우리는 Drosophila melanogaster에있는 신경 변성을 전시하는 돌연변이를 위한 스크린에 전방 유전 접근을 사용하여 프로토콜을 제시합니다. 그것은 궁극적으로 신경 보호의 프로세스와 관련있는 새로운 유전자를 확인하기 위하여 등반 분석, 기관학 분석, 유전자 매핑 및 DNA 순서를 통합합니다.
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이 논문에서
요약
초록
신경 퇴행성 질환의 발병과 진행에 대해 이해해야 할 것이 많이 있습니다. 화학 돌연변이원을 이용한 전방 유전자 스크리닝은 인간과 보존된 세포 경로를 공유하는 Drosophila 및 그밖 모형 유기체 중 유전자에 돌연변이 표현형을 매핑하기 위한 유용한 전략입니다. 관심의 돌연변이 유전자가 파리의 초기 발달 단계에서 치명적이지 않은 경우, 등반 분석은 낮은 등반 속도와 같은 감소 뇌 기능의 현상형 지표를 위해 스크리닝을 실시 할 수있다. 이어서, 뇌 조직의 이차 조직학적 분석은 신경변성 표현형을 채점함으로써 유전자의 신경보호 기능을 검증하기 위해 수행될 수 있다. 유전자 매핑 전략은 이러한 동일한 분석에 의존하는 meiotic 및 결핍 매핑을 포함하며, 관심 있는 유전자에서 가능한 뉴클레오티드 변화를 식별하기 위해 DNA 염기서열 분석이 뒤따를 수 있다.
서론
뉴런은 대부분 유사분열 후이며1,2를나눌 수 없습니다. 대부분의 동물에서, 신경 보호 메커니즘 유기 체의 수명 내내 이러한 세포를 유지 하기 위해 존재, 특히 노년 기에 뉴런은 손상에 가장 취약. 이러한 메커니즘의 근간이 되는 유전자는 전방 유전 프로토콜을 사용하여 신경 변성을 나타내는 돌연변이체에서 확인할 수 있습니다. 에틸 메탄설포네이트(EMS) 또는 N-에틸-N-니드로소레아(ENU)와 같은 화학적 돌연변이원을 이용한 전방 유전적 스크린은 유도하는 무작위 점 돌연변이로 인해 특히 유용하며, 이로 인해 본질적으로 편견없는 접근법이 빛을 발하고 있습니다. 진핵 모델 유기체3,4,5의 수많은 유전자 기능 (대조적으로, X선 돌연변이발생은 DNA 나누기를 생성하고 포인트 돌연변이가 아닌 재배열을 초래할 수 있다 6).
일반적인 과일 파리 Drosophila melanogaster는 그것의 높은 품질, 잘 달린 게놈 순서....
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프로토콜
1. 파리의 준비와 노화
- 유전 스크린을 위해 사용될 초파리 돌연변이체의 6체를 얻거나 생성한다. 여기서, 제2 염색체에 매핑되고 CyO를 통해 균형잡힌 ENU 돌연변이 선이 사용된다.
- 옥수수 밀밀 배지에 25 °C, 12 시간 빛 / 어두운 주기로 설정 인큐베이터에서 실험 유전자 형 라인을 증폭.
- 각 실험 유전자형에서 성인 외화의 0-2 일 사이에 약 20 동형 접합 자손을 수집합니다. 지속적으로 남성 또는 여성 파리 중 하나를 수집하여 섹스 편견을 제거합니다.
- 옥수수 밀밀 배지에 29 °C에서 파리를 나이에 신선한 음식에 파리를 유지하기 위해 2-3 일마다 유리병을 뒤집어. 여기에 제시 된 화면에서 파리는 10-12 일 동안 숙성되었습니다.
- 앞서 설명한 바와 같이 두 개의 바이알과 테이프를 사용하여 등반 분석 시험 챔버를 조립10. 바이알은 양쪽 열린 끝에 연결되어야 합니다. 눈금자를 사용하여 챔버의 한쪽 끝에 5cm 선을 표시합니다.
2. 프로토콜 1: 등반 분석 (알리 외 에서 적응10)
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결과
이러한 간질에서, 우리는 성인 파리에서 신경 무결성(예를 들어, 신경보호)의 유지에 역할을 하는 유전자 뇌종양(brat)을 식별하는 데 사용되는 단계를 제시한다(17; 신경 보호에 관여하는 유전자를 식별하는 데 사용할 수있는 방법론. 우리는 등반 분석법을 사용하여 화학적으로 돌연변이 된 파리의 컬렉션을 통해 스크리밍하는 전방 유전 접근법 (전략은 도 1A에설명되어 있음)을 사용했습니다 (이 분석에 사용되는 장치는 도 1B에도시되어 있음). 235개의 동형접합선 중, 시험된 라인의 약 37%가 10-12일 의 나이에 시험했을때 50% 이하의 등반 합격률을 나타냈다(그림 1C). 테스트 된 라인의 58 %는 그들의 퍼센트 등반 통과 율 (C.......
