여기서 우리는 IS의 형성 동안 B 림프구에서 세포 편광 사건을 특성화하는 두 가지 접근법을 기술한다. 첫 번째, 세포 기관 모집 및 시 냅 스 막에서 세포 골격 재배열의 정량화 포함. 두 번째는 면역 시냅스에 대한 편광을 겪는 중심도의 조성의 변화를 특성화하는 생화학적 접근법입니다.
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방법 논문
면역 시 냅 스 형성 하는 동안 B 세포에서 세포 역학 공부
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
B 세포 수용체 (BCR)에 의한 표면 테더된 항원의 인식은 신호및 항원 세포 가 조정되는 면역 시냅스 (IS)의 형성을 유발합니다. IS 형성은 리소좀 및 골지 장치와 같은 중심도 및 관련 세포내 세포 기관의 시냅스 막에 편광된 모집을 수반하는 동적 액틴 리모델링을 포함한다. 액틴 리모델링의 초기 단계는 B 세포가 세포 표면을 증가시키고 시냅스에서 수집 된 항원 - BCR 복합체의 양을 최대화 할 수 있게합니다. 특정 조건하에서, B 세포가 단단한 표면에 관련되었던 항원을 인식할 때, 이 프로세스는 항원 추출을 촉진할 수 있는 리소좀의 현지 모집 및 분비에 결합됩니다. 취한 항원들은 T 도우미 세포에 대한 추가 프리젠 테이션을 위해 주요 조직 적합성 복합체 II (MHC-II) 분자에로드된 펩티드로 처리하기위한 전문 엔도 리소좀 구획으로 내재화됩니다. 따라서, IS의 형성과 관련되었던 세포역학을 공부하는 것은 B 세포가 활성화되는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. 본 기사에서 우리는 B 세포에 있는 IS의 대형과 연관되는 세포 내 세포기관 위치 및 세포골격 재배열에 있는 변경을 공부하기 위하여 이용된 화상 진찰 그리고 생화확적인 기술 둘 다 토론할 것입니다.
서론
B 림프구는 다른 위협에 대하여 항체를 생성하고 병원체를 침입에 책임 있는 적응면역 계통의 필수적인 부분입니다. 항체 생산의 효율은 B 세포가 수용성 또는 표면 테더형형태로발생하는 항원을 획득, 공정 및 존재하는 능력에 의해 결정된다 1,2. BCR에 의해, 제시 세포의 표면에 부착된 항원의 인식은 IS3,4라고불리는 가까운 세포간 접촉의 형성을 이끈다. 이 동적 플랫폼 내에서 BCR 의존다운 스트림 신호 및 내분형 구획으로 항원의 내재화가 모두 일어난다. 업크업 된 항원 처리 및 MHC-II 분자에 조립 하 고 이후에 T 림프구에 제시. B-T 세포 협력이라고 불리는 생산적인 B-T 상호작용은 B 림프구가 항체 생산 혈장 세포 또는 기억 세포로의 분화를 촉진하는 적절한 신호를 수신할 수 있도록한다8.
2개의 기계장치는 B 세포에 의하여 항원 추출에서 관련시켰습니다. 첫 번째는 시냅스 갈라진 부분5,....
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프로토콜
참고: 다음 단계는 IIA1.6 B 세포를 사용하여 수행하였다.
1. 항원 코팅 구슬B를 가진 B 세포 활성화
- 항원 코팅 구슬의 제조
- B 세포를 활성화하려면NH 2-비드를 공동으로 코팅된 항원(Ag-코팅 비드)을 사용하며, 3 μm NH 2-비드의 50μL(~20 x 106 비드)을 사용하여 활성화(BCR-리간드+) 또는 비활성화(BCR-리간드)항원을 사용한다.
- IIA1.6 B 세포에 대 한 안티-IgG-F (ab') BCR-리간드 및 안티-IgM-F (ab')2 또는 소 혈 청 알부민 (BSA)로2 단편을 BCR-리간드-사용. 1차 B 세포 또는 IgM+ B 세포수를 활성화시키기 위해 BCR-리간드+및 BSA로서 항-IgM-F(ab')2를 BCR-리간드-로 사용한다.
참고: Fc 수용체에 리간드가 결합되는 것을 방지하려면, 전체 길이 항체 대신 F(ab') 또는 F(ab') 2개의 항체 단편을 사용한다. - Ag 코팅 된 비드의 제조를 진행하려면, 샘플 조작 동안 비드 회수를 최대화하기 위해 낮은 단백질 결합 미세 원....
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결과
본 논문은 B 세포가 IS의 형성을 유도하기 위해 구슬 또는 커버립에 고정 된 항원을 사용하여 활성화 될 수있는 방법을 보여줍니다. 우리는 면역 형광에 의한 다른 세포기관의 편광을 식별하고 정량화하는 방법과 IS와의 연관성에 있어 역동적인 변화를 겪는 단백질을 특성화하는 방법에 대한 정보를 제공합니다. 생화학적 접근법.
