여기에서는 CRISPR/Cas9 시스템을 통해 CAR-T 세포를 유전적으로 편집하는 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
키메라 항원 수용체 T (CAR-T) 세포 치료는 암에 대한 최첨단 잠재적으로 혁명적 인 새로운 치료 옵션입니다. 그러나, 암의 치료에 그것의 광범위 한 사용에 상당한 제한이 있다. 이러한 제한은 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 및 신경 독성 (NT) 및 고형 종양에서 제한된 확장, 이펙터 기능 및 항 종양 활성과 같은 독특한 독성의 개발을 포함한다. CAR-T 효능및/또는 CAR-T 세포의 독성을 조절하는 한 가지 전략은 CAR-T 세포 제조 중에 CAR-T 세포의 게놈을 스스로 편집하는 것입니다. 여기에서, 우리는 과립구 대식세포 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 Cas9에 가이드 RNA를 포함하는 렌티 바이러스 구조를 가진 transduction를 통해 CAR-T 세포에 있는 CRISPR/Cas9 유전자 편집의 사용을 기술합니다. 예를 들어, 우리는 GM-CSF의 CRISPR / Cas9 중재 녹아웃을 설명합니다. 우리는 이 GM-CSFk/o CAR-T 세포가 중요한 T 세포 기능을 유지하면서 효과적으로 적은 GM-CSF를 생성하고 야생 형 CAR-T 세포에 비해 생체 내에서 향상된 항 종양 활성을 초래한다는 것을 보여주었습니다.
서론
키메라 항원 수용체 T (CAR-T) 세포 치료는 암 치료에 큰 약속을 전시한다. 1개 , 2 CD19(CART19)를 표적으로 하는 2개의 CAR-T 세포 치료는 다중 센터 임상 시험에서 눈에 띄는 결과를 입증한 후에 B 세포 악성에 있는 사용을 위해 최근 유나이티드 명시된 및 유럽에서 승인되었습니다. 3개 , 4개 , 5 CAR-T 세포의 보다 광범위한 사용에 대한 장벽은 고형 종양에서 제한된 활성및 사이토카인 방출 증후군(CRS) 및 신경독성(NT)을 포함한 관련 독성이다. 3개 , 5개 , 6개 , 7명 , 8개 , 9 CAR-T 세포 치료의 치료 지수를 향상시키기 ....
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프로토콜
이 프로토콜은 메이요 클리닉의 기관 검토 위원회 (IRB) 및 기관 생물 안전위원회 (IBC)의 지침을 따릅니다.
1. CART19 셀 생산
- T 세포 분리, 자극, 및 전 생체 배양
- 적절한 개인 보호 장비를 활용하여 세포 배양 후드에서 모든 세포 배양 작업을 수행합니다. PBMC의 실행 가능한 근원으로 apheresis 도중 집합된 de-identified 정상 기증자 혈액 콘에서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수확하십시오.13
- PBMC를 분리하려면 밀도 그라데이션 매체의 15mL를 50mL 밀도 그라데이션 분리 튜브에 추가합니다. 세포 포획을 피하기 위해 2% 태아 소 혈청(FBS)을 함유하는 인산완충식염수(PBS)와 동일한 부피로 기증자 혈액을 희석합니다.
- 원뿔에서 희석 된 기증자 혈액을 분리 튜브에 추가하고 혈액과 밀도 구배 배지 사이의 계면을 방해하지 않도록주의하십시오. RT에서 10 분 동안 1,200 x g의 원심 분리기.
- 상급체를 새로운 50 mL 원뿔형으로 장식하고, 최대 40 mL까지 가져와서 PBS + 2 % FBS로 씻고, RT에서 8 분 동안 300 x....
