 사이 는 FACS에 의해 hMPCs로 확인되는 30-60%를 장악됩니다.

4. 유세포 측정을 통해 Pax7⁺ 인간 근육 전조 세포 분리

1. 살아있는 배양물로부터 hMPC를 준비하려면(단계 3.2.11), 1 x 10 6-2 x 10^{6 총} 세포에 대해 충분한 배양 용기를 시도한다. 3.2.4-3.2.9 단계에 설명된 대로 셀 현탁액을 준비합니다.
2. 극저온 보존 배양물에서 hMPC를 준비합니다(단계 2.4.6 또는 3.3.6).
   1. 각 기증자에 대해 ~1 x 10⁶ 구절 4 개의 hMPC를 포함하는 1-2 튜브를 선택하십시오.
      참고: 4개의 hMPC계를 사용하여 계통과 6까지 증식 전위를유지하면서 적절한 세포 수율을 허용한다(도 2).
   2. -80°C 냉동고에서 이들을 제거하고 튜브 내의 액체와 함께 37°C 수조에 넣어 세포를 급속히 해동시켜 완전히 침수하였다.
   3. 해동이 거의 완료되면(~5분), hMPC를 멸균 층류 흐르게 하는 후드로 옮기고 1mL/min의 속도로 15 mL 원엽 튜브에서 미리 온난된 GM의 6 mL로 셀 서스펜션의 내용을 전송합니다.
   4. 3.2.7-3.2.9 단계에 설명된 대로 셀 현탁액을 준비합니다.
   5. FACS 완충액의 3 mL에서 각 펠릿을 다시 일시 중단 (500 mL PBS, 12.5 mL 일반 염소 혈청, 2 mL 0.5 M EDTA, pH 7.4, 0.22 μm 필터를 통과).
   6. RT에서 5분 동안 300 x g의 세포 현탁액을 원심분리합니다.
   7. hMPC로부터 의 상피상파를 흡인하고 FACS 완충제의 250 μL에서 펠릿을 부드럽게 재중단; 얼음 위에 놓습니다.
   8. 1.7 mL 의 미세 원심 분리튜브에 100 μL의 세포를 놓고 얼음위에 두어 살아있는/죽은 컨트롤로 사용하십시오(단계 4.5.1).
      참고 : 살아있는 / 죽은 컨트롤에 사용되는 세포의 100 ul은 각 기증자에서 재 중단 된 세포의 작은 볼륨 (~ 20 ul)을 취하거나 뱅크 된 세포에서 정렬 할 수 있습니다.
      참고: 단일 공여자로부터 20ul 이상의 재중단 된 세포를 복용하지 않는 것이 중요합니다. FACS 버퍼로 최대 100 ul의 체적을 가져와서 < 100 ul의 세포를 사용할 수 있습니다.
3. 세포 표면 마커에 대한 얼룩 hMPC.
   1. 다음 항체 칵테일을 준비(표시된 양은 각 배양에 대해, 적절하게 스케일업): 5 μL CD56(신경 세포 접착 분자 [NCAM]; PE-Cy7-컨쥬게이드) 및 5 μL CD29(β1-인테그린; 알렉스플루오르488-컨쥬게이드). 최종 항체 희석은 1:50이다.
   2. 각 hMPC 현탁액에 항체 칵테일 10 μL을 넣고 어둠 속에서 30 분 동안 얼음에 배양하십시오.
   3. 각 현탁액/항체 칵테일 혼합물에 FACS 버퍼 10 mL를 추가합니다.
   4. RT에서 5 분 동안 300 x g의 각 튜브를 원심 분리합니다.
   5. FACS 완충제의 300 μL에서 펠릿을 다시 중단하고 5 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브로 옮김.
   6. 얼음에 현탁액을 유지하고 빛으로부터 보호하십시오.
4. 보상 구슬을 준비합니다.
   참고 : 각 항체및 음의 대조군 (얼룩이 없는 비드)에 대한 긍정적 인 대조군은 보상 비드를 사용하여 준비되어야합니다. 보정 비드 컨트롤은 시료를 정렬하기 전에 유량 세포계에서 실행되어야 합니다. 이러한 컨트롤은 각 항체의 불소가 다른 항체의 채널에서 얼마나 검출될 수 있는지 를 결정하여 보상이 적용될 수 있도록 합니다.
   1. 소용돌이 보상 구슬.