면역 형광에 의한 B 세포의 화상 진찰은 우리가 B 세포 활성화시 IS에 모집되는 중심도, 골지 장치 및 리소좀과 같은 세포기관의 역학을 따르는 것을 허용합니다. 하나는 IS에 이 세포기관의 편광을 측정하고 다른 조건 하에서 그(것)들을 비교하기 위하여 양적 적인 매개변수를 장악할 수 있습니다. 그림 1A에서볼 수 있듯이, 센트로솜과 골지 장치는 B 세포 활성화 시 IS에 모집됩니다. 모집은 B.......
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토론
우리는 B 림프구가 IS의 형성을 촉진하기 위해 세포 내 아키텍처를 재구성하는 방법을 연구하는 포괄적 인 방법을 설명합니다. 이 연구는 B 세포 활성화 도중 중심도, 골지 장치 및 리소좀과 같은 세포기관의 세포내 분포를 정량화하기 위하여 화상 진찰 기술의 사용을 포함하고, 어떻게 IS에 편광하는지. 추가적으로, 우리는 B 세포 활성화시 중심 조성물의 변화를 연구하는 생화확적인 접근을 기술합니다.
B 세포에서 IS의 형성을 촉진하기 위해, 우리는 수용성 면역 복합체 대신 고정 된 항원 (항원 코팅 비드)을 사용했는데, 이는 세포골격 재배열과 세포기관이 분리된 접촉 부위의 설립을 촉발하기 때문입니다. 쉽게 연구 할 수 있습니다. 이미징 B 세포 활성화에서 중요한 양상은 샘플의 준비입니다. 모든 이미지 수집은 이상적으로 1 :1 세포를 얻어야한다 : 비드 비율, 항원 접촉의 독특한 사이트에 세포기관의 편광을 정량화. 그러나, 어떤 경우에는 B 세포가 2개 이상의 구슬을 포획할 수 있어.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
M.-I.Y.는 FONDECYT #1180900 연구 보조금으로 지원됩니다. J.I., D.F. 및 J.L.은 코미시온 나시오날 드 시엔시아 y 테크놀로지아의 펠로우십에 의해 지원되었다. 우리는 비디오 녹화 및 편집에 대한 폰티피시아 유니버시다드 카토리카 드 칠레에서 데이비드 오소리오에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| IIA1.6 (A20 변이) 마우스 B-림프종 세포 | ATCC | TIB-208 | 표면에 IgG 함유 BCR을 발현하는 염색체 Balb/c 기원의 마우스 B-세포 림프종 없음 FcγIIR |
| 100% 메탄올 | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 직경 10mm 커버 글래스 두께 No. 1 원형 | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-메르캅토에탄올 | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| 알렉사 488 형광- 동키 항 토끼 IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 희석 권장되지만 최적화해야 함 |
| 알렉사 플루오 546 염소 항-토끼 항 IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 희석 권장되지만 최적화해야 함 |
| 알렉사 플루오 647-커닝 된 팔로이딘 | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 희석 권장되지만 최적화해야 함 |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | DNA와 형질주입 시약을 혼합하는 데 제조업체 지침을 따르십시오 |
| Amaxa Nucleofector 모델 2b | Lonza | AAB-1001 | 프로그램 L-013 사용 |
| 아미노- 다이나 비드 | ThermoFisher | 14307D | |
| 항- 페리 센트린 | Abcam | ab4448 | 1:200 희석 권장되지만 최적화해야 함 |
| 항- rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 희석 권장되지만 최적화해야 함 |
| 항- sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 희석 권장되지만 최적화해야 함 |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| 배양 플레이트 T25 | BD | 353014 | |
| Fiji 소프트웨어 | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| 글루타민 | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 글루타르알데히드 | Sigma | G7651 | |
| 글리신 | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-마우스 IgG 항체 | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 양성 리간드 |
| Goat-anti-마우스 IgM 항체 | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 음성 리간드 |
| HyClone 태아 우 혈청 | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | 56 oC에서 30 분 동안 열 비활성화 |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS 현미경 | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| 니콘 일립스 Ti-E 형광 현미경 | Nikon | ||
| 파라필름 | M | P1150-2 | |
| 파라 포름알데히드 | Merck | 30525-89-4 | 안전 캐비닛에서 PBS로 4 % 희석하고 현재 사용 |
| 페니실린 - 스트렙토마이신 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 액체 |
| 폴리 비드 아미노 마이크로 구체 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| 폴리-L-리신 | Sigma | P8920 | 멸균수로 희석 |
| 토끼 항- 알파 튜불린 항체 | Abcam | ab6160 | 1:1000 희석 권장되지만 최적화해야 함 |
| 토끼 항- 마우스 lamp1 항체 | Cell signaling | 3243 | 1:200 희석 권장되지만 최적화해야 함 |
| 토끼 항- cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 희석 권장되지만 최적화해야 함 |
| 토끼 항- 감마 튜불린 항체 | Abcam | ab16504 | Western Blot에 대한 1:1000 |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| 사포닌 | Merck | 558255 | |
| 나트륨 피루브산 | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| 수크로스 | Winkler | SA-1390 | |
| 트리톤 X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| 튜브 50ml | Corning | 353043 |
참고문헌
- Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
- Batista, F. D., Harwood, N. E.
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재인쇄 및 허가
