경두개 광학 화상 진찰은 온전한 두개골을 통해 살아있는 마우스의 피질에 있는 뇌척수액 수송의 광시야 화상 진찰을 허용합니다.
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방법 논문
형광 매크로법을 사용하여 그대로 마우스 두개골을 통해 뇌척수액 수송의 생체 내 이미징
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
설치류의 뇌척수액(CSF) 흐름은 주로 트레이서의 생체 내 정량화를 사용하여 연구되었습니다. 2 광자 현미경 검사법 및 자기 공명 화상 진찰과 같은 기술은 CSF 교류의 생체 내 정량화에서 가능하게 했습니다 그러나 감소된 화상 진찰 부피 및 낮은 공간 해상도에 의해 각각 제한됩니다. 최근 연구는 CSF가 설치류 피질의 pial 및 관통 동맥을 둘러싼 관통 공간의 네트워크를 통해 뇌 의 자렌치마를 입력 하는 것으로 나타났습니다. CSF의 이러한 관능적 진입은 림프계의 주요 동인이며, 독성 대사 용질(예를 들어, 아밀로이드 β)의 통관에 연루된 통로이다. 여기에서, 우리는 살아있는 마우스의 본래 두개골을 통해 형광 CSF 추적자의 실시간, mesoscopic 화상 진찰을 허용하는 새로운 거시적인 화상 진찰 기술을 설명합니다. 이 최소 침습 적 방법은 다양한 실험 설계를 용이하게하고 CSF 역학의 단일 또는 반복 테스트를 가능하게합니다. 대용량 자리는 높은 공간 및 시간 해상도를 가지고 있으며, 그들의 큰 갠트리 및 작업 거리는 행동 장치에서 작업을 수행하는 동안 이미징을 허용합니다. 이 화상 진찰 접근은 이 기술에서 얻은 2 광자 화상 진찰 및 형광 측정을 사용하여 전 생체 외 형광 및 무선 표지한 추적자의 정량화와 강하게 상관관계가 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 경두개 거시적인 화상 진찰이 살아있는 마우스에 있는 림프수송을 평가하기 위하여 이용될 수 있는 방법을 기술합니다, 더 비싼 화상 진찰 양식에 접근가능한 대안을 제안하.
서론
뇌척수액 (CSF)은 뇌와 척수를 목욕시키고 항상성을 유지하고 영양분을 공급하며 두개내 압력을 조절하는 데 관여합니다1. 지주막 공간에서 CSF는 피질 피질 동맥을 둘러싼 관통 공간 (PVS)의 네트워크를 통해 뇌로 들어간 다음 관통 하는 동맥을 따라 아래로 흐른다2. 일단 자중에서, CSF는 간질 액체 (ISF)와 교환하고, 낮은 저항성 백색 물질 관 및 perivenous 공간을 통해 뇌에서 아밀로이드 β (Aβ)및 타우 단백질 응집체와 같은 유해한 대사 산물을 운반2,3 . 이 통로는 astroglial aquaporin-4 (AQP4) 채널에 의존하고 따라서 신경교 림프 (glymphatic)시스템 4라고 불려왔다. 신경필의 노폐물은 궁극적으로 CSF-ISF로부터 두개골 신경 근처의 림프관과 자궁 경부 림프절쪽으로 수막에서 5. 이 시스템의 실패는 알츠하이머병 6,7,외상성 뇌 손상 3, 허혈성
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프로토콜
모든 실험은 로체스터 대학에서 동물 자원 대학위원회 (UCAR, 프로토콜 번호 2011-023)에 의해 승인되고 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 NIH 가이드에 따라 수행되었습니다.
1. 시스터나 마그나 캐뉼라, 헤드 플레이트 및 헤드 홀더 준비
- 수술 전에 모든 수술 기구와 머리 판을 살균하십시오.
참고: 형광 트레이서는 시스터나 마그나 캐너레이션을 통해 CSF로 직접 전달됩니다. 이 절차에 대한 자세한 지침은 Xavier 외9를 참조하십시오. - 간단히, 바늘 드라이버를 사용하여, 30G x 12.7 mm (1/2 인치) 바늘의 끝을 휴식, 아래로 방법의 3/4, 폴리에틸렌10 (PE10) 튜브 (약 45cm 길이)의 한쪽 끝에 바늘의 무딘 끝을 배치합니다. 경사만 PE10 튜브의 테두리 밖으로 튀어나오는지 확인합니다.