   2. 3개의 1.7 mL 마이크로원심지 튜브에 한 방울(50 μL)의 보상 구슬을 추가합니다.
   3. 각 항체의 1 μL을 적절한 튜브에 추가하거나 음성 대조군에 없음을 추가합니다.
   4. 15 분 동안 어둠 속에서 배양하십시오.
   5. 각 튜브와 소용돌이에 1.5 mL의 FACS 버퍼를 추가합니다.
   6. RT에서 5 분 동안 벤치 탑 원심 분리기에 300 x g의 각 튜브를 원심 분리기.
   7. 상피상하를 흡인하고 FACS 완충제의 200 μL에서 펠릿을 재중단시켰다.
      참고: 펠릿은 시각화하기가 매우 어려울 수 있습니다. 상급을 흡입 할 때주의를 기울여야합니다.
   8. 서스펜션을 5 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브에 넣고 튜브를 얼음 위에 두고 빛으로부터 보호하십시오.
5. 라이브 및 죽은 컨트롤을 준비합니다.
   1. hMPC의 100 μL을 단계 4.2.8에서 두 개의 1.7 mL 마이크로 원심 분리튜브(라이브 컨트롤용 및 죽은 제어를 위한 튜브)로 나눕니다.
   2. 죽은 제어 튜브를 70°C로 예온된 가열 블록에 놓고 >10분 동안. 이 시간 동안, 얼음에 라이브 제어를 유지합니다.
   3. RT에서 5 분 동안 벤치 탑 원심 분리기에 300 x g의 각 튜브를 원심 분리기.
   4. 상피상하를 흡인하고 FACS 완충제의 150 μL에서 펠릿을 재중단시켰다.
   5. 라이브/데드 컨트롤을 단일 5mL 라운드 하단 폴리스티렌 튜브에 결합합니다.
6. 생존 력 염색을 수행합니다.
   1. 정렬될 세포를 포함하는 모든 튜브에 7-아미노액티노마이신 D(7-AAD)의 1 μL을 추가하고 살아있는/죽은 대조군을 추가합니다.
   2. 콜라겐 코팅 된 24 웰 (250 μL / well) 및 10cm (8 mL / well) 플레이트에 GM을 첨가하고 5 % CO2에서37 °C에서 세포 배양 인큐베이터에서 평형을 허용합니다.
7. 유세포 측정을 통해 hMPC를 정렬합니다.
   1. 20 psi의 압력에서 100 μm 노즐로 유량 세포계에서 hMPC를 정렬합니다. 측면 및 전방 분산뿐만 아니라 7-AAD 부정성에 기초하여 라이브 hMPCS를 결정합니다(정렬 매개변수 및 대표 정렬은 그림3에서 볼 수 있음).
   2. PE-Cy7 (780/60 nm) 및 AlexFluor488 (530/30 nm)에 대한 양성 세포는 CD56^{+ /}CD29⁺ 세포를 나타내므로 Pax7 양성 세포 (hMpc)입니다. 이중 양성 세포를 FACS 완충액의 300 μL 쿠션을 포함하는 수집 튜브로 정렬합니다.
      참고: 분류된 배양의 순도는 Pax7에 대한 면역 염색에 의해 결정될 수 있고그 다음에 하류 유세포 분석(도 4).
   3. 다른 모든 셀을 폐기합니다.
   4. 정렬된 셀을 15 mL 원엽 튜브로 옮김을 전송합니다.
   5. RT에서 hMPC 서스펜션을 300 x g에서 5분 동안 회전시면 됩니다.
   6. 조심스럽게 상한을 흡인하고 GM의 1 mL에서 다시 일시 중단하십시오.
   7. 혈세포계 또는 자동화 된 세포 카운터를 사용하여 세포를 계산합니다.
      참고: 세포의 수는 긍정적으로 분류되는 사건의 수로 추론될 수 있는 동안, 이 수는 전통적인 세포 계산 방법에 비해 10−40%에 의하여 세포의 수를 과대 평가하는 것을 발견되었습니다.
   8. 3.2.11 단계에서 설명한 대로 hMPC를 시드합니다.
      참고: hMPC 집단의 순도의 검증은 Pax7에 대한 면역 염색 및 유세포 분석을 통한 분석에 의해 결정될 수 있다.

