우리는 Drosophila melanogaster에있는 신경 변성을 전시하는 돌연변이를 위한 스크린에 전방 유전 접근을 사용하여 프로토콜을 제시합니다. 그것은 궁극적으로 신경 보호의 프로세스와 관련있는 새로운 유전자를 확인하기 위하여 등반 분석, 기관학 분석, 유전자 매핑 및 DNA 순서를 통합합니다.
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이 논문에서
요약
초록
신경 퇴행성 질환의 발병과 진행에 대해 이해해야 할 것이 많이 있습니다. 화학 돌연변이원을 이용한 전방 유전자 스크리닝은 인간과 보존된 세포 경로를 공유하는 Drosophila 및 그밖 모형 유기체 중 유전자에 돌연변이 표현형을 매핑하기 위한 유용한 전략입니다. 관심의 돌연변이 유전자가 파리의 초기 발달 단계에서 치명적이지 않은 경우, 등반 분석은 낮은 등반 속도와 같은 감소 뇌 기능의 현상형 지표를 위해 스크리닝을 실시 할 수있다. 이어서, 뇌 조직의 이차 조직학적 분석은 신경변성 표현형을 채점함으로써 유전자의 신경보호 기능을 검증하기 위해 수행될 수 있다. 유전자 매핑 전략은 이러한 동일한 분석에 의존하는 meiotic 및 결핍 매핑을 포함하며, 관심 있는 유전자에서 가능한 뉴클레오티드 변화를 식별하기 위해 DNA 염기서열 분석이 뒤따를 수 있다.
서론
뉴런은 대부분 유사분열 후이며1,2를나눌 수 없습니다. 대부분의 동물에서, 신경 보호 메커니즘 유기 체의 수명 내내 이러한 세포를 유지 하기 위해 존재, 특히 노년 기에 뉴런은 손상에 가장 취약. 이러한 메커니즘의 근간이 되는 유전자는 전방 유전 프로토콜을 사용하여 신경 변성을 나타내는 돌연변이체에서 확인할 수 있습니다. 에틸 메탄설포네이트(EMS) 또는 N-에틸-N-니드로소레아(ENU)와 같은 화학적 돌연변이원을 이용한 전방 유전적 스크린은 유도하는 무작위 점 돌연변이로 인해 특히 유용하며, 이로 인해 본질적으로 편견없는 접근법이 빛을 발하고 있습니다. 진핵 모델 유기체3,4,5의 수많은 유전자 기능 (대조적으로, X선 돌연변이발생은 DNA 나누기를 생성하고 포인트 돌연변이가 아닌 재배열을 초래할 수 있다 6).
일반적인 과일 파리 Drosophila melanogaster는 그것의 높은 품질, 잘 달린 게놈 순서, 고도로 발달된 유전 공구를 가진 모형 유기체로 그것의 긴 역사 때문에 이 스크린을 위한 이상적인 주제이고, 가장 중요한 것은, 그것의 공유 인간과 진화역사7,8. 이 프로토콜의 적용가능성에 있는 제한 요인은 9세에 시험을 방지할 돌연변이된 유전자에 기인한초기 치사입니다. 그러나, 비 치명적인 돌연변이의 경우, 부정적인 지질 학적 을 활용하는 등반 분석법은 10 기능하는 손상된 모터를정량화하는 광범위한 방법이지만 간단합니다. 충분한 운동 반응성을 나타내기 위해 파리는 방향을 결정하고 위치를 감지하며 움직임을 조정하기 위해 신경 기능에 의존합니다. 파리가 자극에 반응하여 충분히 올라갈 수 없다는 것은 따라서 신경학적 결함11을나타낼 수 있다. 특정 결함이 있는 등반 표현형이 확인되면, 뇌 조직의 조직학적 분석과 같은 보조 스크린을 이용한 추가 테스트는 등반 결함이 있는 파리의 신경 변성을 식별하는 데 사용될 수 있습니다. 후속 유전자 매핑은 관심 있는 결함있는 신경 보호 유전자를 운반하는 염색체상에 게놈 영역을 밝히기 위하여 그 때 이용될 수 있습니다. 관심 있는 염색체 영역을 좁히기 위해, 염색체상에 공지된 위치를 가진 지배적인 마커 유전자를 운반하는 돌연변이 플라이 라인을 이용한 meiotic 매핑이 수행될 수 있다. 마커 유전자는 2개의 좌위 사이 재결합의 주파수가 유전자의 대략적인 위치를 지도로 하기 위하여 이용될 수 있는 측정 가능한 거리를 제공하기 때문에 돌연변이를 위한 기준점역할을 한다. 마지막으로, 관심 있는 중증 염색체 영역에 균형 잡힌 결핍을 운반하는 선으로 돌연변이 선을 교차하는 것은 그것의 알려진 표현형이 표현되는 경우에 관심있는유전자가 확인될 수 있는 보완 시험을 만듭니다 5. 확인된 유전자에서 다형성 뉴클레오티드 서열은, 아마도 변경된 아미노산 서열의 결과로, 유전자를 시퀀싱하고 이를 Drosophila 게놈 서열과 비교하여 평가될 수 있다. 관심 있는 유전자의 후속 특성화는 추가 돌연변이 대문자의 검사, 돌연변이 구조 실험 및 추가 표현형의 검사를 포함할 수 있다.
