방법 논문

면역 시 냅 스 형성 하는 동안 B 세포에서 세포 역학 공부

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DOI:

10.3791/59621

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2019년 6월 1일

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Immune Cell Biology, Department of Cellular and Molecular Biology, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Faculty of Medicine, Pontificia Universidad Católica de Chile, 3Centro de Investigaciones en Biología Celular y Biomedicina, Facultad de Ciencia, Universidad San Sebastián

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기서 우리는 IS의 형성 동안 B 림프구에서 세포 편광 사건을 특성화하는 두 가지 접근법을 기술한다. 첫 번째, 세포 기관 모집 및 시 냅 스 막에서 세포 골격 재배열의 정량화 포함. 두 번째는 면역 시냅스에 대한 편광을 겪는 중심도의 조성의 변화를 특성화하는 생화학적 접근법입니다.

초록

B 세포 수용체 (BCR)에 의한 표면 테더된 항원의 인식은 신호및 항원 세포 가 조정되는 면역 시냅스 (IS)의 형성을 유발합니다. IS 형성은 리소좀 및 골지 장치와 같은 중심도 및 관련 세포내 세포 기관의 시냅스 막에 편광된 모집을 수반하는 동적 액틴 리모델링을 포함한다. 액틴 리모델링의 초기 단계는 B 세포가 세포 표면을 증가시키고 시냅스에서 수집 된 항원 - BCR 복합체의 양을 최대화 할 수 있게합니다. 특정 조건하에서, B 세포가 단단한 표면에 관련되었던 항원을 인식할 때, 이 프로세스는 항원 추출을 촉진할 수 있는 리소좀의 현지 모집 및 분비에 결합됩니다. 취한 항원들은 T 도우미 세포에 대한 추가 프리젠 테이션을 위해 주요 조직 적합성 복합체 II (MHC-II) 분자에로드된 펩티드로 처리하기위한 전문 엔도 리소좀 구획으로 내재화됩니다. 따라서, IS의 형성과 관련되었던 세포역학을 공부하는 것은 B 세포가 활성화되는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. 본 기사에서 우리는 B 세포에 있는 IS의 대형과 연관되는 세포 내 세포기관 위치 및 세포골격 재배열에 있는 변경을 공부하기 위하여 이용된 화상 진찰 그리고 생화확적인 기술 둘 다 토론할 것입니다.

서론

B 림프구는 다른 위협에 대하여 항체를 생성하고 병원체를 침입에 책임 있는 적응면역 계통의 필수적인 부분입니다. 항체 생산의 효율은 B 세포가 수용성 또는 표면 테더형형태로발생하는 항원을 획득, 공정 및 존재하는 능력에 의해 결정된다 1,2. BCR에 의해, 제시 세포의 표면에 부착된 항원의 인식은 IS3,4라고불리는 가까운 세포간 접촉의 형성을 이끈다. 이 동적 플랫폼 내에서 BCR 의존다운 스트림 신호 및 내분형 구획으로 항원의 내재화가 모두 일어난다. 업크업 된 항원 처리 및 MHC-II 분자에 조립 하 고 이후에 T 림프구에 제시. B-T 세포 협력이라고 불리는 생산적인 B-T 상호작용은 B 림프구가 항체 생산 혈장 세포 또는 기억 세포로의 분화를 촉진하는 적절한 신호를 수신할 수 있도록한다8.

2개의 기계장치는 B 세포에 의하여 항원 추출에서 관련시켰습니다. 첫 번째는 시냅스 갈라진 부분5,6에서모집과 융합을 겪는 리소좀에서 유래한 프로테아제의 분비에 의존합니다. 두 번째 는, 클라트린 코팅 구덩이 7로 내면화되는 막을 포함하는 항원의 질을 유발하는 Myosin IIA 매개 당기기힘에 달려 있습니다. 항원 추출 모드는 항원이 발견되는 멤브레인의 물리적 특성에 의존합니다. 그럼에도 불구하고, 두 경우 모두, B 세포는 두 가지 주요 리모델링 이벤트를 겪는다: actin 세포 골격 재구성 및 IS에 세포기관의 양극화. Actin 세포 골격 리모델링은 초기 확산 단계를 포함, 시 냅 스 막에서 actin 의존 돌출 항원과 접촉 하는 표면을 증가. 이것은 항원과 결합된 Bcrs가 분자 모터와 액틴 세포골격 리모델링 8,9,10의공동 작용에 의해 IS의 중심에 집중되는 수축 단계에 선행됩니다. 11. 세포기관의 편광은 또한 액틴 세포 골격의 리모델링에 의존합니다. 예를 들어, 중도체는 핵에서 결합되지 않고, 관련 액틴의 국소 탈중합에 의해, IS5,12에이 소기관의 위치를 재배치할 수 있게 한다. B 세포에서, 하나의 세포극(IS)에 중도의 위치(spositions)는 시냅스 막에 리소좀 모집을 안내하며, 이는 분비시 표면 테더된 항원의 추출 및/또는 처리를 용이하게 할 수 있다6. IS에서 모집된 리소좀은 MHC-II로 풍부하게 되며, 이는 T 세포13에제시될 내인성 구획에서 펩티드-MHC-II 복합체의 형성을 선호한다. 추가적으로, Golgi 장치는 또한 IS14에밀접하게 모집되는 것으로 관찰되었습니다, 분비 통로에서 골지 유래 소포가 항원 추출 및/또는 처리에 관여할 수 있었다는 것을 건의합니다.

