CRISPR-Cas9 기술은 모든 세포 유형에서 포유류 게놈을 정밀하게 편집하는 효율적인 방법을 제공하며 게놈 전체의 유전 적 스크린을 수행하는 새로운 수단을 나타냅니다. 풀링된 게놈 전체 CRISPR-Cas9 스크린의 성공적인 성능을 위해 필요한 단계를 논의하는 상세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다.
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방법 논문
포유류 세포에 있는 풀린 CRISPR 기지를 둔 유전 스크린
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
CRISPR-Cas 시스템을 이용한 게놈 편집은 다양한 유기체의 게놈을 정밀하게 편집하는 능력을 크게 향상시켰습니다. 포유류 세포의 맥락에서, 이 기술은 기능적 유전체학 연구를 위한 게놈 전체 유전 스크린을 수행하는 새로운 수단을 나타낸다. 모든 개방된 판독 프레임을 대상으로 하는 가이드 RNA(sgRNA) 라이브러리는 특정 표현형에 대해 선별될 수 있는 단일 세포 풀에서 수천 개의 유전 적 교란을 생성하여 유전자 기능 및 세포 프로세스에 연루되도록 허용합니다. 편견과 체계적인 방법. CRISPR-Cas 스크린은 세포 표현형을 위한 유전 청사진을 밝히기 위하여 간단하고, 능률적이고, 저렴한 방법을 연구원에게 제공합니다. 게다가, 각종 세포주및 다른 암 모형에서 수행된 스크린의 차등 분석은 특정 항암 치료에 대한 잠재적인 표적을 드러내는 종양 세포에 문맥상 필수적인 유전자를 확인할 수 있습니다. 인간 세포에서 게놈 전체 스크린을 수행하는 것은 수천만 개의 세포를 처리하는 것을 포함하고 대량의 데이터 집합의 분석을 요구하기 때문에 어려울 수 있습니다. 세포주 특성화, CRISPR 라이브러리 고려 사항, 분석 중 CRISPR 기술의 한계와 기능 이해 와 같은 이러한 화면의 세부 사항은 종종 간과됩니다. 여기에 제공된 풀드게놈 전체 CRISPR-Cas9 기반 스크린의 성공적인 성능을 위한 상세한 프로토콜이 제공됩니다.
서론
CRISPR-Cas는 정기적으로 스패니싱된 짧은 팔린드로믹 반복 및 CRISPR 관련 뉴클레아제에 대한 짧은, 합성 가이드 RNA(sgRNA)와 복합체에서 단일 뉴클레아제 단백질(예를 들어, Cas9)으로 구성된다. 이 리보뉴클레오 단백질 복합체는 Cas9 효소를 표적으로 하여 특정 게놈 궤적1에서이중 가닥 DNA 분리를 유도합니다. 이중 가닥 휴식은 상동성 지시 수리 (HDR) 또는, 더 일반적으로, 비 상동성 끝 접합을 통해 복구 할 수 있습니다 (NHEJ), 삽입 및 / 또는 삭제 (INDELS)를 자주 중단하는 오류 경향이 수리 메커니즘 1. CRISPR의 효율성과 단순성은 이전의 게놈 편집 기술 [즉, 아연 손가락 뉴클레아제 (ZNF) 또는 전사 활성제 와 같은 이펙터 뉴클레아제 (nucleion)를 훨씬 능가하는 이전에 는 달성 할 수없는 수준의 게놈 표적화를 가능하게합니다. TALENS), 둘 다 높아진 설계 복잡성, 낮은 형질 감염 효율 및 멀티플렉스 유전자 편집의 한계로 고통받고있습니다 2].
CRISPR 단일 가이드 RNA 기반 게놈 편집의 기본 연구 응용 프로그램은 과학자들이 개별 유전자의 기능과....
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프로토콜
아래에 설명된 실험은 연구소의 환경 보건 및 안전 사무소 지침을 따라야 합니다.
1. 풀드 CRISPR sgRNA 렌티 바이러스 라이브러리 플라스미드 증폭
- 기성화된 CRISPR sgRNA 플라스미드 DNA 라이브러리를 TE(예: TKOv3)에서 50 ng/μL로 희석한다.
- 전기 적격 세포를 사용하여 라이브러리를 전기화합니다. 아래에 설명된 바와 같이 총 4개의 전기 화반응을 설정한다.
- 얼음에 미리 차가운 큐벳 (1.0 mm)에 해동 된 전기 유능한 세포의 25 μL에 50 ng / μL TKO 라이브러리 2 μL을 추가하십시오.