- 다른 30G 바늘의 경사진 끝의 1/4을 끊고 나머지 바늘의 무딘 끝을 PE10 튜브의 다른 쪽 끝에 놓고 플라스틱 루어 잠금 장치가 여전히 부착되어 있습니다.
- 멸균, 인공 CSF (aCSF: 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO 4, ....
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결과
CSF 유입은 뮤린 피질에 있는 CSF 추적자 수송의 mesoscopic 화상 진찰을 허용하는 epifluorescent 대식경 (그림1A)에심상합니다. 전체 두개골 머리 플레이트는 중앙에 있는 전두엽 및 정수리 뼈 둘 다, 및 interparietal 뼈의 rostral 부분 의 가시화를 허용합니다 (그림1B). 이미징 동안, 비전두, 시상, 관상 및 양두봉합사를 쉽게 식별할 수 있다(도1C). CM에 CSF 트레이서의 주입이 시작되면 (그림1D),트레이서 형광은 기저 시스터, olfactofrontal cistern, 및 송과석 오목 근처의 사분위수CSF의 큰 풀에서 처음 보입니다 (그림1E) ,왼쪽)을 참조하십시오. CSF 추적자.......
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토론
우리는 상업적으로 이용 가능한 형광 대식검 및 추적자를 사용하여 살아있는 마우스에 있는 경두개 CSF 화상 진찰을 능력을 발휘하기 위한 상세한 프로토콜을 기술했습니다. 이 기술은 간단하고 최소 침습적이지만 정량적입니다. 생체 내 이미징은 CM 전달 후 3H-dextran 및 14C-inulin을 포함한 무선 표지 추적자의 액체 섬광 계수 계수와 전 생체 코로나 섹션 정량화10과같은 민감한 방법과 잘 연관되어있습니다. 18. 2 광자 현미경 검사법을 가진 검증은 대식경의 밑에 피질 혈관을 따라 보인 CSF 추적자가 MCA와 그 가지10의perivascular 공간 안에 주로 위치한다는 것을 보여줍니다. 이러한 CSF 유입 경로는 림프계(19)의 중요한구성요소이다. 이 프로토콜에서 다루지 않더라도, 이들.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 신경 장애 및 뇌졸중의 국립 연구소와 노화에 국립 연구소에 의해 투자 되었다 (건강의 미국 국립 연구소; R01NS100366 및 RF1AG057575- MN, 우수 프로그램의 Fondation Leducq 대서양 횡단 네트워크, 그리고 EU 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램 (부여 번호 666881; SVDs@대상). 또한 그래픽 일러스트레이션에 대한 전문적인 도움을 주신 Dan Xue에게 도왔습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 부피바카인 HCl | 로체스터 대학교 Vivarium | ||
| 100 µ L 기밀 주사기 모델 1710 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81020 | |
| AM 시스템 치과 시멘트 분말 | Fisher Scientific | NC9991371 | |
| Carprofen | University of Rochester Vivarium | ||
| Chlorhexidine | Prevantics | B10800 | |
| CMOS 카메라 | Hammamatsu | ORCA 플래시 4.0 | |
| 헤드 플레이트 | 로체스터 대학교 | 카탈로그 없음 # | 로체스터 대학교 고온 |
| 소추 | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Insta-set 가속기 | Bob Smith Industries | BSI-151 | |
| 이소플루란 - Fluriso | Vet One | 502017 | University of Rochester Vivarium |
| Ketamine | Strong Memorial Hospital Pharmacy | ||
| Krazy Glue | Elmer's Products, Inc | 카탈로그 #, 댓글의 링크 참조 | |
| https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG Micropore Surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| 파라포름알데히드 | 시그마-알드리치 | P6148 | |
| PE10 - 폴리에틸렌 .011" x .024" per ft., 100 ft. 연속 | Braintree Scientific | PE10 100 FT | |
| 펌프 11 Elite 주입 전용 이중 주사기 | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| PURALUBE VET OINTMENT | Dechra | ||
| Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning | Sticks Fisher Scientific | 22-029-553 | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| 심플 헤드 홀더 플레이트(마우스용) | Narishige International USA Inc | MAG-1 | |
| 일회용 바늘, BD Medical | VWR | BD305106 | |
| 멸균 알코올 준비 패드 | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| 조정 가능한 LED | PRIOR 루멘 1600-LED | ||
| 자일라진 | 로체스터 대학교 Vivarium |
참고문헌
- Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations. Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).
- Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner's Guide. Neurochemi....
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재인쇄 및 허가