전부, 시냅스 대형 도중 B 세포에 있는 세포내 세포기관 및 세포골격 재배열은 그들의 추가 활성화를 위해 요구된 능률적인 항원 취득 및 처리를 허용하는 중요한 단계입니다. 이 작품에서는 IS의 형성과 관련된 세포내 세포 내 리모델링을 연구하기 위해 B 세포에서 이미징 및 생화학 분석을 수행하는 방법에 대한 자세한 프로토콜을 소개합니다. 이러한 기술은 다음과 같습니다: (i) 항원 코팅 비드와 항원 코팅 커버슬립으로 활성화된 B 세포의 면역형광 및 이미지 분석, 이는 IS에 동원되는 세포내 성분의 시각화 및 정량화를 가능하게 한다(ii ) 자당 그라데이션에 대한 초원심분리에 의해 B 세포에서 중심도가 풍부한 분획을 분리하여 세포 극성 조절에 잠재적으로 관여하는 중도체와 관련된 단백질을 식별할 수 있습니다.

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프로토콜

참고: 다음 단계는 IIA1.6 B 세포를 사용하여 수행하였다.

1. 항원 코팅 구슬B를 가진 B 세포 활성화

  1. 항원 코팅 구슬의 제조
    1. B 세포를 활성화하려면NH 2-비드를 공동으로 코팅된 항원(Ag-코팅 비드)을 사용하며, 3 μm NH 2-비드의 50μL(~20 x 106 비드)을 사용하여 활성화(BCR-리간드+) 또는 비활성화(BCR-리간드)항원을 사용한다.
    2. IIA1.6 B 세포에 대 한 안티-IgG-F (ab') BCR-리간드 및 안티-IgM-F (ab')2 또는 소 혈 청 알부민 (BSA)로2 단편을 BCR-리간드-사용. 1차 B 세포 또는 IgM+ B 세포수를 활성화시키기 위해 BCR-리간드+및 BSA로서 항-IgM-F(ab')2를 BCR-리간드-로 사용한다.
      참고: Fc 수용체에 리간드가 결합되는 것을 방지하려면, 전체 길이 항체 대신 F(ab') 또는 F(ab') 2개의 항체 단편을 사용한다.
    3. Ag 코팅 된 비드의 제조를 진행하려면, 샘플 조작 동안 비드 회수를 최대화하기 위해 낮은 단백질 결합 미세 원심 분리 튜브에 구슬을 배치합니다. 1mL의 인산완충식염수(PBS)를 추가하여 구슬과 원심분리기를 16,000 x g에서 5분 동안 세척합니다.
    4. NH2 기를 활성화하고 실온 (RT)에서 4 시간 동안 회전하기 위해 8 % 글루타랄데히드의 500 μL로 구슬을 다시 일시 중단하십시오.
      주의: 글루타랄데히드 스톡 용액은 화학 연기 후드에만 사용해야 합니다. 재료 안전 데이터 시트(MSDS)의 지침을 따르십시오.
    5. 원심 분리기 구슬을 16,000 x g에서 5 분 동안, 글루타랄데히드를 제거하고 1 x PBS의 1 mL로 3 번 더 구슬을 씻는다.
      주의: 글루타랄데히드 용액은 유해 화학 폐기물로 폐기되어야 합니다.
    6. 1x PBS의 100 μL에서 활성화된 비드를 다시 일시 중단합니다. 샘플은 두 개의 저단백 결합 미세원심지 튜브로 나눌 수 있습니다: BCR-리간드+에 대해 50 μL 및 BCR-리간드에 대한 50 μL-.
    7. 항원 용액을 준비하기 위해 PBS의 150 μL에서 항원 용액의 100 μg/mL을 함유하는 2 mL 저단백질 결합 미세원심지 튜브 2개를 사용한다: BCR-리간드를 함유한 튜브 1개 및 BCR-리간드를 함유한 튜브 1개.
    8. 항원 용액 150 μL을 함유하는 각 튜브에 활성화 된 비드 용액 50 μL을 추가하고 4 °C에서 밤새 회전하십시오.
    9. 500 μL의 10 mg/mL BSA를 추가하여 구슬에 남은 반응성 NH2 기를 차단하고 4 °C에서 1 시간 동안 회전합니다.
    10. 4°C에서 5분 동안 16,000 x g에서 구슬을 원심분리하고 상한체를 제거한다. 차가운 1x PBS로 구슬을 세 번 더 씻으소서.
    11. 활성화된 비드를 1x PBS의 70 μL로 다시 중단합니다.
    12. Ag 코팅 된 비드의 최종 농도를 결정하려면 PBS (1:200)에서 소량의 구슬을 희석하고 혈세포계를 사용하여 계산하십시오. 그런 다음 사용할 때까지 4°C에서 보관하십시오.