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프로토콜
1. 파리의 준비와 노화
- 유전 스크린을 위해 사용될 초파리 돌연변이체의 6체를 얻거나 생성한다. 여기서, 제2 염색체에 매핑되고 CyO를 통해 균형잡힌 ENU 돌연변이 선이 사용된다.
- 옥수수 밀밀 배지에 25 °C, 12 시간 빛 / 어두운 주기로 설정 인큐베이터에서 실험 유전자 형 라인을 증폭.
- 각 실험 유전자형에서 성인 외화의 0-2 일 사이에 약 20 동형 접합 자손을 수집합니다. 지속적으로 남성 또는 여성 파리 중 하나를 수집하여 섹스 편견을 제거합니다.
- 옥수수 밀밀 배지에 29 °C에서 파리를 나이에 신선한 음식에 파리를 유지하기 위해 2-3 일마다 유리병을 뒤집어. 여기에 제시 된 화면에서 파리는 10-12 일 동안 숙성되었습니다.
- 앞서 설명한 바와 같이 두 개의 바이알과 테이프를 사용하여 등반 분석 시험 챔버를 조립10. 바이알은 양쪽 열린 끝에 연결되어야 합니다. 눈금자를 사용하여 챔버의 한쪽 끝에 5cm 선을 표시합니다.
2. 프로토콜 1: 등반 분석 (알리 외 에서 적응10)
- 등반 분석의 유효성을 검사합니다. 이 연구에서는, 알리 외10에의해 이전에 설명 된 방법론에 따라 등반 분석실험을 테스트, 엘라브C155> UAS-타우R406W를 사용하여 (낮은 등반 통과 속도를 나타내는) 및 엘라브C155> UAS-GFP ( ElavC155>UAS-mCherry(제어)가 날아갑니다.
- 한 번에 한 줄의 시험실로 파리를 뒤집어 (CO2 마취를 사용하지 마십시오) 5 분 동안 회복 할 수 있습니다. 다른 날에 테스트가 수행되는 경우, 하루 중 동시에 분석실험을 수행한다. 이 연구에서는, 모든 등반 암세는 운동에 circadian 효력을 통제하기 위하여 오후에 행해진12.
참고: 테스트 할 때 직사광선에 파리를 노출하지 마십시오; 이것은 등반 능력을 방해할 것입니다. - 모든 파리가 하단에 분석을 시작되도록 3 번 단단한 표면에 배치 된 마우스 패드에 챔버 (아래로 표시)를 강제로 누릅니다. 10s의 기간 동안 비행 운동을 관찰.
- 이 시간 내에 5cm 라인에 도달하거나 통과하는 파리의 수와 테스트된 총 파리 수를 기록합니다. 각 평가판 사이에 1분 동안 줄을 당 최소 3개의 평가판 복제를 위해 프로토콜을 반복합니다.
참고: 본 연구에서, 각 바이알은 초기 스크리닝(남성 파리)을 위해 2및 19파리 사이에 함유되어 있으며, 교차된 여성 라인의 돌연변이 결핍 분석을 위해 6~21개의 파리를 비행한다(섹션 5.3.).
3. 프로토콜 2: 추가 분석을 위한 초파리 균주의 선택
- Microsoft Excel 또는 유사한 소프트웨어에 등반 분석 데이터를 입력하고 모든 복제에 대한 각 줄의 등반 합격률을 백분율로 계산합니다.
-
R 소프트웨어 패키지(13)를 사용하여 모든 라인의 평균 등반 퍼센트 값에서 크게벗어난 돌연변이 선을 검출하기 위해 통계 분석을 수행합니다.
- R(각 변수 또는 요인에 대한 열이 있는 .csv 또는 .txt 파일, 특정 값을 나타내는 행)에 대해 선별된 데이터 파일을 읽습니다.
참고: 여기서, 수컷(초기 분석)과 암컷(867호선이 결핍선으로 교차함)에 대한 데이터를 별도의 .xlsx 시트에 두 개의 열로 입력했는데, 하나는 열의 행이 돌연변이 선을 식별하고 분석제가 복제된 횟수와 행이 여러 번 복제된 경우입니다. 파리의 각 복제 유리병에 대한 평균 등반 성공(백분율)을 나타냅니다. - 다음 코드를 사용하여 데이터를 R로 읽습니다.