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토론
Drosophila에 있는 전방 유전 스크린은 나이 의존적인 신경 보호를 포함하여 다른생물학 프로세스에서 관련시킨 유전자를 확인하는 효과적인 접근이었습니다 5,23,24, 25. 이 전략을 사용하여, 우리는 새로운 신경 보호 유전자17로 brat를 확인하는 데 성공했습니다.
이 프로토콜의 한 가지 중요한 단계는 역학 분석을 위해 머리의 적절한 방향(섹션 4.4.3에 설명된 대로)을 포함합니다. 또한, meiotic 매핑에 사용되는 라인의 마커는 새로운 돌연변이의 표현형을 방해해서는 안됩니다 (이 연구에서: 신경 변성). 우리는 선택된 마커가 그들의 자신의 신경 변성을 일으키는 원.......
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 특히 배리 가네츠키 박사에게 감사드리며, 실험실에서 유전 스크린이 수행되어 신경 보호 유전자로서 brat의 식별 및 특성을 허용합니다. 우리는 친절이 문서에 제시된 유전 스크린에 사용된 ENU 돌연변이 파리의 컬렉션을 제공하는 스티븐 로비도우 박사에게 감사드립니다. 우리는 이 프로젝트의 기간 동안 도움이 토론에 대한 Ganetzky 연구소의 구성원, 박사 그레이스 보호프 - 포크와 데이비드 Wassarman, 링 링 호와 밥 크레버 기술 지원에 대한, 박사 아키 이케다에서 자신의 마이크로 토메 시설의 사용에 대한 감사 위스콘신 대학교와 킴 래키 박사, 앨라배마 대학교 광학 분석 시설.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope Nikon | Eclipe E100 | 이미징에 선호되는 objective는 20x | |
| 이미징 소프트웨어 | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly 밀고 오르기 분석 | |||
| VWR® 초파리 바이알, 좁은 | VWR | 75813-160 | |
| VWR® 일반용 실험실 라벨링 테이프 | VWR | 89097-912 | |
| 표준 마우스 패드 | |||
| 스테레오스코프 | 모틱 | 모델 SMZ-168 | |
| CO2 마취 스테이션 (블로우건, 풋 밸브, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | CO2 탱크 |
| 파인 팁 브러시 | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila 인큐베이터 | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line 재조합 매핑에 사용됨 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | 유전자형: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 염색체 2L | 사용되는 재조합 매핑에 사용되는 Drosophila |
| Balancer line Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 | |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| 클로로포름 | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| 빙하 아세트산 | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ 프리미엄 마이크로 원심분리기 튜브: 1.5 mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice 청산제 1x | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ 리처드-앨런 과학&무역; 장착 매체 | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine 현미경 슬라이드, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ 커버 안경: 사각형 | Fisherbrand | 12-545M | 치수: 24 mm x 60 mm |
| 추적 가능한 타이머 | VWR | ||
| 슬라이드 워머 | Barnstead International | 모델 번호 26025 | |
| 슬라이드 트레이 및 랙 | DWK Life Sciences | Rack은 20개의 슬라이드를 수용할 수 있습니다 | |
| Fisherbrand™ 일반용 초장용 펜치 | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | 킴벌리-클라크&트레이드; 프로페셔널 | ||
| 6인치 청교도 애플리케이터 | 하드우드 제품 회사, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® 면도날 | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware 또는 유리 용기, 조직학 액체용 | 16 + 1, 흐르는 물용 | ||
| 고프로필 코팅된 마이크로톰 블레이드 | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ 뚜껑이 있는 라운드 아이스 버킷, 4 L | Corning™ | ||
| 비커 | 또는 얼음물과 카세트를 담는 다른 용기 | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| 마이크로톰 | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV 겔 및 PCR 클린업 시스템 | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA 중합효소 | TaKaRa | 5 U/μ l | |
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| 울트라퓨어&트레이드; 아가로스 | Invitrogen™ | ||
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| 통계 분석 | |||
| R 소프트웨어 패키지 | |||
| 추가 분석 | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | 블루밍턴 초파리 재고 센터 | 59967 |
참고문헌
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure.....
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재인쇄 및 허가