      참고: Ag 코팅 비드는 1개월 이상 보관해서는 안 됩니다.
  2. 폴리-L-리신 커버립의 준비
    1. Ag 코팅 된 구슬로 B 세포 활성화 분석하기 전에 폴리 - L - 리신 코팅 커버 슬립 (PLL-커버슬립)을 준비하십시오. PLL 용액의 40mL w/v를 함유한 50mL 튜브를 사용하고 12mm 직경의 커버슬립을 용액에 담급전시. RT에서 밤새 회전합니다.
    2. 커버슬립을 1x PBS로 씻고 파라핀 필름으로 덮인 24웰 플레이트 뚜껑에 말리십시오. B 세포 활성화를 진행합니다.
  3. B 세포 활성화
    1. 구슬로 B 세포 활성화를 시작하려면 먼저 IIA1.6 B 세포줄을 클릭 배지에서 1.5 x 106 세포/mL로 희석합니다(RPMI-1640은 2mMM L-Alanine-L-글루타민 + 55μM 베타-메르카포에탄올 + 1mM 피루바테 + 100 U/m 연쇄상 구균) + 5% 열 불활성화 태아 소 혈청 [FBS]).
    2. IIA1.6 B 세포의 100 μL (150,000 세포)을 0.6 mL 튜브에서 1:1 비율로 Ag 코팅 된 비드와 결합합니다. 소용돌이를 사용하여 부드럽게 섞고 PLL 커버슬립에 씨를 뿌린다. 세포 배양 인큐베이터에서 상이한 시간 지점에 대한 배양(37°C/5% CO2). 일반적인 활성화 시간점은 0, 30, 60 및 120분입니다. 시간 0의 경우 PLL 커버슬립을 얼음 위에 있는 24웰 플레이트 뚜껑에 넣습니다. 세포-Ag 코팅 된 비드 혼합물을 넣고 얼음에 5 분 동안 배양합니다.
      참고 : 이 파이펫의 플라스틱 팁에 축적으로 인해 샘플의 구슬의 수를 줄일 수 있기 때문에, 위아래로 파이펫 대신 소용돌이에 의해 혼합하는 것이 중요하다. BCR-리간드로 코팅된 비드를 각 분석에 대한 음의 대조군으로 사용한다. 가장 긴 인큐베이션 시간을 먼저 활성화한 다음 다음 다음 시간 지점을 활성화하는 것이 좋습니다. 동시에 고정할 준비가 되도록 샘플에 대한 활성화 간격을 계산합니다.
    3. 각 커버슬립에 100 μL의 콜드 1x PBS를 추가하여 활성화를 중지하고 면역 형광 프로토콜을 계속합니다. 프로토콜 섹션 3을 참조하십시오.

2. 항원 코팅 커버립에 B 세포 활성화

  1. 항원 코팅 커버립의 준비
    1. 활성화하기 전에 항원 용액 (10 μg / mL BCR-ligand +와 0.5 μg / mL 쥐 항 마우스 CD45R / B220을 포함하는 1x PBS)를 준비하십시오.
      참고: 분석 전날 표지를 준비하는 것을 고려해 보십시오. B220은 B 세포 접착력을 향상시키지만, BCR-리간드+는 확산 반응을 생성하기에 충분하다.
    2. 12mm 커버슬립을 파라핀 필름으로 덮인 24웰 플레이트 뚜껑에 놓고, 각 커버슬립에 40 μL의 항원 용액을 넣고 밤새 4°C에서 배양합니다. 항원 용액의 증발을 피하기 위해 플레이트를 밀봉하십시오.
    3. 커버슬립을 1x PBS로 씻고 공기 건조시.
  2. B 세포 활성화
    1. 활성화를 시작하려면 IIA1.6 B 세포를 클릭 배지 + 5% FBS에서 1.5 x 106 셀/mL로 희석합니다.
    2. 100 μL의 세포를 항원 코팅 커버슬립(Ag-coverslip)에 넣고 37°C/5% CO2에서 세포 인큐베이터에서 서로 다른 시간 지점에 대해 활성화합니다. 일반적인 활성화 시간 점은 0, 30 및 60분입니다.
      참고: 섹션 1에서와 같이 모든 샘플을 동시에 수정하려면 가장 긴 활성화 시간 지점부터 시작하는 것이 좋습니다.
    3. 시간 0의 경우, Ag 커버슬립이 들어 있는 24웰 플레이트 뚜껑을 얼음 위에 놓고 세포를 추가합니다. 얼음에 5 분 동안 배양.
    4. 각 Ag 커버 슬립에 미디어를 조심스럽게 흡인한 다음 100 μL의 콜드 1x PBS를 추가하여 활성화를 중지합니다. 면역 형광 프로토콜을 계속하십시오. 섹션 3을 참조하십시오.