말리&-read.csv(".. /male_init.csv")
펨데프&-read.csv(".. /fem_def_cross.csv")
참고: 경로 디렉터리의 ".."는 사용자 컴퓨터의 루트 디렉터리에서 절대 경로이며 컴퓨터의 디렉터리 경로에 대해 개별 사용자가 지정해야 합니다. - 선형 모델링 수행
- R의 lm 함수를 사용하면 더미 변수 회귀를 수행합니다. 돌연변이 라인의 초기 분석을 위해, 0 평균 중심 응답 변수 (백분율 성공)에 대한 그랜드 평균에 대한 백분율 등반 성공에 요인 수준 효과 (돌연변이 라인)의 중요성을 평가합니다.
참고: lm 함수의 끝에 있는 "-1"은 섹션 3.2.3.2에서 호출됩니다. 가로채기를 제거하고 백분율 등반 합격률의 중심 평균에 대해 모든 요소 수준을 테스트 할 수 있습니다. - R 요약 기능을 사용하여 결과를 화면에 인쇄합니다.
mali_anova&lm(스케일(말리$P_성공)~말리$돌연변이_라인 -1)
요약(말리_아노바) - 다음 R 코드 사용에 대 한 요인 수준 효과 테스트 하기 위해 기준선으로 제어 줄(있는 경우)을 사용 합니다.
펨데프_아노바&-lm(펨데프$P_success~x)
요약(펨데프_아노바)
참고: 코드의 첫 번째 줄은 음의 제어 선이 lm 함수의 기본 제공 t-test를 사용하여 다른 모든 요인 수준(돌연변이 선)을 테스트하는 기준선 가로채기가 되도록 요인 수준을 재정렬합니다.
- R의 lm 함수를 사용하면 더미 변수 회귀를 수행합니다. 돌연변이 라인의 초기 분석을 위해, 0 평균 중심 응답 변수 (백분율 성공)에 대한 그랜드 평균에 대한 백분율 등반 성공에 요인 수준 효과 (돌연변이 라인)의 중요성을 평가합니다.
- R(각 변수 또는 요인에 대한 열이 있는 .csv 또는 .txt 파일, 특정 값을 나타내는 행)에 대해 선별된 데이터 파일을 읽습니다.
- 테스트 시점의 연령에 따라 후보 라인에 대한 임계값을 선택합니다. 임계값을 결정하기 위해, 야생형에 비해 신경변성 및 낮은 등반 합격률을 나타내는 공지된 돌연변이체를 이용하여 원하는 나이에 예비 시험을 실시하고, 대조군은10을날아다닌다.
참고: 50% 이하의 통과율은 신경계에서 인간 신경변성 관련 유전자타우를 과발현하는 초파리선에 대해 이전에 보고된 바와 같이 10일령파리에 적합할 수있다 10. 더 오래된 파리는 감소된 운동을 전시할 것으로 예상되기 때문에 더 높은 통과 비율 임계값이 있어야 합니다, 따라서, 증가한 신경 변성.
4. 의정서 3: 역학 분석
- 장갑을 착용하고 등반 분석 다음에 수술 용 블레이드로 머리를 자르고 페인트 브러시를 사용하여 Carnoy의 고정제 1 mL (100 % EtOH : 클로로폼 : 빙하 아세트산)을 4 °C에서 1.5 mL 마이크로 원심 분리 튜브 O / N에 부드럽게 놓습니다. 헤드가 고정 솔루션에 가라앉는지 확인합니다.
- 다음 날 고정 용액을 70% EtOH의 1 mL로 교체하고 향후 분석을 위해 샘플을 4 °C에서 유지하십시오.
참고: 이 단계에서 프로토콜이 일시 중지될 수 있습니다. - 4.2 단계에서 머리를 놓습니다. 미생물 학적 카세트 당 최대 5개. 즉시 카세트를 70% EtOH로 채워진 용기에 넣습니다. 용기를 4°C에 보관한 후 헤드의 처리 및 파라핀 을 삽입하기 위한 학비 시설로 배송한다. 조직 처리 및 포함을 위한 장비가 있는 경우 4.4 단계를 따르십시오.
- 마이크로토메 절편을 위해 파라핀에 머리를 끼운다:
- 파라핀 헤드를 탈수하고, 명확하고, 침투하기 위해 표 1에 제시된 순서대로 자동화된 조직 처리 기계에 대한 프로그램 설정을 따르십시오.
- 파라핀 임베딩 스테이션을 사용하여 60°C에서 가열된 파라핀을 사용하여 카세트에 맞는 금속 베이스 몰드로 샘플을 이송합니다.
- 미세 한 집게를 사용하여 기본 금형에서 머리 (상단을 향한 전방 후방 방향)를 배향하여 절편 후 뇌 조직의 적절한 시각화를 허용합니다. 이것은 60 °C에서 파라핀을 재가열하고 필요한 경우 헤드를 재배치하여 수행 할 수 있습니다.
