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방법 논문

바이러스로부터 멀리 떨어진 고수율 세포 외 소포 제제의 정제

11.8K 조회수

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DOI:

10.3791/59876

⸱

2019년 9월 12일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Virology, School of Systems Biology, George Mason University, 2American Type Culture Collection (ATCC), 3ATCC Cell Systems, 4Ceres Nanosciences, Inc, 5Department of Immunology and Nano-medicine, Herbert Wertheim College of Medicine, Florida International University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 EV 강수량, 밀도 그라데이션 초원심분리 및 입자 포획을 통합하여 고효율 및 수율을 가진 비리온으로부터 세포외 소포(EV)를 분리하여 간소화된 워크플로우와 시동 감소를 허용합니다. 모든 EV 연구에서 사용할 수 있는 재현 가능한 준비를 할 수 있습니다.

초록

세포외 소포 (EV) 연구 오늘의 필드에 있는 중요한 장애물의 한은 바이러스성 감염 조정에 있는 정제한 EV 준비를 달성하는 기능입니다. 제시된 방법은 기존의 초원심분리 방법에 비해 더 높은 효율과 수율을 허용하는 비리온(즉, HIV-1)으로부터 EV를 분리하기 위한 것입니다. 당사의 프로토콜에는 EV 강수량, 밀도 구배 분리 및 입자 캡처의 세 단계가 포함되어 있습니다. 다운스트림 어세이(즉, 웨스턴 블롯 및 PCR)는 입자 캡처 직후에 실행할 수 있습니다. 이 방법은 최소한의 시작 볼륨을 사용할 수 있으므로 다른 절연 방법(즉, 초원심분리)보다 유리합니다. 또한, 여러 초원심분리 단계를 요구하는 대체 EV 절연 방법보다 사용자 친화적이다. 그러나, 제시된 방법은 우리의 입자로부터 손상되지 않은 EV를 용출하기 어렵기 때문에 기능적 EV 어종의 범위에 제한된다. 또한,이 방법은 엄격하게 연구 기반 설정으로 조정되며 상업적으로 실행 가능하지 않을 것입니다.

서론

세포외 소포(EV)를 중심으로 한 연구는, 특히 엑소좀, 30-120 nm에 이르는 EV의 일종이며, 3개의 테트라스파닌 마커 CD81, CD9 및 CD63의 존재를 특징으로 하며, 크게 분리하고 관심의 소포를 정화. 다각적 메커니즘을 해부하는 능력은 다양한 내용, 크기 및 다양한 경로를 통해 생성 된 소포의 이기종 집단으로 구성된 샘플을 생성하는 복잡하고 시간이 많이 소요되는 기술로 인해 방해되었습니다. 밀도. 이것은 거의 모든 EV 연구를 위한 문제점이있는 동안, 바이러스 감염의 맥락에서 EV를 공부할 때 특히 중요합니다, virions와 바이러스 같이 입자 (VLPs)는 관심있는 소포에 직경에서 유사할 수 있기 때문에. 예를 들면, 인간 면역 결핍 바이러스 타입-1 (HIV-1)는 대략 100 nm 직경이고, 이는 많은 유형의 EV와 거의 같은 크기입니다. 이러한 이유로 이러한 문제를 해결하기 위해 새로운 EV 격리 워크플로우를 설계했습니다.

EV 절연의 현재 골드 표준은 초원심분리입니다. 이 기술은 다양한 소포 밀도를 사용하여 소포를 각 단계 1,2에서저밀도 입자대 고밀도 입자의 차동 침전으로 원심 분리하여 분리 할 수 있게합니다. 몇 가지 저속 원심 분리 단계는 손상되지 않은 세포 (10 분 동안 300-400 x g), 세포 파편 (~ 2,000 x g 10 분), 및 세포 사멸 체 / 대형 소포 (~ 10 분 동안 10 분 동안 10 분)를 제거해야합니다. 이러한 초기 정화는 퇴적 전기 전기에 고속 초원심분리 (100,000-200,000 x g 1.5-2 시간)가 뒤따릅니다. 세척 단계는 EV 순도를 더욱 보장하기 위해 수행되지만, 이로 인해 절연 된 전기 EV의 수가 감소하여 총 수율 3,4가감소합니다. 이 방법의 유틸리티는 적절한 결과를 얻기 위해 많은 수의 셀(약 1 x 108)및 큰 샘플 부피(> 100 mL)의 요구 사항에 의해 더욱 제한됩니다.