5. 이미징 세포계를 사용하여 인간 근육 전조 세포 (hMPC) 배양 특성화

1. 이미징 세포계(재료 표)를 사용하여 합류 스캔을 수행합니다.
   1. 새 스캔 만들기를 선택한 다음 플레이트범주, 플레이트 프로파일 및 플레이트ID를 입력/선택합니다. 이미징 세포계는 96, 24 및 6 개의 웰 플레이트를 수용 할 수 있습니다.
   2. 응용 프로그램에서 합류 > 합류1을 선택합니다.
   3. 화면 오른쪽에 있는 네비게이터를 사용하여 웰을 선택합니다.
   4. 셀이 배경에 비해 흰색으로 나타나는 초점 평면을 찾아 레지스터 매뉴얼을 선택하거나 이미징 세포계가 레지스터자동을 선택하여 초점 평면을 선택할 수 있도록 합니다.
      참고: 재료표에 제시된 96개의 웰 플레이트의 경우 대략적인 위치는 4.3 단위입니다.
   5. 마우스를 사용하여 스캔해야 하는 모든 웰을 강조 표시합니다. 전체 웰 영역이 자동으로 스캔됩니다. 스캔 시작을선택합니다.
   6. 플레이트 및 셀 유형에 적합한 분석 설정을 선택합니다.
      참고: hMPC의 경우 다음 설정은 최적입니다: 강도 = 6, 채도 = 0, 직경 = 8, 최소 두께 = 3, 최소 클러스터 크기 = 500 및 정밀도 = 높음.
   7. 시작 분석을선택합니다.
      참고: 사용자와 이미징 세포계가 세포 경계에 대해 동의하는지 확인하기 위해 이미지를 시각적으로 검사합니다. 큰 불일치가 있는 경우 다른 초점 평면 또는 다른 해석 설정을 사용하여 플레이트를 다시 스캔합니다. 합류 스캐닝은 배양물 간의 성장, 치료 시간, 또는 세포를 모니터링하고 분화를 개시할 시기를 결정하는 데 사용될 수 있다. 차별화가 필요한 경우 세부 사항은 섹션 6에 제공됩니다.
2. 이미징 세포계를 사용하여 세포를 계산합니다.
   1. Ham's F12 12 mL, Hoechst 33342 의 6 μL 및 프로피듐 요오드의 24 μL을 포함하는 염색 용액을 준비합니다.
   2. 흡인 매체를 염색 용액으로 교체하고, 37°C에서 15분 동안 배양한다.
   3. 흡인 염색 용액을 햄의 F12로 교체하십시오.
      참고: 선명한 이미지를 얻으려면 페놀 빨간색이 낮은 미디어를 사용하는 것이 중요합니다. 대안적으로, PBS가 사용될 수 있다.
   4. 이미징 세포계에 플레이트를로드하고 응용 프로그램에서 셀 생존가능성 > 라이브 + 죽은 + 총을 선택하십시오. 라이브 채널은 밝은 필드 이미지가 될 것입니다, 죽은 채널은 프로피듐 요오드가 될 것입니다, 총 채널은 Hoechst 33342 될 것입니다.
   5. 라이브 채널을 밝은 필드로 설정하고 포커스 설정에서 자동 등록을 클릭합니다.
   6. 총 채널에서 채널을 파란색으로 설정합니다. 포커스 찾기를 사용하여 핵을 초점으로 가져오거나 위쪽 및 아래쪽 화살표를 사용하여 수동으로 포커스를 설정합니다. 간격띄우기 설정을 클릭하여 포커스를 선택합니다.
   7. 죽은 채널 아래에서 채널을 빨간색으로 설정합니다. 포커스 찾기를 사용하여 죽은 셀을 포커스로 가져오거나 위쪽 및 아래쪽 화살표를 사용하여 수동으로 포커스를 설정합니다. 간격띄우기 설정을 클릭하여 포커스를 선택합니다.
   8. 스캔 시작을 선택하여 스캔을 시작합니다.
   9. 플레이트 및 셀 유형에 적합한 분석 매개변수를 선택합니다. 분석을 시작하려면 해석 시작을 선택합니다. 분석이 완료된 후, 분석이 세포를 적절히 계수하고 있는지 시각적으로 확인합니다(예를 들어, 모든 핵이 핵으로 인식되고 있고 이미징 세포계가 백그라운드에서 어떤 반점도 계산하지 않는지 전체 채널 검사의 경우 핵)을 참조하십시오. 스캔 및 분석이 만족스럽다면 플레이트를 인큐베이터로 되돌려 놓고 분석 파라미터를 다시 스캔하거나 수정합니다.