참고: 금속 금형은 일회용 기본 금형으로 대체 할 수 있습니다. - 상응하는 베이스 몰드의 상부에 카세트를 놓고 이를 파라핀 임베딩 스테이션(4°C)의 냉장 측으로 부드럽게 이동시다. 스테이션에서 블록을 제거하기 전에 블록이 굳어질 때까지 기다립니다.
- 카세트에서 금형을 부드럽게 해리하여 블록 형태를 제거합니다.
- 각 파라핀 블록을 이전 단면으로 다듬어 단면화할 표면을 최소화합니다.
- 각 블록의 5 μm 섹션을 잘라 마이크로 토메를 설정합니다.
- 조직을 함유한 단면 파라핀 리본을 가열된 수조(35°C)에 최대 5분 동안 놓습니다.
- 가열 된 수조에 폴리 리신 코팅 슬라이드 (조직을 유지하는 데 도움)를 담그고 나무 도포기를 사용하여 슬라이드에 단면 리본을 놓습니다. 슬라이드를 실온에서 공기 건조 O/N시키십시오.
- 슬라이드 워머를 사용하여 63°C에서 15분 동안 슬라이드를 가열합니다.
- 슬라이드 염색 랙에 슬라이드를 놓고 다음 단계를 준수하여 헤마톡실린및 에오신(H&E)을 연기 후드 아래에 두십시오.
- 5 분 동안 히스토 초이스 (샘플에서 파라핀을 제거하는 데 도움이 자일렌의 무독성 교체)에 랙을 놓습니다.
- 히스토초이스가 가득 찬 용기에 랙을 5분 동안 옮김을 옮김을 옮김을 옮김.
- 랙을 100% EtOH 1로 채워진 용기에 5분 동안 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김.
- 랙을 100% EtOH 2로 채워진 용기에 5분 동안 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김.
- 95% EtOH로 채워진 용기에 랙을 3분 동안 옮김을 옮김을 옮김.
- 70% EtOH로 채워진 용기에 랙을 3분 동안 옮김을 옮김을 옮김.
- 증류수 H 2O로 채워진 용기에 랙을 5분 동안 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김.
- 2-5 분 동안 해리스 헤마톡실린으로 채워진 용기에 랙을 옮김을 옮김.
- Hematoxylin 용액에서 랙을 꺼내 10 분 동안 흐르는 수돗물 아래에 놓습니다.
- 짧은 덩크를 수행하여 증류수로 채워진 용기에 랙을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김.
- 1-2 분 동안 에신으로 채워진 용기에 랙을 옮김.
- 짧은 덩크를 수행하여 95 % EtOH로 채워진 용기에 랙을 옮김.
- 랙을 95% EtOH로 채워진 용기에 5분 동안 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김.
- 랙을 100% EtOH로 채워진 용기에 5분 동안 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김.
- 랙을 100% EtOH로 채워진 용기에 5분 동안 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김.
- 모든 슬라이드가 장착 될 때까지 5-10 분 동안 히스토초이스 (또는 자일렌)로 채워진 용기에 랙을 옮니다.
- 슬라이드와 커버 슬립(크기 24mm x 60mm)을 장착합니다. 집게를 사용하여, 히스토초이스 또는 자일렌 용액에서 슬라이드를 꺼내 그 위에 장착 매체의 얇은 스트립을 합니다. 거품의 형성을 피하려고, 상단에 커버 슬립을 부드럽게 배치합니다.
- 장착 된 슬라이드의 장착 매체가 분석 전에 연기 후드 아래에서 O / N을 경화시키십시오.
- 스테인드 슬라이드를 실온의 상자에 보관하십시오.
- 가벼운 현미경으로 20배 배율로 슬라이드의 모든 직렬 섹션을 보고 신경 변성을 정량화합니다. 전체 뇌를 검사, 크기와 세 개의 연속 섹션에 나타나는 액구의 수의 질적 메모를 복용.
- 이미징 소프트웨어가 장착된 가벼운 현미경을 사용하여 약 중간 뇌에서 대표적인 뇌 섹션의 이미지를 가져옵니다.
5. 프로토콜 4: 열성 뮤트 표현형의 유전자 매핑
- 후보 라인을 야생 형 캔톤 (BL_ 9517) 또는 다른 야생 유형 또는 등소 화 균주 (예 : OregonR (BL_ 2376), w1118 (BL _5905) 또는 yw (BL_ 6599)에 후보 라인을 교차하여 표현형이 지배적인지 또는 지배적인지 또는 열성.