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결과
그림 1은 GM-CSFk/o CART19 셀에서 GM-CSF의 감소를 나타낸다. T 세포의 게놈이 녹아웃 GM-CSF로 변경되었는지 확인하기 위해, TIDE 시퀀싱을 GM-CSFk/o CART19 세포(도1A)에서사용하였다. CAR-T 세포 표면 염색은 T 세포가 살아있는 CD3+ 세포상에서 게이팅을 통해 시험관 내에서 CAR 표면 수용체를 성공적으로 발현하는 것을 확인한다(도1B). 유세포분석에 의한 GM-CSF의 세포내 염색은 살아있는 CD3+ 세포에서 게이팅함으로써 GM-CSF에서 GM-CSF의 감소된 발현을 입증하고, 녹아웃의 기능적 성공을 검증한다(도 1C). GM-CSFk/o
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토론
이 보고서에서는 CRISPR/Cas9 기술을 활용하여 CAR-T 세포의 이차 수정을 유도하는 방법론을 설명합니다. 구체적으로, 이것은 GM-CSFk/o CART19 세포를 생성하기 위해 관심 유전자및 Cas9를 표적화하는 gRNA를 포함하는 바이러스 벡터를 이용한 렌티바이러스 트랜스덕션을 사용하여 입증된다. 우리는 이전에 GM-CSF 중화가 이종이식 모델에서 CRS 및 NT를 개량한다는 것을 보여주었습니다. 12 앞에서 설명한 바와 같이, GM-CSFk/o CAR-T 세포는 제조 공정 중 GM-CSF의 억제를 허용하고, 다른 중요한 T 세포 기능을 유지하면서 GM-CSF의 생산을 효과적으로 감소시키고, 향상된 결과를 초래합니다. 야생형 CAR-T 세포에 비해 생체 내 항종양 활성. 12세
게놈에 있는 Cas9의 영구적인 통합은 임상으로 실행 가능한 제품으로.......
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공개 사항
SSK는 노바티스(Mayo Clinic, 펜실베이니아 대학, 노바티스)에 허가된 CAR T 세포 치료 분야의 특허에 대한 발명가입니다. 이 연구 결과는 Humanigen (SSK)에서 보조금에 의해 부분적으로 투자되었습니다. RMS, MJC, RS 및 SSK는 이 작업과 관련된 특허를 발명하는 발명자입니다. 실험실 (SSK)는 Tolero, Humanigen, 연, 렌티겐, 모르포시, 및 액티늄에서 자금을 받습니다.
감사의 글
이 작품은 K12CA090628 (SSK), 국립 종합 암 네트워크 (SSK), 개별 의학메이요 클리닉 센터 (SSK), 프레돌린 재단 (SSK), 실천번역의 메이요 클리닉 사무소 (SSK) 및 보조금을 통해 지원되었습니다. 메이 요 클리닉 의료 과학자 교육 프로그램 로버트 L. 하웰 의사-과학자 장학금 (RMS).
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재료
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| CD3 단클론 항체 (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CD3 단클론 항체 (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | 17-0038-42 | |
| Choice Taq Blue Mastermix | Denville Scientific | C775Y51 | |
| CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX 시스템 B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | 플로우 사이토미터 |
| 디메틸 설폭사이드 | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco의 인산염 완충 식염수 | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep 자석 | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep 인간 T 세포 분리 키트 | STEMCELL Technologies | 17951 | 음성 선택 자석 구슬; 17951RF 포함 팁과 버퍼 |
| 태아 소 세럼 | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD107a | BD Pharmingen | 555800 | |
| 고정 매체 (매체 A) | Invitrogen | GAS001S100 | |
| GenCRISPR gRNA 구성물 : 이름 : CSF2 CRISPR 가이드 RNA 1; 종 : 인간, 벡터 : pLentiCRISPR v2; 저항성 : 암피실린; 사본 번호 : High; 플라스미드 준비 : 표준 배달 : 4 μ g (무료 | GenScript | N/A | 사용자 정의 주문 |
| 염소 안티 마우스 IgG (H+L) 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | 데스크탑 유전학 | ||
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| IFN gamma 단클론 항체 (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
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참고문헌
- Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies. Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).
- Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168
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