6. 인간의 근육 전구 세포 (hMPC)를 Myotubes로 차별화

1. 섹션 5.1의 프로토콜을 사용하여 hMPC 합류를 결정합니다. hMPC를 myotube로 분화하기 위해, 이미징 세포계의 합류 기능에 의해 결정된 바와 같이 세포가 80-85% 융자되는 것이 이상적입니다(섹션 5 참조). 둘 이상의 독특한 기증자의 hMPC가 사용되는 경우, 합류 스캐닝을 통해 다른 기증자의 세포가 합류에 도달할 때 분화를 시작할 수 있습니다.
   참고: 80% 합류에서, 대략 66,000 세포/cm2가 있습니다.
2. 분화 매체로 세포를 2x 세척 (97 % 햄의 F12, 2 % 말 세럼, 1 % 페니실린 / 연쇄상 구균, pH 7.4, 0.22 μm 필터를 통과).
3. 매일 미디어를 전환하는 동안 실험이 지시하는 한 분화 매체에서 세포를 유지합니다.
4. 배아 미오신 중사슬에 대한 면역 염색을 통해 미오튜브 형성을 직접 평가하며, 이는 일반적으로 분화 7-10일 후에 검출될 수 있다.
   참고: myotube를 형성 하는 데 필요한 시간 기증자 및 분화 시작 되었을 때 세포의 수에 따라 약간 다를 수 있습니다.; 따라서 각 기증자의 문화를 개별적으로 모니터링하는 것이 좋습니다.

결과

인간의 근육 조직으로부터의 hMPC 격리의 대표적인 유동 세포분석 결과는 도1에서 볼 수 있다. hMPC는 죽은 세포 또는 파편을 제거하기 위해 측면 산란 및 전방 산란을 기반으로 한 첫 번째 게이팅 이벤트로 식별 할 수 있으며 7-AAD에 대해 부정적이며 따라서 실행 가능한 세포만 선택합니다. 세포 표면 마커 CD56 및 CD29 모두에 대해 양성 세포의 선택은 hMPC 집단을 나타낸다. 60 mg의 생검은 약 75-250 hMPC를 제공합니다.

대표적인 합류 스캔은 그림 2A에나와 있습니다. 도 2B의 녹색 윤곽선은 이미징 세포계에 의해 생성되었고, 이미징 세포계가 선택한 분석 설정에 기초하여 어떻게 ...

토론

1 차적인 hMPCs는 골격 근육 생물학 및 재생 과정을 이해하는 데 사용되는 중요한 연구 모델입니다. 추가적으로, hMPC는 치료에 이용될 가능성이 있습니다. 그러나, 인간10으로부터 유래된 세포의 제한된 이해를 포함하여 연구 및 치료 모두에 대한1차 hMPC 사용에 대한 인식된 과제가 있다. 또한 hMPC의 사용 가능성을 제한하고 연구 결과^11에영향을 미칠 수 있는 기증자 문화 사이에서 확장 능력에 있는 큰 정도의 변이가 있습니다. 예를 들어, 최근에는 이 프로토콜에 기재된 방법을 사용하여 단리된 hMPC가 확장 용량에서 다양한 세포를 생산한다는 것이 입증되었으며, 이는 성별 또는^{연령 11과}일치하지 않는 전사 프로파일에 의해 구동되었다.