참고: 이 단계의 결과는 매핑의 다음 단계를 안내합니다. 표현형이 열성인 경우 결핍 매핑을 수행할 수 있습니다.- 페인트 브러시를 사용하여, 음식 함유 바이알 CO 2-마취된 파리(5마리)와 캔톤스 라인(10-15마리 의 처녀 암컷)에 배치하여 십자가를 만든다. 바이알을 25°C에 놓습니다.
- 이종 F1 자손을 수집하고 등반과 신체 실험을 반복합니다.
- 얻어진 결과를 단독으로 대조군 과 동형체 돌연변이체와 비교한다. 열성 표현형의 좋은 표시는 이형 돌연변이가 야생 형 파리와 유사한 표현형을 전시하는 경우에 일 것입니다.
- wgSp-1 J1 L2 핀 1/CyO(BL_3227) 또는 알려진 관련 우세 마커와 동등한 변형을 사용하여 두 번째 염색체상에서 의 돌연변이 위치를 대략 추정하기 위해 meiotic 매핑을 수행합니다. 세포학적 위치. 이 경우, 돌연변이는 이전에 제2 염색체상에 위치하는 것으로 알려졌다.
- 페인트 브러쉬를 사용하여, 식품 함유 바이알 CO2-마취된 파리(5마리)와 wgSp-1 J1 L2 핀 1/CyO 라인(10 암컷)을 돌연변이 선에 배치하여 십자가를 만든다. 바이알을 25°C에 놓습니다.
참고: 이 십자가의 목표는 새로운 돌연변이와 마커 염색체를 가진 염색체를 운반하는 이형이구암컷을 생성하는 것입니다, 이는 사람막후 동안 재결합할 6,14. 여성 F1 자손은 남성에서 재결합이 발생하지 않기 때문에 남성보다는 선택됩니다. - 새로운 돌연변이및 마커 염색체를 가진 염색체를 운반하는 적어도 15명의 처녀 여성 자손을 수집하고 또 다른 눈에 보이는 지배적인 마커를 전송하는 균형 잡힌 선에서 5 명의 남성에게 그(것)들을 교차합니다 (예를 들면, CyO/snaSco (BL_2555) 또는 등가).
- Sco 또는 CyO및 5.2.2 단계에서 십자가에서 잠재적으로 재결합된 염색체를 운반하는 이형남성 자손을 수집합니다. 돌연변이 염색체를 운반하는 주식에서 처녀 암컷과 개별적으로 짝짓기.
- 5.2.3 단계에서 설명된 마지막 십자가에서 자손을 수집합니다. 그리고 29°C에서 파리를 숙성시켰다(본 연구에서 파리는 10-14일 동안 숙성시켰다).
- 머리를 모으고, 프로토콜 3에 설명된 대로 조직학 분석을 수행하고, 4.11단계에서 설명한 대로 신경병리학의 정도를 결정하기 위해 뇌 섹션을 가진 슬라이드를 살펴본다. 역학 분석은 날개(15)에유체 축적을 일으키는 원인이 되는 Jammed (J)와같은 등반 분석에 영향을 미칠 수 있는 표현형 때문에 운동 분석 보다는 오히려 수행됩니다.
- 페인트 브러쉬를 사용하여, 식품 함유 바이알 CO2-마취된 파리(5마리)와 wgSp-1 J1 L2 핀 1/CyO 라인(10 암컷)을 돌연변이 선에 배치하여 십자가를 만든다. 바이알을 25°C에 놓습니다.
- 염색체의 좁은 영역에 결핍 매핑을 수행하여 등반 분석기를 사용하여 열성 돌연변이의 위치를 구체화합니다. 각 결핍 라인은 염색체의 다른 영역의 삭제를 가지고, 보완 테스트에 사용할 수 있도록.
- meiotic 매핑에서 식별 된 영역에 걸쳐 큰 결함으로 시작, 다음 더 작은 결함의 사용에 의해 좁혀질 수 있습니다. 결핍 분석이 둘 이상의 후보 유전자를 초래하는 경우, RNA 간섭(RNAi) 주식을 사용하여 이를 표적으로 하는 것이 좋습니다.
- 두 번째 염색체 (이 연구에서 DK2L)에 대한 Drosophila 결핍 키트(16)에서 크로스 라인은 관심표현형의 비 보완을 찾습니다 (이 연구에서 : 8.5 %의 등반 합격률의 합격률에 해당 동형접합부는 양성 대조군으로 사용되는 라인 867에서 날아간다.
- 섹션 4(프로토콜 3)에 기재된 바와 같이 신체학 검증을 사용하여 신경변성 표현형을 확인한다.
6. 프로토콜 5: DNA 염기서열 분석
참고: ENU 돌연변이 발생은 포인트 돌연변이11을소개한다는 것을 명심하십시오.
- 관심 영역의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의한 증폭을 위한 브래트 유전자의 엑온 코딩 영역을 측면으로 설계(라인 867의 경우 3,247 bp 크기의 DNA 단편이 증폭되는 경우) 시퀀싱17).