3. 면역 형광

참고 : IIA 1.6 B 세포의 BCR로 이차 항체의 교차 반응성을 피하려면 마우스 유래 1 차 항체를 사용하지 마십시오.

  1. 1x PBS를 제거하고 각 커버슬립의 고정을 진행합니다.
    참고: 사용할 고정 매체를 결정하려면 항체/염료 데이터 시트를 확인하십시오. 예를 들어, 플라할로이드에 의한 액틴 라벨링의 경우 파라포름알데히드(PFA) 고정 배지를 사용하고, 에리센트린에 의한 중심 라벨링에는 메탄올 고정을 사용한다.
    1. 4% PFA로 보충된 1x PBS 50 μL을 넣고 RT에서 10분 동안 배양합니다.
      주의: 포름알데히드는 독성이 있습니다. 이 화학 물질로 작업하기 전에 MSDS를 읽어보시기 바랍니다. PFA 용액은 장갑과 안전 안경을 착용한 화학 연기 후드 에서만 이루어져야 합니다. PFA 용액은 유해 화학 폐기물로 폐기되어야 합니다.
    2. 또는 50 μL의 차가운 메탄올을 넣고 20 분 동안 배양하십시오.
  2. 1x PBS로 세 번 씻으소서.
    참고: 커버슬립은 이 시점에서 4°C에서 1x PBS에서 최대 3일 동안 보관할 수 있습니다.
  3. 1x PBS를 제거하고 각 커버슬립에 차단 완충액 50 μL(2% BSA + 1x PBS에 0.3M 글리신)을 추가합니다. RT에서 10분 동안 배양합니다.
  4. 부드럽게 흡인하고 50 μL의 투과 버퍼 (PB)를 추가하십시오 (0.2 % BSA + 1 x PBS에서 0.05 % 사포닌). RT에서 20분 동안 배양합니다.
  5. PB에서 항체 또는 염료를 준비하고 (커버슬립당 30 μL 사용) 4°C에서 1시간 또는 하룻밤 동안 RT에서 배양합니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
    1. 미세투관 조직 센터(MTOC) 또는 중센트에 라벨을 붙이려면 다음 항체를 사용한다: 항γ-Tubulin (1:500), 항-Cep55 (1:500), 항α-tubulin (1:500), 항-연공회린(1:1000).
      참고: 중심표지B세포의 경우 센트린-GFP 발현 플라스미드로 형질전환될 수 있다.
    2. 골지 장치에 라벨을 붙이기 위해 반 라브6a (1:500)를 사용하십시오.
      참고: 다른 항체 또는 염료도 사용할 수 있습니다.
    3. 리소좀에 라벨을 붙이면 램프 방지1(1:200)을 사용한다.
      참고 : 항 H2-DM 및 항 MHC-II는 항원 처리 구획15,16에라벨을 붙이는 데 사용할 수 있습니다.
    4. 호반 망상에 라벨을 붙이기 위해 안티 Sec61a (1:500)를 사용하십시오.
    5. 액틴 세포골격의 경우 다음을 고려하십시오: 중합 된 액틴은 형광 염료에 공액된 Phalloidin에 의해 시각화 될 수 있습니다.
      참고: LifeAct-GFP/RFP 발현 플라스미드로 형질감염된 B 세포는 액틴에 라벨을 붙이는 데에도 사용될 수 있다.
  6. PBS로 커버립을 세 번 씻으하십시오.
  7. PBS에서 이차 항체 또는 염료를 희석하고 (커버슬립당 30 μL 사용) RT에서 1시간 배양한다.
    참고: 형광 신호의 품질을 유지하기 위해 샘플을 직접 광에 노출하지 마십시오.
  8. PBS로 커버립을 세 번 씻으하십시오.
  9. 커버슬립에서 PBS 솔루션을 제거합니다.
  10. 현미경 슬라이드에 장착 시약 4 μL을 추가합니다. 커버슬립을 셀 쪽이 아래를 향하도록 슬라이드에 장착합니다. 슬라이드를 37°C에서 30분 간 또는 RT에서 밤새 건조시키십시오.
    참고: "안티 페이드" 장착 시약을 사용하는 것이 좋습니다(재료 표참조).
  11. 60x 또는 100x 오일 침지 목표를 가진 공초점 또는 에피플루온 현미경으로 형광 이미지를 획득합니다. 각 획득에 대해 비드와 상호 작용하는 B 세포를 쉽게 식별하기 위해 투과된 광 또는 밝은 필드를 고려한다.
    참고: z-stacks를 사용하여 전체 셀을 덮는 3차원(3D) 이미지를 사용합니다. 0.5 μm 두께의 스택을 복용하는 것이 좋습니다, 그러나 이것은 현미경에 따라 달라집니다.

