바이러스로부터 멀리 떨어진 고수율 세포 외 소포 제제의 정제

요약

이 프로토콜은 EV 강수량, 밀도 그라데이션 초원심분리 및 입자 포획을 통합하여 고효율 및 수율을 가진 비리온으로부터 세포외 소포(EV)를 분리하여 간소화된 워크플로우와 시동 감소를 허용합니다. 모든 EV 연구에서 사용할 수 있는 재현 가능한 준비를 할 수 있습니다.

초록

세포외 소포 (EV) 연구 오늘의 필드에 있는 중요한 장애물의 한은 바이러스성 감염 조정에 있는 정제한 EV 준비를 달성하는 기능입니다. 제시된 방법은 기존의 초원심분리 방법에 비해 더 높은 효율과 수율을 허용하는 비리온(즉, HIV-1)으로부터 EV를 분리하기 위한 것입니다. 당사의 프로토콜에는 EV 강수량, 밀도 구배 분리 및 입자 캡처의 세 단계가 포함되어 있습니다. 다운스트림 어세이(즉, 웨스턴 블롯 및 PCR)는 입자 캡처 직후에 실행할 수 있습니다. 이 방법은 최소한의 시작 볼륨을 사용할 수 있으므로 다른 절연 방법(즉, 초원심분리)보다 유리합니다. 또한, 여러 초원심분리 단계를 요구하는 대체 EV 절연 방법보다 사용자 친화적이다. 그러나, 제시된 방법은 우리의 입자로부터 손상되지 않은 EV를 용출하기 어렵기 때문에 기능적 EV 어종의 범위에 제한된다. 또한,이 방법은 엄격하게 연구 기반 설정으로 조정되며 상업적으로 실행 가능하지 않을 것입니다.

서론

세포외 소포(EV)를 중심으로 한 연구는, 특히 엑소좀, 30-120 nm에 이르는 EV의 일종이며, 3개의 테트라스파닌 마커 CD81, CD9 및 CD63의 존재를 특징으로 하며, 크게 분리하고 관심의 소포를 정화. 다각적 메커니즘을 해부하는 능력은 다양한 내용, 크기 및 다양한 경로를 통해 생성 된 소포의 이기종 집단으로 구성된 샘플을 생성하는 복잡하고 시간이 많이 소요되는 기술로 인해 방해되었습니다. 밀도. 이것은 거의 모든 EV 연구를 위한 문제점이있는 동안, 바이러스 감염의 맥락에서 EV를 공부할 때 특히 중요합니다, virions와 바이러스 같이 입자 (VLPs)는 관심있는 소포에 직경에서 유사할 수 있기 때문에. 예를 들면, 인간 면역 결핍 바이러스 타입-1 (HIV-1)는 대략 100 nm 직경이고, 이는 많은 유형의 EV와 거의 같은 크기입니다. 이러한 이유로 이러한 문제를 해결하기 위해 새로운 EV 격리 워크플로우를 설계했습니다.

EV 절연의 현재 골드 표준은 초원심분리입니다. 이 기술은 다양한 소포 밀도를 사용하여 소포를 각 단계 ^1,2에서저밀도 입자대 고밀도 입자의 차동 침전으로 원심 분리하여 분리 할 수 있게합니다.....

프로토콜

1. 세포외 소포의 여과 및 강수량 (EV)

1. 감염또는 형질감염된 세포(즉, 세포주 및/또는 1차 세포)로부터 배양을 상판화하기 위해, 37°C에서 5일간 후기 로그 세포의 약 10 mL을 배양하고 5%_CO2를 적절한 배양 배지(즉, 10% 태아 소와 함께 RPMI 또는 DMEM)에서 배양한다. 혈청 [FBS]).
   참고: 모든 배양 배지 시약은 전기 TV가 없어야 하며, 90분 동안 100,000 x g의 혈청 을 사전 초원심분리하여 구입하거나(재료 표참조) 사내에서 제조할 수 있습니다. 이 프로토콜은 CEM, Jurkat, 293T, U937 (감염되지 않은 선), U1, J1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (HIV-1 및 HTLV-1 감염된 라인), 다발성 형질 감염 세포 및 원발성 골수성 및 T 세포 (둘 다)를 포함하여 일반적으로 사용되는 여러 세포 주에 성공했습니다. 감염 및 감염되지 않은); 그러나, 이 프로토콜은 전문화된 배지 또는 배양 조건을 필요로 하는 것을 포함하여 임의의 세포 유형에 사용될 수 있다. 세포의 밀도는 다른 세포 모형을 위해 최적화될 필요가 있을 수 있습니다. 가장 높은 밀도는 5 일 후에 최소한의 세포 사멸과 함께 사용하는 것이 좋습....