-
단일 플라이에서 DNA 추출18 :
- 50 μL의 스퀴싱 버퍼(10 mM Tris-Cl pH 8.2, 1mM EdTA, 25 mM NaCl 및 200 μg/mL Proteinase K)를 포함하는 0.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브에서 부드럽게 날아다닌다.
- 37 °C에서 30 분 동안 배양
- 튜브를 95°C에서 2분 동안 배치하여 단백질분해제 K를 비활성화시고 탈액시한다.
참고: 추출된 DNA는 수개월 동안 4°C에서 저장될 수 있다.
- 고충실도 DNA Taq Polymerase(본 연구에 사용된 시약 및 열 사이클링 조건은 각각 표 2 및 표3에 나타남)를 사용하여 PCR 반응을 수행하고 제조업체의 지침을 존중하고 PCR 제품을 1에 실행합니다. 에티듐 브로마이드의 무독성 대안인 인비트로겐 SYBR 세이프 DNA 젤 스테인을 함유한 아가로즈 젤.
- 젤에서 올바른 크기의 밴드를 메스로 절제하고 제조업체의 지침을 준수하여 위저드 SV 젤 및 PCR 클린업 시스템(Promega) 또는 이에 상응하는 키트를 사용하여 PCR 제품을 정화합니다.
- 가능하면 전체 관심 영역을 커버하기 위해 DNA 시퀀싱에 사용되는 전진 및 역프라이머를 설계합니다. 이전 단계에서 겔 정제 된 DNA를 시퀀스하여 포인트 돌연변이를 식별합니다. 자동 형광 Sanger 시퀀싱의 높은 정확도는 최대 700bp까지 달성될 수 있습니다.
참고: Ex Taq 폴리머라제(TaKaRa)는 최대 20kb 크기의 게놈 DNA 템플릿에서 PCR 제품을 증폭하는 데 사용할 수 있습니다. -
A 플라스미드 에디터(ApE, M. Wayne Davis)를 사용하여 얻은 DNA 서열을 분석하고 이를 기준 균주의 동일한 게놈 영역의 시퀀싱 후 수득한 서열과 비교하여(예: 원래 돌연변이 균화) 선)을 참조하십시오.
- ApE를 통해 시퀀싱 파일을 엽니다. 참고로, Flybase에서 FASTA 형식으로 다운로드된 브래트 유전자의 게놈 합의 서열을 포함하는 ApE 파일, 또는 유전적 배경 조절의 서열에 대한 결과를 포함하는 파일(예를 들어, 원래 돌연변이 된 초파리 선)을 참조하십시오.
- 도구로이동한 다음 시퀀스를 정렬합니다. 컴퓨터의 마우스를 사용하여 비교할 모든 시퀀스를 선택합니다. 놓기 메뉴에서 이 정렬에 사용되는 참조 시퀀스를 나타내야 합니다.
- 기준 서열과 비교하여 염기순 변화가 서열된 영역을 검사한다. 원하는 경우 텍스트를클릭하여 .rtf 형식으로 컴퓨터에 정렬을 저장한 다음 을저장합니다.
참고: 돌연변이가 확인되지 않은 경우, DNA 염기서열 분석 프로토콜은 유전자의 비코딩 영역을 포함하도록 설계된 프라이머로 반복될 것이다.
7. 프로토콜 6: 후보 유전자 기능의 추가 분석
- 신경 배아에서 구조 실험을 수행하여 유전자 브래트가 신경 변성 표현형에 책임이 있는지 여부를 결정합니다.
- 이중 균형 UAS-brat19 및 신경 blast 특이적 weariu-Gal4 (wor-G4) 제 3 염색체에 구성을 운반하는 주식뿐만 아니라 두 번째에위치한 유전자 브래트에 대한 돌연변이인 867 라인 염색체.
- UAS-Brat, wor-G4 및 867 라인에서 세 가지 다른 음식 함유 바이알 5 남성에 배치하여 세 개의 별도의 십자가를 확인하고 두 번째 마커와 밸런서를 운반하는 라인에서 남성 10-15 처녀 여성의 각 세트에 추가 및 세 번째 염색체(Sp / CyO; 박사 / Tm3, sb; BL_59967).
- 다음 유전자형으로 각 십자가의 F1에서 10-15 처녀 암컷을 수집 : +/ CyO; UAS-brat/Tm3, sb, +/CyO; wor-G4/Tm3, sb 및 867/CyO;+/Tm3, sb 및 5 다음 유전자형의 남성: +/Sp; UAS-브래트 /Tm3, sb, +/ Sp; wor-G4/Tm3, sb 및 867/CyO; +/Dr.