4. 이미지 분석

참고: ImageJ 소프트웨어에 대해 다음 알고리즘에 대해 설명합니다. 그러나 이 작업을 동일한 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다. 또한 모든 형광 강도 측정에서 이 매개 변수는 영역을 고려하여 이미지의 각 픽셀에서 총 형광량을 고려하기 때문에 통합 형광 밀도(ImageJ의 "RawIntDen")를 사용합니다.

  1. Ag 코팅 된 구슬로 활성화 된 B 세포에서 세포기관의 분포 분석
    참고: IS에 대한 세포 성분의 편광을 정량화하기 위해 임의의 값을 IS에 대한 근접성의 척도로 정의합니다. 인덱스 범위는 -1(편광 방지)과 1(완전히 편광된 비드의 오브젝트)이며, 이전에 Reversat 등에서 제시한 바와 같이.12세.
    1. 중심및골기장치에 대한 극성 지수를 추정한다(그림1B).
      참고: 이 알고리즘은 원 포인트에 국한된 세포기관에 사용할 수 있습니다.
      1. 먼저 비드 및 셀 영역을 정의하여 원 도구 선택을 사용하여 분석하여 둘 다의 경계를 구분한 다음 관심 영역(ROI)으로 저장합니다. 그림1, 그림2, 그림 3및 그림 4를참조하십시오.
      2. 분석 | 실행하여 셀 중심(CC)과 비드 중심(BC)을 결정합니다. 셀 과 비드 영역에 각각 측정합니다. 결과 창에서 가져온 X 및 Y 값은 중심 좌표를 결정합니다.
      3. ImageJ에서 포인트 툴 선택을 사용하여 중도또는 골지 장치(Organelle)의 중심을 수동으로 결정하고 실행 분석 | 측정. 결과 창에서 가져온 X 및 Y 값은 좌표를 결정합니다.
      4. 그런 다음 각도 도구를 사용하여 CC에서 Organelle(a) 및 CC에서 BC(b)까지 각도를 그리고 분석 실행을 사용합니다 | 측정. 결과 창의 각도 값은 두 벡터(a 및 b) 사이의 각도(α)를 나타낸다.
      5. 다음 수식을 사용하여 극성 인덱스를 계산합니다.
        figure-protocol-1
    2. 리소좀에 대한 극성 지수를 추정합니다(그림1F).
      참고: 이 알고리즘을 사용하여 리소좀과 같이 분산된 분포를 표시하는 소기관의 극성을 분석합니다.
      1. 원 도구 선택을 사용하여 둘 다의 경계를 구분하고 ROI로 저장하여 분석할 비드 및 셀 영역을 정의합니다. 비드 및 세포 영역이 결정되면 형광 채널을 설정하고 이미지를 하나의 z 스택으로 투영합니다(이미지| 스택 | Z-프로젝트 [합계 조각]),다음 분석 실행 | 결과 창에서 매스 중심(MC) 좌표(MX 및 MY)를 측정하고 추출합니다.
      2. MC에 대한 오르간을 변경하기 전에 언급 한 동일한 알고리즘을 적용합니다. 따라서, 각도(α)는 CC-MC(a) 및 CC-BC(b)에 의해 정의된다.
      3. 다음 수식을 사용하여 극성을 계산합니다.
        figure-protocol-2
    3. 시냅스 부위에 대한 리소좀모집을 추정한다(그림 2B).
      참고: 이 알고리즘은 IS에 인접한 세포기관을 정량화하는 데 사용됩니다.
      1. 비드 영역과 셀 영역이 결정되면 CC와 BC 사이의 벡터 각도를 결정한 다음 이미지를 회전하여 0° 각도를 달성합니다.
      2. 형광 채널을 설정하고 이미지를 하나의 z 스택으로 투영합니다(이미지| 스택 | Z-Project [Sum slices]),셀 과 비드 영역 외부에 떨어지는 모든 형광을 제거합니다 (ImageJ에서 외부로 편집 | 지우기 실행).
      3. 직사각형 도구 선택을 사용하여, 비드에 인접한 직사각형을 그리고 시냅스 영역 형광(SAF)을 측정한다. 이 사각형은 셀 너비의 분기입니다.
      4. 전체 이미지를 선택하고 분석 실행 | 전체 세포 형광(WCF)을수득하는 측정.
      5. 다음 공식을 사용하여 IS에 인접한 소기관 형광 비율을 계산합니다.