- 제조업체의 프로토콜에서 제안한 최적의 설정을 사용하는 전기분해기. 펄스의 10s 이내, 큐벳에 975 μL의 회수 매체 (또는 SOC 매체)를 추가하십시오.
- 배양 튜브에 전기 세포를 전달하고 회수 매체의 1 mL를 추가합니다. 37°C에서 1시간 동안 250 rpm에서 흔들리는 인큐베이터에서 튜브를 인큐베이터.
- 라이브러리를 적시하고 변환 효율을 추정하기 위해 희석 판을 설정합니다.
- 복구 된 세포의 모든 8 mL을 풀하고 잘 섞습니다. 풀된 세포의 10 μL을 800배 희석을 ....
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결과
게놈 스케일 CRISPR 스크리닝 워크플로우 개요
그림 1은 단일 통합 이벤트와 적절한 라이브러리 표현(일반적으로 200- 1000)을 보장하기 위해 낮은 MOI에서 CRISPR 라이브러리 렌티바이러스를 가진 표적 세포의 감염으로 시작하여 풀린 CRISPR 스크리닝 작업 흐름에 대한 개요를 보여줍니다. -접기). 감염 다음, 세포는 변환 된 세포를 선택하는 항생제 puromycin으로 치료됩니다. 선택 후, 기준선 T0 세포 펠릿은 스크리닝 시작 시 라이브러리 분포를 평가하기 위해 수집된다. 유전 섭동의 이기종 인구로 구성된 나머지 세포는 유전자 편집및 결과 효력이 명시하는 것을 허용하기 위하여 15-20 배동안 매 3-4 일마다 원하는 도서관 표현에서 통과됩니다. 약물 치료를 가.......
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토론
사용의 단순성과 높은 유연성으로 인해 CRISPR 기술은 정밀한 게놈 편집을 위한 도구로 널리 채택되었습니다. 풀린 CRISPR 스크리닝은 단일 실험에서 수천 개의 유전적 교란을 심문하는 방법을 제공합니다. 풀린 스크린에서, sgRNA 라이브러리는 각 순서가 고유하고 표적으로 한 유전자에 매핑되기 때문에 분자 바코드로 봉사합니다. 세포 집단으로부터 게놈 DNA를 분리함으로써, 관심표현형을 일으키는 유전자는 차세대 염기서열 분석에 의해 sgRNA 풍부를 정량화함으로써 결정될 수 있다. 대규모 병렬 시퀀싱 방법은 샘플에서 sgRNAs를 정량화하는 데 사용되며, 이는 여러 개의 독립적인 셀 채우기를 동일한 시퀀싱 레인으로 풀링하여 비용을 최소화할 수 있음을 의미합니다.
대규모 선별 프로젝트에 착수하기 전에 특성이 좋고 기술적으로 최적화된 모델을 가지고 있어야 합니다. 유전적 배경, 성장 속도 및 형질전환 효율은 스크리닝을 위해 세포주를 선택할 때 중요한 요소입니다. 예를 들어 성장률과.......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 일은 게놈 캐나다, 온타리오 연구 기금 및 건강 연구를 위한 캐나다 학회 (MOP-142375, PJT-148802)에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.22 미크론 필터 | |||
| 30° C 플레이트 인큐베이터 | |||
| 37° C 진탕 인큐베이터 | |||
| 37° C, 5% CO2 인큐베이터 | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE 버퍼 | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N 염산 용액 | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% 에탄올 | |||
| 알라마르 블루 | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| 블루라이트 트랜스일루미네이터 | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| 소 혈청 알부민, 열 충격 절연, 분획 V. 최소 98%, 생명공학 등급 | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco의 Eagles 변형 Medium | Life Technologies | 11995-065 | 셀 배양 매체 |
| Electroporation 큐벳 | BTX | 45-0134 | |
| Electroporator | BTX | 45-0651 | |
| Endura 전기 유능 셀 | Lucigen | 90293 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T 포장 셀 | ATCC | CRL-3216 | 권장 통과 번호 < 15 |
| 헥사디메스린 브로마이드(폴리브렌) | Sigma | H9268 | 형질도입 효율 향상을 위한 양이온 폴리머 |
| 헥사디메스린 브로마이드(폴리브렌) | |||
| LB 한천 플레이트, 카르베니실 | |||
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| Wizard genomic DNA purification kit | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 06 365 809 001 | 지질 기반 형질주입 시약 |
참고문헌
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
- Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. <....
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