증가하는 우려를 해결하기 위해 친수성 고분자를 사용한 소포의 침전은 최근 몇 년 동안 유용한 기술이 되었습니다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 기타 관련 침전 시약은 사용자가 단순히 선택의 시약으로 샘플을 배양하여 샘플 내에서 소포, 바이러스 및 단백질 또는 단백질 RNA 응집체를 당기고 단일 저속으로 당길 수 있게 합니다. 원심 분리1,2,5. 우리는 이전에 기존의 초원심분리에 비해 전기 를 침전시키는 PEG 또는 관련 방법의 사용이 상당히 높은 수율6을초래한다는 것을 보고했다. 이 전략은 빠르고 쉽고, 추가 고가의 장비가 필요하지 않으며, 쉽게 확장 가능하며, EV 구조를 유지합니다. 그러나, 이 방법의 난잡한 특성으로 인해, 생성된 샘플은 자유 단백질, 단백질 복합체, 다양한 EV 및 바이리온을 포함한 다양한 제품을 함유하고 있으므로 원하는집단을 얻기 위해 추가적인 정제가 요구된다 1 ,2,7,8.

다양한 강수 방법에서 얻은 전기 EV의 이질성을 극복하기 위해 밀도 그라데이션 초원심분리(DG)는 밀도에 따라 입자를 더 잘 분리하는 데 활용됩니다. 이 방법은 단백질, 단백질 복합체 및 바이러스 또는 바이러스 유사 입자(VLP)로부터 EV를 분리할 수 있는 이오디산놀 또는 수크로오스와 같은 밀도 구배 배지를 사용하여 단계별 구배를 사용하여 수행됩니다. 한때 DG가 EV 하위 모집단을 보다 정밀하게 분리할 수 있다고 생각되었지만 이제는 다양한 소포의 크기와 밀도가 겹칠 수 있다는 사실이 알려져 있습니다. 예를 들어, 엑소좀은 1.08-1.22 g/mL9의 부양 밀도를가지는 것으로 알려져 있으며, 골지(COPI+ 또는 클라트린+)에서분리된 소포는 1.05-1.12 g/mL의 밀도를 가지며 소포성 망막(COPII+ ) 1.18-1.25 g /mL1,2,3,4,9에서퇴적물 . 또한, 외형 분획을 바이러스 입자를 포함하는 분획과 비교하려는 경우 관심 바이러스의 밀도에 따라 HIV-1 이외의 바이러스가 동일하게 평형화될 수 있습니다. 외인성 양성 분획과 같은 밀도2.

마지막으로, 다운스트림 시각화 및 기능적 검정을 위한 EV 준비의 강화는 EV 연구에 매우 중요합니다. EV 농축 나노 입자, 특히 직경 700-800 nm범위의 다기능 하이드로겔 입자의 사용은 농축 된 EV 준비를 달성하는 데 중요한 단계입니다. 그들은 선택성을 촉진하기 위해 다공성 외부 체질 쉘에 의해 캡슐화 높은 친화력 방향족 미끼를 보유하고 있습니다. 이 연구에서 활용된 나노 입자에는 다양한 시약 및 바이오 유체에서 전기 자동차 포획을 증가시키는 것으로 나타난 다른 코어 미끼(반응성 Red 120 NT80 및 Cibacron Blue F3GA NT82)가 있는 두 가지 뚜렷한 제제가 포함됩니다(재료 표 참조) )6,10,11,12,13,14,15. 입자는 iodixanol 분획, 세포 배양 상급자 뿐만 아니라 플라즈마, 혈청, 뇌 척수액 (CSF) 및 소변6,13과 같은 환자 생체 유체를 포함한 수많은 시작 물질에서 전기 의 쉽게 농축을 제공합니다 .

여기에 제시된 방법은 여러 기술을 결합하여 현재 EV 정제 기술의 효율성을 향상시킵니다. EV 침전, 밀도 그라데이션 초원심분리 및 입자 캡처를 통해 워크플로우를 간소화하고, 시료 요구 사항을 줄이고, 수율을 증가하여 모든 EV 연구에 사용하기 위해 보다 균일한 EV 샘플을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 0.22 μm 여과 단계를 포함하기 때문에 바이러스 감염 시 EV 및 그 내용물을 조사하는 데 특히 유용하며 밀도에 따라 크고 원치 않는 소포 및 VLP를 배제하고 총 EV 집단을 효과적으로 분리하는 단계를 포함합니다. 비리온으로부터 전기를 분리합니다.