        figure-protocol-3
    4. 세포 성분의 모집을 중심도에 정량화합니다.
      참고 : Obino 등 5에서 적응된이 알고리즘은 중심도 영역에서 세포기관의 농축을 정량화하는 데 사용됩니다. 간략하게, 우리는 중도 관련 소기관 형광이 형광/반경 플롯에서 일정하거나 70% 이상 남아 있는 도메인으로 중심 영역을 고려합니다. 이 반경은 활성화 시 변경될 수 있으므로 휴지 조건에서 이 매개 변수를 설정하는 것이 필수적입니다.
      1. 비드 및 셀 영역이 결정되면 점 도구 선택을 사용하여 중심의 국소화를 정의합니다(그림3B).
      2. 먼저 중심을 둘러싼 3 μm 반지름 원을 그려 정량화할 수 있는 중심 주위의 최대 면적을 결정합니다.
      3. 동심 원의 형광을 측정하고 형광/반지름 플롯을 표시하는 ImageJ 플러그인 방사형프로파일을 사용합니다.
      4. 형광 강도의 70% 이상이 유지되는 최대 반경을 식별합니다.
      5. 다음 공식을 사용하여 형광 밀도 비율을 계산합니다.
        figure-protocol-4=figure-protocol-5
        참고: 형광 밀도 비율은 전체 세포에서의 분포와 비교하여 중심에서 소기관의 농도를 나타냅니다.
  2. Ag-covers슬립에서 활성화된 B 세포에서 세포 전광 및 세포기관 분포 분석
    1. IS에서 세포 분포를추정 (그림 4B).
      참고 :이 알고리즘은 세포기관의 XY 분포와 IS의 중심에 있는 농도를 정량화할 수 있습니다. 우리는 중앙과 총 시냅스 영역 사이의 형광 밀도의 비율을 정의합니다. 얻어진 값은 각각 소기관의 말초 또는 중앙 분포를 나타내는 부정에서 양성으로 변화할 수 있습니다.
      1. 셀이 덮개와 접촉하는 슬라이스를 확인합니다.
        참고: 세포 경계를 구분하기 위해 IS의 주변에 농축되는 플라즈마 멤브레인 또는 액틴에 라벨을 붙일 수 있습니다.
      2. 슬라이스 의 유형을 8 비트로 변경한 다음 비나화 (프로세스| 바이너리 | 바이너리만들기) 가장 가까운 외부 지점 프로세스를 연결 | 바이너리 | 개요. 다각형 도구 선택을 사용하여셀 영역(CA)의 경계를 구분합니다.
        참고: 이 단계는 셀 경계의 대비를 높이고 쉽게 식별할 수 있도록 하는 데 유용합니다. 또한 이 시점에서 ImageJ의 파티클 분석 플러그인을 적용하여 CA를 자동으로 결정할 수 있습니다. 그러나 동일한 필드에 있는 다른 셀은 결과를 방해할 수 있습니다.
      3. CA 매개변수(높이 및 너비)를 취하고 높이와 너비 값의 분기로 경계에서 분리된 중앙 둥근 영역을 구분하여 이 영역을 셀 중심 영역(CCA)으로 간주합니다.
      4. 다음 수식을 사용하여 IS의 중심에 있는 형광 밀도 분포를 계산합니다.
        figure-protocol-6
    2. Z 평면에서 세포분포를 측정합니다(그림4C).
      참고: 이 분석은 Ag-covers입술에 활성화된 B 세포의 Z 평면에 걸쳐 세포기관 형광의 일반적인 분포를 결정하여 Z 분획당 형광의 백분율을 표시합니다.
      1. Z에서 형광 분포를 정량화하기 위해 먼저 세포가 Ag 커버슬립과 접촉하는 IS의 평면을 결정한 다음 셀의 상한에 대응하는 평면을 결정합니다.
      2. 셀 중심을 가로질러 선을 그립니다.
      3. Z(이미지 | 이미지에서 이미지 슬라이스 스택 | 슬라이스)XZ 이미지를 가져옵니다.
      4. XZ 이미지를 측정하고 XZ 이미지를 아래쪽(IS 인터페이스)에서 위쪽(셀의 위쪽)까지 동일한 높이(Z 분획)의 연속 10개의 연속사각형으로 나누고 각 이미지의 형광 신호를 정량화합니다.
      5. 각 Z 분획의 형광 강도를 10분분의 총 형광의 합에 의해 정규화한다.
      6. 셀의 Z 분율당 형광 강도의 백분율을 플로팅합니다.