여기서, 우리는 myotube로의 분화를 포함하여 다수의 다운스트림 애플리케이션에 대해 충분한 수량으로 hMPC를...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.25% 트립신, 2.21mM EDTA	Corning	배양 용기에서 부착성 hMPC를 제거하는 데 사용되는	25-053-Cl
10cm 세포 배양 플레이트	VWR	664160	hMPC 배양에 사용되는
15mL Falcon 튜브	Falcon	352196	hMPC 분리 및 배양 프로토콜 전반에 사용되는 15mL 원추형 튜브
24 웰 세포 배양 플레이트	Grenier Bio-One	662 160	플레이트 hMPCs
7-AAD 생존력 염색 솔루션	eBioscience	00-6993-50	FACS 분류 중 살아있는 세포를 식별하기 위한 생존력 염색
Alexa Fluor 488 anti-human CD29, 클론: TS2/16	BioLegend	303016	FACS용 접합 항체
검은색 96웰 세포 배양 플레이트	Grenier Bio-One	655079	96웰 세포 배양 플레이트
hMPC 배양을 추적하는 데 사용되는	Celigo S Celigo S	Nexcelcom Bioscience
Cell Strainer	VWR	352350	세포 스트레이너는 근육 생검 처리 중 큰 파편을 제거합니다
겐 I형(Rat 꼬리)	세포	배양 플레이트 코팅을 위한 Corning 354236 Collagen
Collagenase D	Roche	11 088 882 001	골격근 생검 조직에서 콜라겐 및 기타 결합 조직의 분해에 사용
Dimethyl Sulfoxide	VWR	WN182	hMPCs
Dispase II	Sigma Life Sciences	D4693	골격근 생검 조직의
효소 소화에 사용되는 프로테아제Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose Powder	Gibco	31600-034	근육 생검 처리를 위한 저포도당 DMEM
Dulbecco의 Phosphate Buffered	Saline Gibco	21600-010	PBS 근육 생검 처리
EDTA Disodium Salt Dihydrate	J.T. Baker	4040-01	FACS 버퍼에 필요
소 태아 혈청	VWR	89510-186	hMPC 성장 배지에 사용되는 소 태아 혈청
Ham's F12	Gibco	21700-026	hMPC용 기본 배지
열 비활성화 말 혈청	Gibco	26-050-070	hMPC 분화 매체를 만드는 데 사용되는 말 혈
청	iNCyto	DHC-N0105	세포 계수에 사용
동면 골	Gibco	A1247501	배지 조직
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate	Life Technologies	H21492	사용하여 모든 세포를 식별하기 위한 DNA 염색
			hMPC의 제어 속도 동결에 사용
Moxi 버퍼	Orflo	MXA006	자동 세포 계수기용 버퍼
Moxi 카세트	Orflo	MXC002	자동 세포 계수기용 Cassesttes
Moxi z Mini 자동 세포 계수기	Orflo		자동 세포 계수기
Mr. Frosty 냉동 용기	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	상업적으로 이용 가능한 제어 속도 세포 동결 용기
Normal Goat Serum (10%)	Thermo Fisher Scientific	50062Z	FACS 완충액
에 사용되는 염소 혈청PE-Cy7 마우스 안티-휴먼 CD56, 클론: B159	BD Pharmingen	557747	FACS용 접합 항체
페니실린/스트렙토마이신 100x 용액	Corning	30-002-CI	항생제
Propidium iodide	Thermo Fisher Scientific	P3566	DNA 염색을 사용하여 Celigo
S 재조합 인간 염기 섬유아세포 성장 인자	Promega	G5071	하기 위한 MPC 성장 배지 내 자발적 분화 방지
회수 세포 배양 동결 배지	Gibco	12648-010	cryoperseve 근육 생검 슬러리에 사용되는 배지
중탄산나트륨	Fisher Scientific	S233-3	Ham의 F12
멸균 원형 바닥 5 mL 튜브	VWR	60818-565	FACS
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42	보상 비드 포트 교정 흐름 FACS 설정