- 크로스 콜렉트 +/CyO; UAS-브래트 /Tm3, sb 처녀 여성 +/Sp; UAS-브래트/Tm3, sb 남성; 별도의 바이알에서 +/CyO; wor-G4 /Tm3, sb 처녀 여성 +/Sp; wor-G4/Tm3, sb 남성, sb 남성 및 세 번째 바이알 크로스 867/CyO;+Tm3, sb 처녀 여성 및 867/CyO; +Dr 남성.
- 이러한 십자가의 각 F1에서, 다음 유전자형의 남성과 여성 모두를 수집: Sp/CyO; UAS-brat/Tm3, 첫 번째 십자가에서 sb, Sp/CyO; wor-G4/Tm3, 두 번째 십자가에서 sb 및 867/CyO; 박사 / Tm3, 두 번째 십자가에서 sb.
- 각 F1 자손에게서 수집한 형제 자매 간의 마지막 십자가를 수행하여 세 줄 모두에 영구적인 이중 균형 주식을 확립하십시오.
- UAS-brat와 wor-G4를 867 돌연변이와 결합합니다.
- 867 /CyO에서 처녀 여성의 충분한 수 (~ 20-30 파리)를 수집; Dr/Tm3, sb 이중 균형 주식 두 개의 십자가를 수행 합니다.
- 장소 10-15 처녀 여성 ~ 5 Sp/CyO에서 남성; UAS-brat/Tm3, sb (크로스 #1) 및 ~ 5 Sp/CyO; wor-G4/Tm3, sb 수컷을 가진 두 번째 바이알 10-15 처녀 암컷.
- 다음 유전자형으로 각 십자가의 F1에서 형제 자매를 수집 : 867 / CyO; UAS-brat/Tm3, 크로스 #1 및 867/CyO;wor-G4/Tm3, 크로스 #2 sb. 그들 사이에 형제 자매를 교차하여 영구 주식을 설정하는 각 십자가에서 수집 된 F1 자손을 사용합니다.
참고: 이 마지막 단계에 따라, 주식 에 대한 867 / CyO; UAS-brat/Tm3, sb 및 867/CyO; wor-G4/Tm3, sb가 생성되어야 합니다.
- 구조 실험을 수행합니다.
- 867 /CyO에서 ~ 15-20 처녀 여성을 수집; wor-G4 / Tm3, sb 주식및 주식 867 / CyO에서 5-10 남성에 그들을 교차; UAS-브래트 / Tm3, sb. 제어로, 867/CyO; wor-G4/Tm3, sb 및 867/CyO에서 ~15-20 처녀 암컷에서 ~15-20 처녀 암컷을 교차; UAS-브래트 / Tm3, 혼자 867 / CyO 라인에 sb 라인.
참고: 867개의 파리는 온도에 민감한 브래트 알레를 운반하고 구조 십자가는 29°C에서 수행되어야 한다. - 신중하게 멀리 표시 균형자를 선택하여 각 십자가에서 다음과 같은 F1 자손을 수집: 867/867; wor-G4/UAS-brat (구조), 867/867; wor-G4/+ (제어) 및 867/867; UAS-브래트/+ (제어).
- 29°C에서 원하는 대로 파리를 나이, 섹션 4(프로토콜 3)에 기재된 프로토콜을 사용하여 신경변성을 찾기 위해 뇌에 대한 신체학 분석을 수행한다.
- 867 /CyO에서 ~ 15-20 처녀 여성을 수집; wor-G4 / Tm3, sb 주식및 주식 867 / CyO에서 5-10 남성에 그들을 교차; UAS-브래트 / Tm3, sb. 제어로, 867/CyO; wor-G4/Tm3, sb 및 867/CyO에서 ~15-20 처녀 암컷에서 ~15-20 처녀 암컷을 교차; UAS-브래트 / Tm3, 혼자 867 / CyO 라인에 sb 라인.
- 이중 균형 UAS-brat19 및 신경 blast 특이적 weariu-Gal4 (wor-G4) 제 3 염색체에 구성을 운반하는 주식뿐만 아니라 두 번째에위치한 유전자 브래트에 대한 돌연변이인 867 라인 염색체.
- 867개의 돌연변이체에서 신경 변성의 연령에 따라 분석을 수행합니다.
- 수집 867;pcna-GFP 및 yw 제어 파리, 이는 기자 유전자를 수행 (pcna-GFP) 25 ° C에서 실행 가능하고 이에 혼자 867보다 신경 변성 표현형의 높은 침투성과 높은 표현력을 모두 전시 온도17.
- 나이는 섹션 1.4에 설명된 대로 5, 15 및 25까지 비행하고 섹션 4(프로토콜 3)의 프로토콜에 따라 후속 신체 학 분석을 수행합니다.