결과

PEG 강수량은 EV 수율을 증가
EV 절연에 대한 당사의 조합 접근 방식은 기존의 초원심분리에 비해 EV 회수 측면에서 훨씬 더 효율적이며, 필요한 출발 물질의 부피를 90% 감소시킴으로써 명백히 드러납니다. EV 절연의 현재 금 본위제인 초원심분리는 하류 분석에 적합한 EV 준비를 생성하기 위해 약 100 mL의 배양 상판이 필요하지만, 우리의 새로운 프로토콜은 10 mL만 필요합니다. 이러한 감소는 나노트래킹 분석(NTA)에 의해 측정된 바와 같이 EV 수율의 현저한 증가를 제공하는 PEG EV 침전 시약의 사용을 통해 가능하게 된다. 그림 2A의결과, 이전에 발표 된^6,배양 상급 PEG 강수량의 10 mL를 사용할 때 7.27 x 10¹⁰ 전기 의 회복을 초래한 것을 나타냅니다, 이는 약 500 배 이상이었다 초원.......

토론

설명된 방법을 통해 EV 수율을 높이고 격리에 대한 조합 접근 방식을 사용하여 EV에서 바이러스를 분리할 수 있습니다. 비교적 많은 양의 출발 물질(즉, 셀 상판)은 침전, DG 분리 및 나노입자 농축에 의해 EV 격리 이전에 여과될 수 있으며, 최종 부피인 ~30 μL로 다양한 종류의 즉각적인 사용을 가능하게 합니다. 다운스트림 아세이. 나노 입자 농축의 사용은 필수적이다, 기존의 초원심분리에 비해, 이러한 EV 농축 나노 입자는 더 효율적으로 소포를 캡처하는 것으로 나타났다, 배양 1 mL에서 소포의 양보다 크거나 동등한 산출 초원심분리배15의 10 mL에 비해^상수체. 전반적으로, 기재된 프로토콜은 몇 가지 잘 알려진 기술의 조합을 포함하므로 제한된 어려움을 제시해야 한다. 그러나, EV 농축 나노 입자의 통합은 관심의 다운스트림 분석 또는 생물학적 목표에 따라 바람직한 결과를 달성하기 위해 문제 해결 및 / 또는 수정을 필요로 할 수있는 새로운 기술을 소개합니다. 우리는 나노 입자.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CEM CD4+ 세포	NIH AIDS 시약 프로그램	117
CEM DPBS without Ca and Mg (1x)	Quality Biological	114-057-101
ExoMAX Opti-Enhancer	Systems Biosciences	EXOMAX24A-1	PEG 침전 시약
엑소좀 고갈 FBS	Thermo Fisher Scientific	A2720801
Fetal Bovine Serum	피크 혈청	PS-FB3	혈청
HIV-1 감염 U937 세포	NIH AIDS 시약 프로그램	165	U1
Nalgene 주사기 필터 0.2 &마이크로; m SFCA	Thermo Scientific	723-2520
나노트랩(NT80)	Ceres Nanosciences	CN1030	반응성 레드 120
나노트랩(NT82)	Ceres Nanosciences	CN2010	Cibacron Blue F3GA 코어
Optima XE-980 초원심분리기	Beckman Coulter	A94471
OptiPrep 밀도 구배 중간	시그마-알드리치	D1556-250mL	요오딕사놀
SW 41 Ti 스윙 버킷 로터	Beckman Coulter	331362
울트라 클리어 튜브, 14mm x 89mm	Beckman Coulter	344059

코어