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프로토콜

1. 세포외 소포의 여과 및 강수량 (EV)

  1. 감염또는 형질감염된 세포(즉, 세포주 및/또는 1차 세포)로부터 배양을 상판화하기 위해, 37°C에서 5일간 후기 로그 세포의 약 10 mL을 배양하고 5%CO2를 적절한 배양 배지(즉, 10% 태아 소와 함께 RPMI 또는 DMEM)에서 배양한다. 혈청 [FBS]).
    참고: 모든 배양 배지 시약은 전기 TV가 없어야 하며, 90분 동안 100,000 x g의 혈청 을 사전 초원심분리하여 구입하거나(재료 표참조) 사내에서 제조할 수 있습니다. 이 프로토콜은 CEM, Jurkat, 293T, U937 (감염되지 않은 선), U1, J1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (HIV-1 및 HTLV-1 감염된 라인), 다발성 형질 감염 세포 및 원발성 골수성 및 T 세포 (둘 다)를 포함하여 일반적으로 사용되는 여러 세포 주에 성공했습니다. 감염 및 감염되지 않은); 그러나, 이 프로토콜은 전문화된 배지 또는 배양 조건을 필요로 하는 것을 포함하여 임의의 세포 유형에 사용될 수 있다. 세포의 밀도는 다른 세포 모형을 위해 최적화될 필요가 있을 수 있습니다. 가장 높은 밀도는 5 일 후에 최소한의 세포 사멸과 함께 사용하는 것이 좋습니다.
  2. 3,000 x g에서 배양한 것을 5분 동안 펠릿 세포에 대고 펠릿을 버린다.
  3. 멸균 0.22 μm 필터를 사용하여 배양 상급체를 걸러내고 깨끗한 튜브에서 여과액을 수집합니다.
  4. 여과 된 상구에 PEG 침전 시약 (1 :1 비율)의 동일한 볼륨을 추가합니다. 균일 한 혼합물을 보장하기 위해 튜브를 여러 번 반전.
    참고: 소용돌이를 하지 마십시오.
  5. 혼합물을 4 °C에서 밤새 배양하십시오 (O / N).
  6. 1,500 x g에서 실온(RT)에서 30분 동안 원심분리기 혼합물을 이질적인 EV 펠릿을 생성한다.
    참고: EV 펠릿은 흰색 또는 흰색으로 나타납니다.
  7. EV고갈된 문화를 폐기하십시오.
  8. 칼슘과 마그네슘(PBS)을 빼고 1x 인산완충식염수150-300 μL로 EV 펠릿을 다시 일시 중단하고 얼음위에 보관하십시오.

2. 밀도 그라데이션 의 건설

  1. 도 1A에도시된 바와 같이 별도의 미세원심지 튜브에서 1.2% 단위로 6~18% 이오디산올에서 11개의 상이한 1 mL 밀도 분획을 생성하기 위해 1x PBS와 이오디산놀 밀도 구배 배지를 혼합한다.
  2. 각 튜브를 혼합하는 소용돌이.
  3. 층 밀도 분획은 도 1B에도시된 바와 같이 #18 분획으로 시작하여 분획#6으로 끝나는 미리 세척되고 건식 스윙 버킷 초원심분리튜브로 한다.
    참고: 모든 튜브는 10% 표백제 스프레이를 사용하여 살균한 다음, 그라드 분획을 적재하기 전에 탈이온수로 3배 헹구고 멸균 탈이온수를 최종 세척해야 합니다.
  4. 초원심지 튜브의 층화된 그라데이션 상단에 재중단된 EV 펠릿(300 μL)을 추가합니다.
  5. 100,000 x g에서 4 °C에서 90 분 동안 초원심 분리기.
  6. 조심스럽게 초원심지 튜브에서 1 mL 분획을 제거하고 새로운 미세 원심 분리 튜브로 각 분획을 전송합니다.

3. EV 분획의 농축 은 나노 입자를 사용

  1. NT80, NT82 및 1x PBS의 동일한 볼륨을 사용하여 나노 입자의 30% 슬러리를 만듭니다.
    참고: 혼합물은 균질성을 보장하기 위해 사용하기 전에 소용돌이가 있어야합니다.
  2. 밀도 분획을 포함하는 각 마이크로 원심 분리기 튜브에 슬러리 30 μL을 추가하고 파이펫 / 그들을 여러 번 혼합합니다.
  3. 약 20 rpm에서 4 °C에서 EV 농축 나노 입자 함유 밀도 분획 미세 원심 분리튜브 O / N을 회전시킵니다.
  4. 원심 분리기 밀도 분획 마이크로 원심 분리튜브 20,000 x g에서 RT에서 5 분.
  5. 액체를 버리고 1x PBS로 EV 펠릿을 두 번 씻으십시오.
    참고: 나노입자 펠릿은 -20°C에서 동결되거나 다양한 다운스트림 분석법(즉, PCR, 웨스턴 블롯, 질량 분석법 및 기타 분석법)에 즉시 사용될 수 있다.