5. 휴식 및 활성화 된 B 세포에서 중심도 농축 분획의 격리

참고: 단백질 분해를 방지하기 위해 실험 중에 모든 솔루션을 4°C로 유지하십시오. 이 프로토콜은 이전 작업17,18에서채택되었습니다.

  1. 클릭 배지 2m + 열 불활성화 FBS(비율 1:1)에서 Ag 코팅 된 비드로 2 x 107 B 셀을 활성화하십시오. 비활성화 B 세포를 휴식 B 세포로 고려하십시오.
  2. 시토샬라신 D (2 μM)와 노코다졸 (0.2 μM)을 넣고 37 °C에서 1 시간 동안 배양하십시오.
    참고 : 이 약은 핵 오염을 피하기 위해 각각 액틴 세포 골격과 미세 소관을 중합하여 핵에서 중심도를 부드럽게 분리하는 데 사용됩니다.
  3. 차가운 1x TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl)의 5 mL로 각 샘플을 씻은 다음 0.1 x TBS의 1 mL로 8 % 자당으로 보충하십시오.
  4. 150 μL의 중심도 용해 완충액(1mM HEPES, pH 7.2, 0.5% NP-40, 0.5 mM MgCl2,0.1% 베타-메르카포에탄올, 1 mM 페닐메틸설포닐 불소(PMSF) 또는 프로테아제 억제제 칵테일까지 감소하면 샘플에서 세포 가온이 식별된다는 것을 나타냅니다. 샘플을 1.5 mL 튜브에 넣습니다.
  5. 원심분리기는 4°C에서 10분 동안 1000 x g에서, 세포기관을 핵으로부터 분리한다.
  6. 조심스럽게 상판을 회수하고 그라데이션 버퍼 (GB)의 300 μL (10 mM PIPES pH 7.2, 0.1 % 트리톤 X-100, 0.1 % 베타 메르카포에탄올)이 60 % 수크로오스를 함유 한 1.5 mL 튜브 위에 놓습니다.
  7. 원심분리기는 10,000 x g에서 4°C에서 30분 동안 60% 자당 분획에 중심도를 집중시다.
  8. 한편, GB + 70% 자당의 450 μL을 GB + 50% 자당270 μL, 그리고 270 μL의 GB + 40% 자당을 겹쳐서 2 mL 초원심지 튜브에서 불연속 그라데이션을 준비한다.
  9. 첫 번째 원심분리(centrosome-농축 분획) 후, 계면에 도달할 때까지 상부 분획(덜 조밀한 부분)을 버리고 튜브에 남은 샘플을 소용돌이에 도달합니다. 그런 다음, 이전에 중심도 농축 샘플로 제조된 불연속 그라데이션 위에 오버레이한다.
    참고 : 그라데이션을 방해하지 않도록주의, 모든 파이펫팅 절차는신중하게 수행해야합니다.
  10. 4°C에서 4°C에서 40,000 x g의 원심분리기와 최소한의 가속으로 원심분리기 브레이크가 꺼져 그라데이션을 방해하지 않도록 합니다.
  11. 100 μL의 12 분획을 상단부터 별도의 튜브로 수집합니다.
  12. centrosome 마커로 γ-tubulin를 사용하여 면역 블롯에 의해 중심도 농축 분획을 확인합니다.
    참고 : 우리는 일반적으로 분획 6과 8 사이의 중심이 풍부한 추출물을 찾습니다.

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결과

본 논문은 B 세포가 IS의 형성을 유도하기 위해 구슬 또는 커버립에 고정 된 항원을 사용하여 활성화 될 수있는 방법을 보여줍니다. 우리는 면역 형광에 의한 다른 세포기관의 편광을 식별하고 정량화하는 방법과 IS와의 연관성에 있어 역동적인 변화를 겪는 단백질을 특성화하는 방법에 대한 정보를 제공합니다. 생화학적 접근법.

면역 형광에 의한 B 세포의 화상 진찰은 우리가 B 세포 활성화시 IS에 모집되는 중심도, 골지 장치 및 리소좀과 같은 세포기관의 역학을 따르는 것을 허용합니다. 하나는 IS에 이 세포기관의 편광을 측정하고 다른 조건 하에서 그(것)들을 비교하기 위하여 양적 적인 매개변수를 장악할 수 있습니다. 그림 1A에서볼 수 있듯이, 센트로솜과 골지 장치는 B 세포 활성화 시 IS에 모집됩니다. 모집은 B...

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토론

우리는 B 림프구가 IS의 형성을 촉진하기 위해 세포 내 아키텍처를 재구성하는 방법을 연구하는 포괄적 인 방법을 설명합니다. 이 연구는 B 세포 활성화 도중 중심도, 골지 장치 및 리소좀과 같은 세포기관의 세포내 분포를 정량화하기 위하여 화상 진찰 기술의 사용을 포함하고, 어떻게 IS에 편광하는지. 추가적으로, 우리는 B 세포 활성화시 중심 조성물의 변화를 연구하는 생화확적인 접근을 기술합니다.