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결과
이러한 간질에서, 우리는 성인 파리에서 신경 무결성(예를 들어, 신경보호)의 유지에 역할을 하는 유전자 뇌종양(brat)을 식별하는 데 사용되는 단계를 제시한다(17; 신경 보호에 관여하는 유전자를 식별하는 데 사용할 수있는 방법론. 우리는 등반 분석법을 사용하여 화학적으로 돌연변이 된 파리의 컬렉션을 통해 스크리밍하는 전방 유전 접근법 (전략은 도 1A에설명되어 있음)을 사용했습니다 (이 분석에 사용되는 장치는 도 1B에도시되어 있음). 235개의 동형접합선 중, 시험된 라인의 약 37%가 10-12일 의 나이에 시험했을때 50% 이하의 등반 합격률을 나타냈다(그림 1C). 테스트 된 라인의 58 %는 그들의 퍼센트 등반 통과 율 (C...
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토론
Drosophila에 있는 전방 유전 스크린은 나이 의존적인 신경 보호를 포함하여 다른생물학 프로세스에서 관련시킨 유전자를 확인하는 효과적인 접근이었습니다 5,23,24, 25. 이 전략을 사용하여, 우리는 새로운 신경 보호 유전자17로 brat를 확인하는 데 성공했습니다.
이 프로토콜의 한 가지 중요한 단계는 역학 분석을 위해 머리의 적절한 방향(섹션 4.4.3에 설명된 대로)을 포함합니다. 또한, meiotic 매핑에 사용되는 라인의 마커는 새로운 돌연변이의 표현형을 방해해서는 안됩니다 (이 연구에서: 신경 변성). 우리는 선택된 마커가 그들의 자신의 신경 변성을 일으키는 원...
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 특히 배리 가네츠키 박사에게 감사드리며, 실험실에서 유전 스크린이 수행되어 신경 보호 유전자로서 brat의 식별 및 특성을 허용합니다. 우리는 친절이 문서에 제시된 유전 스크린에 사용된 ENU 돌연변이 파리의 컬렉션을 제공하는 스티븐 로비도우 박사에게 감사드립니다. 우리는 이 프로젝트의 기간 동안 도움이 토론에 대한 Ganetzky 연구소의 구성원, 박사 그레이스 보호프 - 포크와 데이비드 Wassarman, 링 링 호와 밥 크레버 기술 지원에 대한, 박사 아키 이케다에서 자신의 마이크로 토메 시설의 사용에 대한 감사 위스콘신 대학교와 킴 래키 박사, 앨라배마 대학교 광학 분석 시설.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope Nikon | Eclipe E100 | 이미징에 선호되는 objective는 20x | |
| 이미징 소프트웨어 | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly 밀고 오르기 분석 | |||
| VWR® 초파리 바이알, 좁은 | VWR | 75813-160 | |
| VWR® 일반용 실험실 라벨링 테이프 | VWR | 89097-912 | |
| 표준 마우스 패드 | |||
| 스테레오스코프 | 모틱 | 모델 SMZ-168 | |
| CO2 마취 스테이션 (블로우건, 풋 밸브, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | CO2 탱크 |
| 파인 팁 브러시 | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila 인큐베이터 | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line 재조합 매핑에 사용됨 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | 유전자형: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 염색체 2L | 사용되는 재조합 매핑에 사용되는 Drosophila |
| Balancer line Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 | |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| 클로로포름 | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| 빙하 아세트산 | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ 프리미엄 마이크로 원심분리기 튜브: 1.5 mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice 청산제 1x | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ 리처드-앨런 과학&무역; 장착 매체 | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine 현미경 슬라이드, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ 커버 안경: 사각형 | Fisherbrand | 12-545M | 치수: 24 mm x 60 mm |
| 추적 가능한 타이머 | VWR | ||
| 슬라이드 워머 | Barnstead International | 모델 번호 26025 | |
| 슬라이드 트레이 및 랙 | DWK Life Sciences | Rack은 20개의 슬라이드를 수용할 수 있습니다 | |
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| Kimwipes™ | 킴벌리-클라크&트레이드; 프로페셔널 | ||
| 6인치 청교도 애플리케이터 | 하드우드 제품 회사, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® 면도날 | VWR | 55411-050 | |
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| Corning™ 뚜껑이 있는 라운드 아이스 버킷, 4 L | Corning™ | ||
| 비커 | 또는 얼음물과 카세트를 담는 다른 용기 | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| 마이크로톰 | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV 겔 및 PCR 클린업 시스템 | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA 중합효소 | TaKaRa | 5 U/μ l | |
| Invitrogen™ SYBR&트레이드; 안전&무역; DNA 젤 염색 | Invitrogen™ | ||
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| 1 Kb 플러스 DNA 래더 | Invitrogen™ | ||
| ApE-A 플라스미드 편집기 소프트웨어 | 무료 다운로드 가능 | ||
| 통계 분석 | |||
| R 소프트웨어 패키지 | |||
| 추가 분석 | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | 블루밍턴 초파리 재고 센터 | 59967 |
참고문헌
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