4. 다운스트림 어세이에 대한 나노 입자 펠릿의 권장 준비

  1. RNA 격리용
    1. 키트 제조업체의 프로토콜에 따라 0.2 μm 필터를 통해 여과된 0.001% 디에틸 파이로카보네이트(DEPC)로 처리된 오토클레이브 디이온화 수의 50 μL에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
  2. 젤 전기 동용
    1. 15 μL의 Laemmli 완충제에서 펠릿을 직접 다시 놓습니다.
    2. 95°C에서 3x 가열 시료를 3분간 소용돌이를 부드럽게 가열하고 각 열 주기 사이를 돌이킨다.
    3. 20,000 x g에서 15 s의 원심 분리기 샘플을 사용하여 모든 용출 된 재료를 젤에 직접 로드하십시오.
      참고: 최상의 결과를 얻으려면 젤에 로드된 입자의 양을 제한하고 젤을 100V로 실행하여 나머지 입자가 웰에 포함되어 있는지 확인합니다.
  3. 트립신 소화용
    1. 시료의 알킬화 및 트립시니화 전에 20 μL의 우레아에서 펠릿을 다시 중단시킴. 나노입자는 RT에서 10분 동안 14,000 x g 원심분리에 의해 펠렛될 수 있다.

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결과

PEG 강수량은 EV 수율을 증가
EV 절연에 대한 당사의 조합 접근 방식은 기존의 초원심분리에 비해 EV 회수 측면에서 훨씬 더 효율적이며, 필요한 출발 물질의 부피를 90% 감소시킴으로써 명백히 드러납니다. EV 절연의 현재 금 본위제인 초원심분리는 하류 분석에 적합한 EV 준비를 생성하기 위해 약 100 mL의 배양 상판이 필요하지만, 우리의 새로운 프로토콜은 10 mL만 필요합니다. 이러한 감소는 나노트래킹 분석(NTA)에 의해 측정된 바와 같이 EV 수율의 현저한 증가를 제공하는 PEG EV 침전 시약의 사용을 통해 가능하게 된다. 그림 2A의결과, 이전에 발표 된6,배양 상급 PEG 강수량의 10 mL를 사용할 때 7.27 x 1010 전기 의 회복을 초래한 것을 나타냅니다, 이는 약 500 배 이상이었다 초원...

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토론

설명된 방법을 통해 EV 수율을 높이고 격리에 대한 조합 접근 방식을 사용하여 EV에서 바이러스를 분리할 수 있습니다. 비교적 많은 양의 출발 물질(즉, 셀 상판)은 침전, DG 분리 및 나노입자 농축에 의해 EV 격리 이전에 여과될 수 있으며, 최종 부피인 ~30 μL로 다양한 종류의 즉각적인 사용을 가능하게 합니다. 다운스트림 아세이. 나노 입자 농축의 사용은 필수적이다, 기존의 초원심분리에 비해, 이러한 EV 농축 나노 입자는 더 효율적으로 소포를 캡처하는 것으로 나타났다, 배양 1 mL에서 소포의 양보다 크거나 동등한 산출 초원심분리배15의 10 mL에 비해상수체. 전반적으로, 기재된 프로토콜은 몇 가지 잘 알려진 기술의 조합을 포함하므로 제한된 어려움을 제시해야 한다. 그러나, EV 농축 나노 입자의 통합은 관심의 다운스트림 분석 또는 생물학적 목표에 따라 바람직한 결과를 달성하기 위해 문제 해결 및 / 또는 수정을 필요로 할 수있는 새로운 기술을 소개합니다. 우리는 나노 입자...

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공개 사항

B.L.은 이 문서에 사용된 시약 및/또는 기기를 생산하는 Ceres Nanosciences Inc.와 제휴하고 있습니다. 다른 모든 저자는 잠재적 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 글

우리는 카산치 연구소, 특히 그웬 콕스의 모든 구성원에게 감사드립니다. 이 작품은 국립 보건원 (NIH) 보조금 (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894 및 NS099029 F.K.)에 의해 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
CEM CD4+ 세포NIH AIDS 시약 프로그램117
CEM DPBS without Ca and Mg (1x)Quality Biological114-057-101
ExoMAX Opti-EnhancerSystems BiosciencesEXOMAX24A-1PEG 침전 시약
엑소좀 고갈 FBSThermo Fisher ScientificA2720801
Fetal Bovine Serum피크 혈청PS-FB3혈청
HIV-1 감염 U937 세포NIH AIDS 시약 프로그램165U1
Nalgene 주사기 필터 0.2 &마이크로; m SFCAThermo Scientific723-2520
나노트랩(NT80)Ceres NanosciencesCN1030반응성 레드 120
나노트랩(NT82)Ceres NanosciencesCN2010Cibacron Blue F3GA 코어
Optima XE-980 초원심분리기Beckman CoulterA94471
OptiPrep 밀도 구배 중간시그마-알드리치D1556-250mL요오딕사놀
SW 41 Ti 스윙 버킷 로터Beckman Coulter331362
울트라 클리어 튜브, 14mm x 89mmBeckman Coulter344059
코어

참고문헌

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