B 세포에서 IS의 형성을 촉진하기 위해, 우리는 수용성 면역 복합체 대신 고정 된 항원 (항원 코팅 비드)을 사용했는데, 이는 세포골격 재배열과 세포기관이 분리된 접촉 부위의 설립을 촉발하기 때문입니다. 쉽게 연구 할 수 있습니다. 이미징 B 세포 활성화에서 중요한 양상은 샘플의 준비입니다. 모든 이미지 수집은 이상적으로 1 :1 세포를 얻어야한다 : 비드 비율, 항원 접촉의 독특한 사이트에 세포기관의 편광을 정량화. 그러나, 어떤 경우에는 B 세포가 2개 이상의 구슬을 포획할 수 있어...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

M.-I.Y.는 FONDECYT #1180900 연구 보조금으로 지원됩니다. J.I., D.F. 및 J.L.은 코미시온 나시오날 드 시엔시아 y 테크놀로지아의 펠로우십에 의해 지원되었다. 우리는 비디오 녹화 및 편집에 대한 폰티피시아 유니버시다드 카토리카 드 칠레에서 데이비드 오소리오에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
IIA1.6 (A20 변이) 마우스 B-림프종 세포ATCCTIB-208표면에 IgG 함유 BCR을 발현하는 염색체 Balb/c 기원의 마우스 B-세포 림프종 없음 FcγIIR
100% 메탄올Fisher ScientificA412-4
직경 10mm 커버 글래스 두께 No. 1 원형Marienfield-Superior111500
2-메르캅토에탄올Thermo Fisher Scientific21985023
알렉사 488 형광- 동키 항 토끼 IgG LifeTech A212061:500 희석 권장되지만 최적화해야 함
알렉사 플루오 546 염소 항-토끼 항 IgGThermo Fisher Scientific A-110711:500 희석 권장되지만 최적화해야 함
알렉사 플루오 647-커닝 된 팔로이딘Thermo Fisher Scientific A212381:500 희석 권장되지만 최적화해야 함
Amaxa Nucleofection kit VLonzaVCA-1003DNA와 형질주입 시약을 혼합하는 데 제조업체 지침을 따르십시오
Amaxa Nucleofector 모델 2bLonzaAAB-1001프로그램 L-013 사용
아미노- 다이나 비드ThermoFisher14307D
항- 페리 센트린 Abcamab4448 1:200 희석 권장되지만 최적화해야 함
항- rab6Abcamab959541:200 희석 권장되지만 최적화해야 함
항- sec61Abcamab155751:200 희석 권장되지만 최적화해야 함
BSA Winkler BM-0150
CaCl2WinklerCA-0520
배양 플레이트 T25BD353014
Fiji 소프트웨어Fiji col.
Fluoromount GElectron Microscopy Science17984-25
글루타민Thermo Fisher Scientific35050061
글루타르알데히드Sigma G7651 
글리신Winkler BM-0820
Goat-anti-마우스 IgG 항체Jackson ImmunoResearch315-005-003IIA1.6 양성 리간드
Goat-anti-마우스 IgM 항체Thermo Fisher Scientific31186IIA1.6 음성 리간드
HyClone 태아 우 혈청Thermo Fisher ScientificSH30071.0356 oC에서 30 분 동안 열 비활성화
KClWinklerPO-1260
Leica SP8 TCS 현미경Leica
NaClWinklerSO-1455
니콘 일립스 Ti-E 형광 현미경 Nikon
파라필름MP1150-2
파라 포름알데히드Merck30525-89-4안전 캐비닛에서 PBS로 4 % 희석하고 현재 사용
페니실린 - 스트렙토마이신Thermo Fisher Scientific15140122액체
폴리 비드 아미노 마이크로 구체 3.00μmPolyscience17145-5
폴리-L-리신SigmaP8920멸균수로 희석
토끼 항- 알파 튜불린 항체Abcamab61601:1000 희석 권장되지만 최적화해야 함
토끼 항- 마우스 lamp1 항체Cell signaling32431:200 희석 권장되지만 최적화해야 함
토끼 항- cep55 Abcamab1704141:500 희석 권장되지만 최적화해야 함
토끼 항- 감마 튜불린 항체 Abcamab16504 Western Blot에 대한 1:1000
RPMI-1640Biological Industries01-104-1A
사포닌 Merck558255
나트륨 피루브산Thermo Fisher Scientific11360070
수크로스Winkler SA-1390 
트리톤 X-100 Merck9036-19-5
튜브 50mlCorning353043

참고문헌

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